鄭炳言，李威鋒，羅福廣，王志強，李艷和

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學(xué)示范中心，武漢 430070；2.廣西柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 柳州 545006）

近年來，廣西壯族自治區(qū)柳州市的“網(wǎng)紅美食”螺螄粉暴紅，螺螄粉的熱潮瞬間席卷了全國各地。螺螄粉食品產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展也進一步帶動了其上游產(chǎn)業(yè)螺螄養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。然而在螺螄養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展的同時，還存在一定的問題，如大規(guī)模螺螄養(yǎng)殖少、養(yǎng)殖技術(shù)條件落后、養(yǎng)殖戶思想觀念跟不上等［1］，導(dǎo)致螺螄出現(xiàn)供不應(yīng)求、質(zhì)量低等現(xiàn)象。而螺螄產(chǎn)量與質(zhì)量一般會受其養(yǎng)殖環(huán)境的影響，如何改善螺螄養(yǎng)殖環(huán)境受到養(yǎng)殖戶們的高度重視。螺螄是一種底棲動物，其生命活動與土壤有著直接的聯(lián)系，所以改善土壤的環(huán)境能夠直接地影響到螺螄的生長狀態(tài)［2］。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中一個重要的組成部分，作為分解者，微生物參與了生態(tài)系統(tǒng)中的能量流動和物質(zhì)循環(huán)關(guān)鍵的一環(huán)，其生命活動也影響了土壤的肥力和生產(chǎn)力［3，4］。土壤中細菌可以將一些有毒害作用的物質(zhì)轉(zhuǎn)為含氮有機質(zhì)等有用物質(zhì)，同時將一些不可利用的物質(zhì)分解為可利用物質(zhì)等［5，6］。土壤中的放線菌和真菌可以分解纖維素、木質(zhì)素和果膠等物質(zhì)，分解的產(chǎn)物同樣也參與到土壤的物質(zhì)循環(huán)中。放線菌和真菌的大量菌絲也可以松動土壤改善土壤的性質(zhì)和土壤里的氧氣環(huán)境，促進植物根系對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收［7］。土壤中的微生物對土壤環(huán)境的變化尤為敏感，所以其數(shù)量變化可以直觀地反映土壤環(huán)境和理化性質(zhì)的改變。但是目前有關(guān)螺螄養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的研究不夠充分，了解螺螄養(yǎng)殖稻田底泥微生物的數(shù)量變化和群落結(jié)構(gòu)，對實際生產(chǎn)中掌握底泥生產(chǎn)力和肥力以及養(yǎng)殖動物的產(chǎn)量有著重要的意義。

本研究利用稀釋涂布平板法調(diào)查分析了養(yǎng)殖螺螄稻田在施肥前后底泥微生物的數(shù)量變化及種類鑒定情況，為養(yǎng)殖螺螄稻田生物肥的進一步施用提供前期數(shù)據(jù)和改進意見，為評價螺螄養(yǎng)殖稻田底泥微生物狀況及為水產(chǎn)養(yǎng)殖有益優(yōu)勢菌的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣

底泥樣品來自里高鎮(zhèn)的養(yǎng)殖稻田。里高鎮(zhèn)位于廣西壯族自治區(qū)柳州市柳江區(qū)西南部。采集樣本的稻田有7塊，每塊稻田的面積為667 m2，在7塊稻田中（編號為1號、8號至13號試驗田），1號為不施生物肥，只投喂飼料，3 d喂1次，每次20 kg；8號至10號只施生物肥，首次施肥6 000 kg/hm2（2020年11月2日），其后每半個月追肥1 650 kg/hm2；11號至13號施生物肥，首次施肥6 000 kg/hm2，其后每半個月追肥1 650 kg/hm2（與8號至10號稻田施肥時間一致），且額外投喂飼料，3 d喂1次，每次300 kg/hm2。

每塊養(yǎng)殖稻田取新鮮表層底泥500～600 g，每塊稻田分5個點均勻取樣，采集后置于無菌封口袋中混勻、封口、貼好標簽，于泡沫盒中加冰冷藏保存。采樣次數(shù)為10次，采樣時間點分別是首次施肥后0、3、7、14、21、28、59、90、118、149 d。

1.2 樣品處理

從底泥樣品中均勻稱取0.4 g底泥置入5 mL EP管中，在超凈工作臺內(nèi)，向其中加入3.6 mL ddH2O，在快速混勻器上振蕩使底泥充分溶解，使底泥均勻分散成為底泥懸浮液，在28℃、140 r/min條件下于振蕩培養(yǎng)箱振蕩20 min；靜置待混合液完全分層后在無菌條件下吸取1 mL上清液移入2 mL EP管中，此時的微生物懸浮液的稀釋倍數(shù)是101，靜置1 h；待懸浮液完全分層后吸取上清液0.2 mL至新的2 mL EP管中，加入1.8 mL ddH2O充分混合，此時的微生物懸浮液的稀釋倍數(shù)是102；搖勻，吸取0.2 mL于新的2 mL EP管中并加入1.8 mL ddH2O，以此類推至稀釋倍數(shù)為105。將上述不同稀釋倍數(shù)的菌懸液分裝好并置于4℃冰箱保存，做好標記，密封保存。

1.3 微生物分離與計數(shù)

土壤微生物數(shù)量測定采用平板菌落計數(shù)法。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基，放線菌用高氏一號培養(yǎng)基。細菌、真菌、放線菌分別取10-3、10-1、10-2的濃度梯度［8］。全程在無菌環(huán)境下進行，向培養(yǎng)基中加入菌液后用涂布棒均勻涂布。接種完成后，用封口膜將培養(yǎng)皿密封，使用北京林帆康達儀器設(shè)備有限公司的SPX-150B智能型生化培養(yǎng)箱，在28℃恒溫下倒置培養(yǎng)（細菌24 h、真菌96 h、放線菌144 h）。培養(yǎng)完成后觀察分離菌株的菌落形態(tài)、大小、顏色、邊緣形態(tài)、是否隆起、光澤等特征，對單菌落進行計數(shù)、拍照并于4℃下進行封口冷藏保存。統(tǒng)計菌落數(shù)，并按下列公式計算活菌數(shù)量（CFU/g）。

1.4 微生物DNA提取與擴增

采用Lysis Buffer法提取菌株的DNA，對菌株的DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為25μL：正反引物各1μL，PCR Mix 2.5μL，ddH2O 17.25μL，dNTPs 1μL，Taq酶0.25μL，DNA模板2μL。細菌、放線菌采用原核生物16SrRNA通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT）；真菌采用真核生物ITS序列引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保溫。通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物直接送武漢擎科生物科技有限公司進行測序。

1.5 系統(tǒng)進化分析

根據(jù)16SrRNA序列（細菌、放線菌）、ITS序列（真菌）相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，鑒定該菌株所屬的種屬。從GenBank選取相近菌株的序列與測序序列用MEGA7.0軟件使用比鄰法構(gòu)建菌株系統(tǒng)進化樹，對被鑒定菌株的分類地位進行進一步的分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Excel 2016軟件繪制微生物數(shù)量隨采樣時間變化的折線圖，采用SPSS23.0軟件對指標進行相關(guān)性分析和系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻田底泥微生物培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果與數(shù)量變化

細菌的數(shù)量占有明顯的優(yōu)勢，平均占比達97.32%。從圖1可以看出，第一次施肥過后（2020年11月2日），除1號稻田外各稻田底泥中的細菌數(shù)量有了明顯提升，1號稻田細菌反而減少了73.15%，而8號、9號、12號、13號稻田的菌落數(shù)分別上升了273.14%、307.73%、463.06%和63.00%，其中12號稻田的細菌數(shù)量上升幅度最為明顯（圖1，第2次采樣）。10號稻田細菌數(shù)量的增加滯后于其他稻田（圖1，第3次采樣）。施肥一段時間后，各稻田細菌數(shù)量出現(xiàn)一定的下降。在追肥后，各稻田的細菌數(shù)量大幅度增加，除8號稻田外均出現(xiàn)了最大值，1號稻田細菌數(shù)量最大值為2.19×107CFU/g，9號、10號稻 田 細 菌 數(shù) 量 最 大 值 分 別 為3.15×107、3.92×107CFU/g，11號、12號、13號稻田細菌數(shù)量最大值分別為3.20×107、2.47×107、3.84×107CFU/g（圖1，第5次采樣）。相比于前7次采樣的底泥細菌數(shù)量來說，后3次采樣底泥細菌的數(shù)量明顯減少，維持在較低水平，在一個較小的范圍內(nèi)波動并趨于穩(wěn)定。

圖1 施肥后各稻田底泥細菌的數(shù)量變化

真菌占稻田底泥微生物總數(shù)的0.82%，在第一次施肥之前，土壤中供真菌吸收的營養(yǎng)物質(zhì)不足，而新的養(yǎng)分還未添加到稻田中，此時真菌數(shù)量處于一個較低水平。第一次施肥后除了9號、10號、12號稻田真菌數(shù)量增加以外，其他稻田的真菌數(shù)量均下降，漲幅最大的是9號稻田（圖2，第2次采樣），隨后1號稻田的真菌數(shù)量出現(xiàn)短暫的上升，其他稻田的真菌數(shù)量變化不大（圖2，第3次采樣）。在第一次追肥之后除1號、11號和13號稻田的真菌數(shù)量下降外，各稻田的真菌數(shù)量均增加，并出現(xiàn)了最大值，其中8號稻田的真菌數(shù)量上升最大，出現(xiàn)了峰值，達1.33×105CFU/g，其次是9號稻田的4.95×104CFU/g和10號稻田的4.49×104CFU/g（圖2，第5次采樣）。在追肥一段時間后，第6次采樣時各稻田的真菌數(shù)量出現(xiàn)下降，最后趨于平穩(wěn)。

圖2 施肥后各稻田底泥真菌的數(shù)量變化

放線菌占稻田底泥微生物總數(shù)的1.86%。由圖3可以看出，第1次采樣時，放線菌數(shù)量最多的是13號稻田，為8.75×104CFU/g，其次是12號稻田的3.75×104CFU/g，說明這2塊稻田底泥中的初始放線菌數(shù)量較多。在第一次施肥后，1號、8號、10號稻田的放線菌數(shù)量出現(xiàn)了一定的增加，其中1號稻田放線菌數(shù)量增幅最大（圖3，第2次采樣）。相反，11號、12號、13號稻田的放線菌數(shù)量相較于施肥前出現(xiàn)了下降，但在施肥一段時間后緩慢上升（第3次采樣）。在追肥后除了1號和13號稻田的放線菌數(shù)量有所上升外，其他稻田的放線菌數(shù)量均出現(xiàn)了下降（圖3，第5次采樣）。但在追肥一段時間后（第6次采樣時），除13號稻田外，各稻田放線菌數(shù)量均上升，其中12號稻田放線菌數(shù)量上升至最高，為6.75×104CFU/g，其次是11號稻田的5.50×104CFU/g。在第7次采樣后，放線菌的數(shù)量變化與細菌、真菌數(shù)量變化趨勢相同。

圖3 施肥后各稻田底泥放線菌的數(shù)量變化

2.2 稻田底泥微生物數(shù)量的系統(tǒng)聚類分析

將7塊稻田的底泥微生物總數(shù)進行系統(tǒng)聚類分析，由聚類譜系（圖4）可以看出，7塊稻田可被分成2類，一類是10號稻田，另一類是1號、8號、9號、11號、12號、13號稻田；進一步細分成了3類，8號、9號、11號、12號、13號為一類，1號、10號稻田各為一類。

圖4 使用組間聯(lián)接的7塊稻田底泥微生物總數(shù)量的系統(tǒng)聚類譜系

2.3 稻田底泥微生物的鑒定

通過形態(tài)特征，結(jié)合分子手段，將培養(yǎng)出來的微生物進行鑒定分析。分析結(jié)果（圖5）顯示，鑒定出的細菌主要包括2個門，其中數(shù)量較少的一類是厚壁菌門（Firmicutes），多數(shù)為革蘭氏陽性菌，屬于G+C含量較低的一類細菌；共鑒定出屬于厚壁菌門的細菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假芽孢桿菌屬（Fictibacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）3個屬。其中數(shù)量較多的一類細菌是變形菌門（Proteobacteria），這是一類革蘭氏染色呈陰性的細菌，因其形態(tài)變化多樣而得名，大多數(shù)營兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活；其中包含假單胞菌屬（Pseudomonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、食酸菌屬（Acidovorax）5個屬。真菌鑒定出1門（圖6），為子囊菌門（Ascomycota），這些真菌由于有性階段形成子囊和子囊孢子而得名，其中含1科叢梗孢科（Moniliaceae）1屬曲霉屬（Aspergillus）。

圖5 基于分離菌株的16Sr RNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 基于分離菌株的ITS序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

如表1所示，鑒定出的細菌中，優(yōu)勢菌種為芽孢桿菌屬（56%～99%）和假單胞菌屬（15%～64%）。芽孢桿菌在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)白色、圓形、有光澤、凸起的菌落形態(tài)，而假單胞菌呈現(xiàn)黃色、圓形、有光澤、凸起的菌落形態(tài)。真菌主要是曲霉，在培養(yǎng)基上呈輻射狀生長，中間呈黑色，周圍長出放射狀的類似毛玻璃的孢子群，且3個曲霉之間會形成明顯的分界線，不會發(fā)生重疊。放線菌從上方看主要是呈現(xiàn)粗糙、干燥的圓形菌落，中間凹、周圍凸。

表1 螺螄養(yǎng)殖稻田底泥微生物鑒定分類

3 討論

3.1 施生物肥對稻田底泥微生物數(shù)量的影響

施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一個重要的措施，通過施肥可以使得肥料中的物質(zhì)與土壤成分相互作用，改善土壤生態(tài)環(huán)境和理化性質(zhì)，促進作物的生長。土壤是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其中充滿著各種有機質(zhì)、無機質(zhì)、土壤酶以及土壤微生物，其中，微生物是一個非常重要的活性成分，土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)又可以間接反映土壤的肥力以及致病能力［9］。在土壤微生物中，細菌占有絕對的數(shù)量優(yōu)勢，放線菌在土壤中的數(shù)量普遍也多于真菌，成為土壤微生物中的第二大類。本研究中，稻田底泥細菌的數(shù)量超過了稻田底泥微生物的97%，占絕對的優(yōu)勢，這與曹延珺等［10］和譚宏偉等［11］以及Debosz等［12］的研究結(jié)果一致。大量研究表明，增施肥料是提高土壤肥力的主要途徑，施肥是通過改變土壤的理化性質(zhì)，影響微生物的生存環(huán)境，從而提高了微生物的數(shù)量和活性［13-15］。羅莉等［16］研究發(fā)現(xiàn)施肥后土壤細菌和放線菌數(shù)量隨著處理時間的變化先升高后降低，而真菌則是呈逐漸降低的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，在施肥后微生物數(shù)量總體上呈先迅速增加后緩慢減少的變化規(guī)律；在后期隨著每半個月一次的追肥，施肥對微生物的影響已經(jīng)很小，微生物數(shù)量保持在較低水平，分析可能與生物肥的肥效和試驗后期土壤肥力等指標的變化有關(guān)?？梢酝ㄟ^增加追肥頻率或者增加追肥量或者提高肥料中營養(yǎng)物質(zhì)的比例來提高肥力。

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，稻田底泥細菌數(shù)量與真菌數(shù)量存在低度的線性正相關(guān)，推測可能是稻田里微生物的生長與真菌的生長有一定的耦合關(guān)系，細菌的某些代謝產(chǎn)物可能被真菌利用，這個推測與Mackie等［17］的研究相符合。而細菌與放線菌、放線菌與真菌之間的相關(guān)性很小，但由于本研究是采用實驗室培養(yǎng)基法分析微生物種類，其種類不能完全反映底泥里的所有微生物種類，因此，細菌與放線菌、放線菌與真菌之間的相關(guān)性是否確實很小有待進一步研究。

系統(tǒng)聚類分析結(jié)果的3類與稻田的施肥處理類別的3類出現(xiàn)了一定的差異，可能與各稻田微生物基數(shù)大小和對施肥的反應(yīng)存在一定的關(guān)系。分析稻田的微生物數(shù)量可以發(fā)現(xiàn)，1號稻田僅投喂飼料，雖其底泥微生物的基數(shù)很大，但后續(xù)由于沒有進行施肥，微生物的數(shù)量相比于其他施肥的稻田較少。8號稻田在施肥前，底泥中的真菌較多，而細菌和放線菌較少，但是施肥后，細菌生長迅速占據(jù)了主導(dǎo)地位，一定程度上限制了其他2種菌的生長。10號稻田的微生物基數(shù)最小，且通過微生物數(shù)量變化趨勢可以看出，每次施肥后，10號稻田微生物數(shù)量的增長相對于其他稻田有一定的延遲，且試驗后期也一直維持在較低水平，明顯低于其他施肥處理的稻田，這也與10號稻田微生物基數(shù)小有一定的關(guān)系。而11號、12號、13號3個稻田的微生物基數(shù)較大，對施肥和投喂飼料的反應(yīng)也較快。9號稻田的微生物基量雖不大，但是對施肥的反應(yīng)較好；分析認為可能是肥料中的微生物有利于改善9號稻田的微生態(tài)環(huán)境，能夠促進稻田中原有的有益微生物生長，幫助創(chuàng)造一個更適合微生物生長的環(huán)境。

3.2 稻田底泥微生物的種類鑒定與優(yōu)勢種

通過分子生物學(xué)的方法鑒定出了厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的11種細菌以及子囊菌門（Ascomycota）的4種真菌，未能鑒定出放線菌。程瑩寅等［18］直接分析草魚養(yǎng)殖池塘底泥細菌的DNA，鑒定了變形菌門、厚壁菌門、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）以及未知菌。Jangid等［19］通過高通量測序鑒定出不同耕作類型土壤中的細菌，發(fā)現(xiàn)變形桿菌的數(shù)量最多，占30.6%～43.2%，其次是酸桿菌，占17.1%～26.2%。這些研究證明，變形菌門和厚壁菌門的種類是土壤中常見的細菌，其中一些種類也在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中起到十分關(guān)鍵的作用。根據(jù)實驗室測定的螺螄測產(chǎn)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，12號稻田的螺螄生長情況最好，其增產(chǎn)率為57.86%。而11號稻田螺螄的生長情況較差，并出現(xiàn)大量死亡。微生物培養(yǎng)結(jié)果表明，12號稻田芽孢桿菌的數(shù)量明顯處于優(yōu)勢，可能是螺螄養(yǎng)殖稻田的有益優(yōu)勢菌占比大的原因，而11號稻田里出現(xiàn)了表皮葡萄球菌，推測可能是螺螄的致病菌，或者其破壞了螺螄健康穩(wěn)定的生長環(huán)境進而導(dǎo)致螺螄的死亡。因此，在實際生產(chǎn)中可以在生物肥中額外添加芽孢桿菌等有益菌類，通過施肥改善螺螄養(yǎng)殖稻田底泥微生物的群落結(jié)構(gòu)，以達到螺螄養(yǎng)殖更高產(chǎn)的目的。有研究者將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為水質(zhì)改良劑添加到池塘中，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮和硫化物的濃度有明顯的減少，水體的pH也出現(xiàn)了下降［20，21］。同時可以通過監(jiān)測螺螄養(yǎng)殖有害菌的存在與生長情況而及時預(yù)防與控制螺螄養(yǎng)殖病害問題。

王繼偉等［22］研究甘肅小隴山日本落葉松人工林土壤優(yōu)勢真菌時發(fā)現(xiàn)，青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillum）是該土壤的優(yōu)勢真菌。本研究鑒定出的真菌都是曲霉屬的真菌，分析曲霉可能是土壤中較為常見的真菌，是優(yōu)勢真菌之一，其對土壤腐殖質(zhì)的形成具有推動作用，能夠增加土壤肥力，改善環(huán)棱螺生產(chǎn)環(huán)境［23］。因此本研究鑒定出的細菌以及真菌，可能對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的水質(zhì)和底質(zhì)改良具有潛在的功能，隨著微生態(tài)制劑和生物肥的研究和發(fā)展，將本試驗鑒定出的菌種作為添加劑的一部分是一種可行的方案。

4 小結(jié)

施肥可以明顯提高螺螄養(yǎng)殖稻田底泥中微生物的數(shù)量，施肥后底泥中3類微生物的數(shù)量都是隨著時間的推移先迅速上升然后緩慢下降。施基肥和第一次追肥后微生物數(shù)量上升很快，且在第一次追肥后達到了最高值。分析鑒定了對螺螄生長可能有益的微生物種類如芽孢桿菌，為后續(xù)在螺螄養(yǎng)殖生產(chǎn)中可以通過施肥、添加微生物制劑等措施改善稻田底泥環(huán)境提供參考價值。