朱曉鋒，蔡淑琳，蘇卓文，張殿朋，宋 博，徐兵強(qiáng)，阿布都克尤木·卡德?tīng)?，?森

(1.農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/特色林果產(chǎn)業(yè)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097)

0 引 言

【研究意義】小蠹蟲(chóng)與真菌伴生(共生)是長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，二者所形成的關(guān)系是眾多共生體系中的典型代表之一[1]。在植物-小蠹蟲(chóng)-伴生菌系統(tǒng)中，小蠹蟲(chóng)與伴生菌形成了依賴性和穩(wěn)定性的關(guān)系：一方面小蠹蟲(chóng)作為媒介傳播、擴(kuò)散伴生菌，實(shí)現(xiàn)伴生菌在寄主樹(shù)體內(nèi)入侵和繁殖；另一方面小蠹蟲(chóng)依賴伴生菌克服寄主樹(shù)木抗性，實(shí)現(xiàn)小蠹蟲(chóng)在寄主樹(shù)木上有效定殖。伴生菌可導(dǎo)致寄主樹(shù)木韌皮部中脂類物質(zhì)的增加，改變韌皮部中樹(shù)脂含量和愈傷組織的產(chǎn)生，決定小蠹蟲(chóng)能否成功定殖；伴生菌在削弱寄主樹(shù)木抗性、協(xié)助小蠹蟲(chóng)侵害寄主方面起著重要作用[2, 3]。研究小蠹蟲(chóng)與其伴生菌的相互關(guān)系已成為系統(tǒng)研究小蠹蟲(chóng)綜合控制策略與技術(shù)的重要組成部分[4, 5]。臍腹小蠹ScolytusschevyrewiSemenov(又名多毛小蠹ScolytusseulensisMurayama)記錄于新疆天山東部[6]。臍腹小蠹是新疆果樹(shù)特別是杏ArmeniacavulgarisLam.、西梅PrunusdomesticaL.、桃AmygdaluspersicaL.和扁桃(巴旦木)AmygdaluscommunisL.等薔薇科果樹(shù)的重大害蟲(chóng)，常造成果樹(shù)枝、株的大量死亡[7-9]。【本研究切入點(diǎn)】近年來(lái)在新疆臍腹小蠹仍然普遍為害，并未有減輕的趨勢(shì)。亟需研究新疆南部地區(qū)果園臍腹小蠹伴生真菌種類，分析其功能?！緮M解決的關(guān)鍵性問(wèn)題】在新疆疏勒、英吉沙等地采集被害果樹(shù)上的臍腹小蠹成蟲(chóng)，利用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)和室內(nèi)分離培養(yǎng)的方法，鑒定其伴生真菌種類或類群，研究新疆果樹(shù)臍腹小蠹是否攜帶、傳播植物病原性真菌，為新疆果樹(shù)臍腹小蠹的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

在新疆南部地區(qū)疏勒、疏附、英吉沙、阿克陶縣的杏、桃、扁桃、西梅等果園，每個(gè)果園隨機(jī)選擇3個(gè)采樣點(diǎn)，每采樣點(diǎn)隨機(jī)選擇被臍腹小蠹為害的枝干(長(zhǎng)40～50 cm，直徑7～10 cm)1～2枝，帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)(25 ± 2)℃飼養(yǎng)，直至成蟲(chóng)羽化。表1

表1 樣品采集地信息

體表伴生真菌樣品制備：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，取從不同果樹(shù)枝干羽化的健康成蟲(chóng)5 頭，分別放入含有5 mL滅菌水的無(wú)菌試管中，蓋緊瓶蓋后，放在振蕩器上劇烈震蕩5～10 min，靜置后取上清液3 mL備用，重復(fù)3次。

腸道伴生真菌樣品制備：取從不同果樹(shù)枝干羽化的健康成蟲(chóng)5頭，分別放入75%的酒精中滅菌1 min，再用蒸餾水沖洗 3 次。立即在無(wú)菌條件下解剖，取出腸道，放在含有5 mL的滅菌水的無(wú)菌試管中，蓋緊瓶蓋后，放在振蕩器上劇烈震蕩5～10 min，靜置后取上清液3 mL備用，重復(fù)3次。

1.2 方 法

1.2.1 樣品總DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)對(duì)4種果樹(shù)臍腹小蠹體表與腸道伴生真菌樣品的 DNA進(jìn)行提取，并重復(fù)3次。利用 NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)DNA 濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用真菌引物ITS1 F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和 ITS2 R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)；對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，循環(huán)數(shù)(35個(gè))×(95℃變性30s，55℃退火30s, 72℃延伸45s)，最后72℃延伸10 min(PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型)。再用 2%瓊脂糖凝膠回收 PCR 產(chǎn)物，利用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù) Illumina MiSeq 平臺(tái)(Illumina,San Diego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建 PE 2×300 的文庫(kù)。

構(gòu)建文庫(kù)步驟:(1)連接“Y”字形接頭；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用 PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；(4)氫氧化鈉變性, 產(chǎn)生單鏈 DNA 片段。最后用 Illumina 公司的 Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 室內(nèi)伴生真菌的分離與鑒定

1.2.2.1 培養(yǎng)基制備

試驗(yàn)所需各種培養(yǎng)基如下：酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、牛肉膏培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.2.2.2 伴生真菌的分離與純化

在超凈工作臺(tái)上，分別取50 μL 體表和腸道伴生真菌樣品均勻涂布在各種培養(yǎng)基上，并重復(fù) 3 次。體表伴生真菌分離平板直接放在室溫25 ℃條件下，腸道伴生真菌分離平板放入密封培養(yǎng)盒中(盒內(nèi)分別放入微需氧產(chǎn)氣袋和厭氧產(chǎn)氣袋)再放在室溫條件下，培養(yǎng)48～72 h，待有菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落純化培養(yǎng)。并參考《真菌鑒定手冊(cè)》等進(jìn)行伴生真菌形態(tài)特征鑒定[10]。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

將分離純化的伴生真菌，通過(guò)菌落特征，初步分類后，對(duì)5.8S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物采用ITS1 : 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4 : 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；基因組提取用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN，T50)試劑盒按照說(shuō)明進(jìn)行提?。籔CR儀器為BIO-Rad(MyCycler)，PCR 程序如下所述：

序列擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：基因組模板2.0 μL、10 × PCR buffer(mg2+free)2.5 μL、dNTP(2.5 mM each)1.0 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、EXTaq(2.5 u/μL)0.5 μL、ddH2O 18.0 μL，共25 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；然后 94℃保持60 s，55℃保持45 s，72℃保持60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃保持10 min，1個(gè)循環(huán)；4℃保溫。

PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序：將PCR產(chǎn)物放在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為1 × TAE。電泳結(jié)束后將凝膠于10 μg/μL溴化乙淀中染色15～20 min，于Alpha凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果，然后將反應(yīng)體系送至北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的菌株序列在NCBI網(wǎng)址https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignmentsearch Tool)比對(duì)，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)特征，對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定分類。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用 Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用 FLASH 軟件進(jìn)行拼接：(1)設(shè)置 50 bp 的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于 20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于 50 bp 的序列；(2)barcode 需精確匹配，引物允許 2 個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除模糊堿基；(3)根據(jù)重疊堿基 overlap 將兩端序列進(jìn)行拼接，overlap 需大于 10 bp。去除無(wú)法拼接的序列。使用的 UPARSE 軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù) 97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行 OTU 聚類；使用 UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用 RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì) Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)，設(shè)置比對(duì)閾值為 70%。基于 OTU 計(jì)算稀釋曲線、群落豐富度指數(shù)(Chao1、ACE)和群落多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)等。高通量測(cè)序結(jié)果采用 FUNGuild v1.0 軟件分析真菌功能分類。將獲得 OTU 上傳到 FUNGuild 分析平臺(tái)(http://www.funguild.org/)進(jìn)行分析；下載運(yùn)行結(jié)果后對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 伴生真菌多樣性

研究表明，臍腹小蠹腸道真菌的OTU數(shù)量、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于體表，各項(xiàng)指數(shù)均未達(dá)顯著性差異(P<0.05)，果樹(shù)臍腹小蠹腸道伴生菌多樣性略高于體表，但未達(dá)到顯著性差異。表2

表2 臍腹小蠹伴生菌Alpha多樣性指數(shù)

2.2 伴生真菌群落組成

研究表明，臍腹小蠹體表、腸道伴生真菌主要由7個(gè)門(mén)、24個(gè)綱、66個(gè)目、124個(gè)科的221個(gè)屬組成；其中腸道優(yōu)勢(shì)菌群為Geosmithia、Pleosporales和Gibellulopsis，在群落組成中的占比分別為42.14%、15.61%和6.97%；體表優(yōu)勢(shì)菌群為Geosmithia、Saccharomycetales、Byssochlamys和Wickerhamomyces占比分別為29.55%、19.50%、8.20%和6.07%。表3，圖1

表3 臍腹小蠹體伴生真菌群落組成

注：a腸道，b體表

2.3 伴生真菌FUNGuild 功能預(yù)測(cè)

研究表明，臍腹小蠹伴生真菌營(yíng)養(yǎng)型組成較為相似，以腐生營(yíng)養(yǎng)型(saprotroph)、植物致病型(plant pathogen)、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型(pathotroph-saprotroph)和動(dòng)物致病型(animal pathogen)為主；在伴生菌群落中，腐生營(yíng)養(yǎng)型和病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型的真菌比例較高，其中未定義的腐生真菌比例最高，在體表和腸道中分別占71.57%和50.46%；其次是功能未知的真菌，在體表中占8.60%，在腸道中占21.35%；而體表攜帶植物致病真菌的比例為6.25%，腸道為9.92%；動(dòng)物致病真菌在體表和腸道中的比例分別為0.31%和0.65%(圖2a)；在為害不同果樹(shù)的臍腹小蠹伴生菌中，仍以腐生營(yíng)養(yǎng)型和病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型的真菌為主，其中未定義的腐生真菌占比較高，在為害西梅樹(shù)、杏樹(shù)、桃樹(shù)和扁桃樹(shù)的臍腹小蠹攜帶比例依次降低，分別為71.86%、65.95%、54.85%和42.86%；此外，為害4種果樹(shù)的臍腹小蠹均攜帶植物致病真菌，其中為害桃樹(shù)的臍腹小蠹攜帶植物致病真菌比例最高，為19.06%，其次是為害杏樹(shù)的臍腹小蠹，占9.46%，再次是扁桃和西梅，分別為3.25%和1.58%；而為害桃樹(shù)、杏樹(shù)和西梅的臍腹小蠹攜帶有動(dòng)物致病真菌，分別占1.28%、0.56%和0.10%(圖2b)。圖2

注：CD：腸道，TB：體表，B：扁桃樹(shù)，M：西梅樹(shù)，T：桃樹(shù)，X：杏樹(shù)

2.4 室內(nèi)伴生真菌的分離與鑒定

研究表明，為臍腹小蠹伴生真菌分別為10個(gè)屬的13種真菌，分別為新疆假絲酵母(Candidaxinjiangensis)、Candidapeoriensis、漢姆酵母(Wickerhamomycessilvicola)、威克漢姆西弗酵母(Wickerhamomycesciferrii)、季也蒙畢赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)、膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、Yamadazymamexicana、Naganishiaalbida、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)、Geosmithiapallida和大孢枝孢菌(Cladosporiummacrocarpum)，以及假絲酵母1種(疑似新種)(Candidasp.)和擬青霉1種(Paecilomycessp.)；臍腹小蠹體表伴生真菌有12種，腸道伴生真菌有8種。表3

2.5 室內(nèi)鑒定的伴生真菌功能

研究表明，在已鑒定臍腹小蠹伴生真菌中，7種伴生真菌有相關(guān)功能報(bào)道，根據(jù)已報(bào)道相關(guān)功能，可分為2類，一類為植物致病真菌，有Y.mexicana、G.pallida和大孢枝孢菌；另一類為有益菌，對(duì)多種植物病原菌有殺菌、抑制或拮抗作用，有漢姆酵母、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母和出芽短梗霉菌；而C.xinjiangensis、C.peoriensis、威克漢姆西弗酵母和N.albida4種真菌無(wú)相關(guān)功能的報(bào)道。表4

表4 臍腹小蠹伴生真菌的分離與鑒定

3 討 論

昆蟲(chóng)共生菌主要有以下幾方面的功能：一是營(yíng)養(yǎng)和物質(zhì)代謝功能；二是影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育；三是影響昆蟲(chóng)行為；四是保護(hù)昆蟲(chóng)的作用[43]。通過(guò)對(duì)杏、扁桃、桃、西梅等果樹(shù)臍腹小蠹伴生真菌的高通量測(cè)序和FUNGuild功能預(yù)測(cè)可以看出臍腹小蠹伴生有大量的真菌，且營(yíng)養(yǎng)型豐富，含有腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌、植物致病型真菌、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌和動(dòng)物致病型真菌；此外通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)鑒定和功能分析伴生真菌中既有植物致病真菌又有對(duì)植物病原菌有殺菌、抑制或拮抗作用的生防有益菌，與FUNGuild功能預(yù)測(cè)結(jié)果具有一定的一致性。臍腹小蠹伴生菌是一個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)，作者認(rèn)為這些伴生菌在臍腹小蠹寄主定殖過(guò)程中起著重要的協(xié)同作用。如植物致病真菌(如G.pallida、Y.mexicana和大孢枝孢菌等)被臍腹小蠹普遍攜帶并傳播，為臍腹小蠹為害和克服寄主抗性提供有利條件。而一些有益菌(如W.silvicola、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母、出芽短梗霉菌對(duì)臍腹小蠹的為害起抑制作用。

酵母菌也是小蠹蟲(chóng)常見(jiàn)的伴生菌，大多數(shù)小蠹蟲(chóng)個(gè)體僅伴生一種或少量幾種，并且存在于小蠹蟲(chóng)的所有生命階段，也存在于卵室、蛹室、幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)消化道以及寄主韌皮部和木質(zhì)部組織中；伴生酵母菌產(chǎn)生的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)具有廣泛的生物活性，低濃度下可吸引小蠹蟲(chóng)，高濃度有驅(qū)避作用，其揮發(fā)物也可以作為捕食性和寄生性天敵搜尋小蠹蟲(chóng)的重要物質(zhì)；伴生酵母菌還可以改變樹(shù)體組織的化學(xué)成分或代謝有毒的萜類化合物，因此，伴生酵母菌對(duì)小蠹蟲(chóng)可能具有調(diào)節(jié)種間競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生信息素、分解植物有毒物質(zhì)、提供營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的作用[44，45]。如伴生酵母菌Ogataeapini產(chǎn)生的揮發(fā)物可顯著促進(jìn)西松大小蠹Dendroctonusbrevicomis互惠共生菌Entomocorticiumsp.B的生長(zhǎng)，抑制其病原菌Beauvariabassiana的生長(zhǎng)，并能參與到寄主植物組織中對(duì)萜類揮發(fā)物的反應(yīng)之中，改變韌皮部組織的化學(xué)環(huán)境，產(chǎn)生乙醇，二硫化碳(CS2)和Δ-3-蒈烯(對(duì)小蠹蟲(chóng)具有引誘作用)[45，46]。在研究中在新疆果樹(shù)臍腹小蠹伴生菌多種酵母菌，如新疆假絲酵母、漢姆酵母、威克漢姆西弗酵母、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母、Y.mexicana和C.peoriensis。其中，Y.mexicana為植物致病真菌，而漢姆酵母、季也蒙畢赤酵母、膠紅酵母為多種致病菌的拮抗菌或生防菌，此外，新疆假絲酵母、C.peoriensis和威克漢姆西弗酵母其生態(tài)學(xué)功能未見(jiàn)報(bào)道，其中新疆假絲酵母為新疆果樹(shù)臍腹小蠹伴生真菌報(bào)道之新種。進(jìn)一步研究臍腹小蠹伴生酵母等真菌的生物、生態(tài)學(xué)功能，對(duì)進(jìn)步一揭示臍腹小蠹的發(fā)生為害和綜合治理具有重要意義。

表5 已鑒定果樹(shù)臍腹小蠹伴生真菌功能分析

4 結(jié) 論

新疆南部地區(qū)果園臍腹小蠹伴生真菌落是一個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)，主要有腐生營(yíng)養(yǎng)型、植物致病型、病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型和動(dòng)物致病型真菌組成，且不同果園臍腹小蠹均攜帶植物致病真菌，其中為害桃樹(shù)的臍腹小蠹攜帶比例最高，為19.06%；室內(nèi)鑒定出植物致病真菌3種、有益拮抗真菌4種。新疆果樹(shù)臍腹小蠹普遍攜帶、傳播植物病原菌，在防控臍腹小蠹的同時(shí)應(yīng)注重果樹(shù)枝干病害的防控；而伴生真菌中的有益拮抗菌可作為生物防治菌被開(kāi)發(fā)利用。