馮真真，錢 磊，趙 琳，霍劍鋒，倪 軍

中國人民解放軍陸軍第八十三集團(tuán)軍醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.血液內(nèi)分泌科，河南 新鄉(xiāng) 453000

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是臨床比較常見的內(nèi)分泌失調(diào)疾病，在疾病的發(fā)展過程中會出現(xiàn)各種不同程度的并發(fā)癥，糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)則是其中的一種。在國外的研究中發(fā)現(xiàn)[1]，T2DM患者普遍存在腸道菌群失衡的問題，且腸道菌群失衡模式主要表現(xiàn)為優(yōu)桿菌屬和產(chǎn)丁酸菌、羅斯菌的降低。我國在針對此情況調(diào)查時也發(fā)現(xiàn)了T2DM存在腸道菌群失衡的問題，但其失衡模式主要表現(xiàn)為產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌的下降和機(jī)會致病菌的上升[2]。相關(guān)研究指出，T2DM患者出現(xiàn)腸道菌群改變后出現(xiàn)了慢性炎癥的癥狀，進(jìn)而導(dǎo)致DKD的發(fā)生。DKD的發(fā)生率可達(dá)30%，比例相對較高，其患病后的生存周期僅為10年左右[3]。從相關(guān)研究中可發(fā)現(xiàn)，腸道菌群產(chǎn)物可通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)對腎臟功能產(chǎn)生影響[4]，并且DKD患者也出現(xiàn)了產(chǎn)短鏈脂肪酸細(xì)菌減少的情況。雖然T2DM患者和DKD患者均會出現(xiàn)菌群失調(diào)的情況，但其失衡程度以及相關(guān)性卻尚不清晰，因此，我們在本文中對T2DM和DKD患者進(jìn)行了研究，并針對二者的腸道菌群失衡狀態(tài)以及功能的變化進(jìn)行分析，具體研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料將2018年9月至2019年10月我院收治的T2DM和DKD患者作為研究對象，每組均納入30例，并設(shè)定其為T2DM組和DKD組，同時選取健康體檢者作為對照組，同樣納入30名。T2DM組患者年齡(61.5±2.6)歲(56～67歲)，男12例，女18例。DKD組患者年齡(62.3±2.8)歲(56～68歲)，男15例，女15例。對照組年齡(63.2±2.1)歲(56～70歲)，男15名，女15名。三組的一般資料相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可進(jìn)行組間對比。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的審批(審批號：83YY2022001LLSP)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集和處理：選用標(biāo)本為新鮮糞便標(biāo)本和血清標(biāo)本。血清標(biāo)本中的靜脈血白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的檢測方法為化學(xué)發(fā)光法，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)的檢測方法為免疫比濁法[5]。血液標(biāo)本采集樣本量為3 ml，將其使用無抗凝劑采血管保存，并以相對離心力1 000×g進(jìn)行離心，離心時間為10 min，將血清成功分離后保存于冰箱內(nèi)，環(huán)境為-80 ℃。糞便標(biāo)本的采集：T2DM組和DKD組患者在入院后的48 h內(nèi)采集新鮮糞便標(biāo)本，對照組則在體檢當(dāng)天進(jìn)行鮮糞便標(biāo)本的采集。糞便標(biāo)本處理方法[5]：取糞便的中心部分5～10 g，將其放入無菌EP管內(nèi)進(jìn)行保存，保存環(huán)境為-80 ℃。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用試劑盒均由恒瑞生物有限公司提供，操作時按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.2.2 16S rDNA-V4區(qū)DNA擴(kuò)增及測序：模板為糞便提取DNA，按照Qiagen試劑盒說明書(QiaAmp DNA Stool Mini Kit)，通過PCR對菌16S rDNA-V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[6]。擴(kuò)增體系為20 μl，模板為2 μl。操作步驟：94 ℃進(jìn)行預(yù)變性，時間為2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，將其保存在10 ℃環(huán)境下。反應(yīng)結(jié)束后，將純化物統(tǒng)一收集，按照操作樣品制備試劑盒(IlluminaTruseqTMDNA)說明書操作進(jìn)行測序準(zhǔn)備，測序平臺為Illumina高通量測序平臺，根據(jù)其質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對比測定結(jié)果，如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)以下菌門為主則代表實(shí)驗(yàn)質(zhì)量較好，具體為擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和厚壁菌門。

1.2.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測：使用Roche E601儀器和配套試劑檢測IL-6水平，使用SIEMENS BNP儀器和配套試劑檢測CRP。檢測時將質(zhì)量控制在允許誤差范圍內(nèi)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和菌群結(jié)構(gòu)分析：數(shù)據(jù)進(jìn)行原始序列處理[QIIME(v1.9.1)]，將處理后的數(shù)據(jù)與Greengenes(v13_8)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對照[7]，分析菌群結(jié)構(gòu)的多樣性。菌群α多樣性分析：應(yīng)用PD_whole_tree分析。采用LEfSe對三組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腸道菌群進(jìn)行比較。腸道菌群功能測定分析：采用PICRUSt宏基因組進(jìn)行16S rRNA的基因序列測定，觀察基因組功能[8]。將其與京都基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和京都基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比[9]，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 三組在門水平上菌群構(gòu)成情況三組腸道主要菌群構(gòu)成均為正常生理構(gòu)成，但疣微菌門和梭桿菌門所占比例相對較低(見表1)。

表1 三組在門水平上菌群構(gòu)成情況Tab 1 The composition of the flora at the phylum level in the 3 groups

2.2 T2DM組和DKD組患者腸道菌群α多樣性腸道菌群α多樣性對比顯示對照組較高，T2DM組和DKD組較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T2DM組與DKD組之間腸道菌群的α多樣性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖1A、1B和1C)。使用PCoA對三組之間以及T2DM組和DKD組的β多樣性變化進(jìn)行評價，圖1D、1E和1F中的每個點(diǎn)代表了一個樣品，點(diǎn)與點(diǎn)之間距離代表不同的菌群結(jié)構(gòu)，以腸道菌群是否出現(xiàn)偏差作為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，三組之間的腸道菌群差異出現(xiàn)了偏差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但T2DM組與DKD組之間則未出現(xiàn)偏差，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A～C圖為α多樣性，D～F圖為β多樣性。

2.3 T2DM與DKD患者腸道菌群一致的變化信號與疾病特異性失衡模式使用LEfSe對T2DM組、DKD組、對照組之間的腸道菌群變化特征進(jìn)行分析(見圖2)。T2DM組與DKD組變化存在大部分一致的情況(P<0.05)，共同特點(diǎn)為產(chǎn)丁酸菌數(shù)量的降低，同時兩組均出現(xiàn)了腸道菌群失衡模式，但T2DM以擬桿菌屬增多為主要特點(diǎn)，DKD組則以乳桿菌屬、史雷克菌屬、厭氧棒狀菌屬和腸球菌屬增多為主要特點(diǎn)。從門上來看，T2DM組和DKD組的藍(lán)藻細(xì)菌門和厚壁菌門明顯減少，從屬上看，主要表現(xiàn)為丁酸菌豐度下降，比較明顯的包括以下4種：① 柔嫩梭菌屬；② 糞球菌屬；③ 毛螺旋菌屬；④ 羅斯菌屬，以上4種菌屬在T2DM患者和DKD患者的腸道中數(shù)量明顯降低(P<0.05)。從變化信號上來看，雖然T2DM組和DKD組存在一定的一致性，但二者同時也存在一定的特異性，其中T2DM組特點(diǎn)為以下菌增加：① 擬桿菌屬；② 動球菌科；③ 明串珠菌科；④ 擬桿菌科；⑤ 梭菌科，同時奇異菌屬和多爾氏菌屬則體現(xiàn)為明顯下降(P<0.05)。DKD組患者的菌群失調(diào)模式特點(diǎn)如下：以下菌屬和科明顯增多，屬水平：① 發(fā)酵乳桿菌屬；② 嗜血桿菌屬；③ 史雷克氏菌屬；④ 厭氧棍狀菌屬；⑤ 腸球菌屬；科水平：① 紅蝽菌科；② 腸球菌科；③ 互養(yǎng)菌科；④ 韋榮菌科；⑤ 乳桿菌科，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；門水平：DKD患者中互養(yǎng)菌門顯著增多(P<0.05)(見圖2)。

2.4 T2DM組和DKD組患者腸道菌群功能變化通過PICRUSt對T2DM組和DKD組腸道菌群功能進(jìn)行預(yù)測，并與KEGG數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，相對于對照組來講，T2DM組和DKD組呈明顯的一致性，尤其腸道中一些菌群的功能顯著增強(qiáng)(P<0.05)，例如萘降解、鏈霉素生物合成、核苷糖代謝、氨基糖代謝、谷胱甘肽代謝以及蛋白質(zhì)折疊。在一些功能上則呈顯著降低，具體包括：① 甘油磷酸酯代謝；② 細(xì)菌趨藥性；③ 信號傳導(dǎo)機(jī)制；④ 細(xì)胞骨架蛋白；⑤ 孢子形成；⑥ 泛酸鹽形成；⑦ 輔酶A生物合成。

DKD組患者在以下代謝功能上更好(P<0.05)，具體包括：① 脂多糖生物合成；② 三羧酸循環(huán)；③ 糖基轉(zhuǎn)移酶；④ 糖異生；⑤ 鞘糖脂生物合成；⑥ 三羧酸循環(huán)；⑦ 糖基轉(zhuǎn)移酶代謝；⑧ 細(xì)菌毒素降解；⑨ 色氨酸代謝；⑩ 纈氨酸亮氨酸代謝；霍亂弧菌感染；磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；無機(jī)物的運(yùn)輸和代謝；聚糖生物合成；金黃色葡萄球菌感染；丙酸代謝；細(xì)胞運(yùn)動和分泌；脂多糖生物合成蛋白；抗壞血酸；香葉醇代謝功能。

在以下代謝功能上則相對較差(P<0.05)，具體包括：① 硫胺素代謝；② 賴氨酸生物合成；③ 卟啉代謝；④ RNA轉(zhuǎn)運(yùn)；⑤ 苯丙氨酸生物合成；⑥ 酪氨酸生物合成；⑦ 甲烷代謝功能；⑧ 鈣信號通路；⑨ 色氨酸生物合成功能。

注：藍(lán)色為對照組，紅色為T2DM組，綠色為DKD組。

3 討論

本文針對T2DM和DKD患者的腸道菌群情況進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種患者的腸道菌群與健康人群相比，其α多樣性指數(shù)相對較低，此研究結(jié)果與相關(guān)學(xué)者的研究觀點(diǎn)一致[10]。本研究也受地域的影響，不同地域的飲食結(jié)構(gòu)存在一定的差異，因此，代謝類疾病的腸道菌群失衡模式可能存在一定的差異。但大多數(shù)研究均顯示擬桿菌門所占比例呈上升狀態(tài)[11-13]，而厚壁菌門所占比例則呈下降狀態(tài)。在本研究中顯示，對照組與T2DM組和DKD組之間的腸道菌群結(jié)構(gòu)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從研究數(shù)據(jù)中可發(fā)現(xiàn)厚壁菌門/擬桿菌門的比例上存在不同，但其比例的不同并不影響整體結(jié)構(gòu)。其主要原因可能是兩組患者僅在厚壁菌門/擬桿菌門比例上存在差異，其余變化均比較一致，例如在門水平上，兩組患者均顯示為藍(lán)藻細(xì)菌門和厚壁菌門減少，在門水平上，則以厚壁菌門和藍(lán)藻細(xì)菌門數(shù)量較低為特點(diǎn)。從相關(guān)學(xué)者的研究中也可發(fā)現(xiàn)[14]，在T2DM患者腸道中出現(xiàn)了梭菌減少和乳酸桿菌富集的情況，有學(xué)者也指出[15]，T2DM患者的腸道中產(chǎn)生柔嫩梭菌屬、羅斯菌等丁酸鹽細(xì)菌的減少，而像多枝梭菌、糞擬桿菌、大腸埃希菌以及遲緩埃格特菌等致病菌則會顯著增加。有學(xué)者指出[16]，羅斯菌定值和高植物多糖飲食會增加腸道內(nèi)丁酸的水平，并降低主動脈的炎癥因子的水平，在一定程度上減小動脈粥樣硬化斑塊的體積。

腸道菌群功能變化方面來看，結(jié)果顯示，T2DM組與DKD組患者腸道的功能變化存在一致性，其一致性主要表現(xiàn)在以下兩方面：一方面為相關(guān)菌群功能的增強(qiáng)，例如萘降解、鏈霉素生物合成、核苷糖代謝、氨基糖代謝、谷胱甘肽代謝以及蛋白質(zhì)折疊等。另一方面為相關(guān)菌群功能的降低，主要表現(xiàn)在7種菌群的變化：① 甘油磷酸酯代謝；② 細(xì)菌趨藥性；③ 信號傳導(dǎo)機(jī)制；④ 細(xì)胞骨架蛋白；⑤ 孢子形成；⑥ 泛酸鹽形成；⑦ 輔酶A生物合成。從兩方面的變化體現(xiàn)了T2DM和DKD患者腸道菌群功能變化存在一致性，從此結(jié)果也可發(fā)現(xiàn)DKD患者的菌群變化和糖尿病患者出現(xiàn)了同樣的菌群變化形式，只是在DKD患者中又出現(xiàn)了個別菌群的紊亂，例如腸球菌和棒狀桿菌的升高，此觀點(diǎn)與既往研究[17]結(jié)果相一致，即兩種菌在慢性腎病患者腸道中呈高表達(dá)水平，并且進(jìn)行糞菌移植后的小鼠出現(xiàn)了腎功能損傷。此結(jié)果顯示了DKD患者菌群變化是在T2DM基礎(chǔ)上發(fā)生了其他關(guān)鍵特征性變化的，同時也加速了DKD的發(fā)展。

綜上所述，T2DM和DKD患者在腸道菌群失衡方面的變化比較一致，均表現(xiàn)為丁酸菌的減少，但同時也存在一定的特異性變化，從腸道菌群功能變化方面來看二者變化呈多數(shù)一致狀態(tài)。