童志平， 易舒婷， 劉甜甜， 郭 婷， 孟 濤*

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610031)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的終身性代謝疾病。在21世紀(jì)，隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，糖尿病已經(jīng)成為了一種全球性的“流行病”[1 - 3]。長(zhǎng)期過(guò)量的攝入葡萄糖將會(huì)誘發(fā)糖尿病和一系列并發(fā)癥[4,5]。因此，葡萄糖作為當(dāng)今威脅人類健康的“隱形殺手”，在臨床醫(yī)學(xué)、食品分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域都需要簡(jiǎn)單、方便和快速的檢測(cè)方法[6,7]。最常見(jiàn)的葡萄糖即時(shí)檢測(cè)方法是已商業(yè)化的、基于電化學(xué)原理的血糖儀和基于比色原理的血糖試紙。其中，比色試紙因其不依賴儀器、操作簡(jiǎn)單、不受環(huán)境限制、結(jié)果可視化等優(yōu)勢(shì)成為了一種用戶友好的檢測(cè)方式[8,9]。然而，目前市售的血糖比色試紙用于檢測(cè)葡萄糖時(shí)存在著一些缺陷：(1)天然酶固有的不穩(wěn)定性使得這些試紙?jiān)诟邷丨h(huán)境下和長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)，由于酶活性的下降導(dǎo)致試紙的使用壽命變短，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[10 - 12]；(2)過(guò)量的酶被固載在試紙上以提高催化速率，加快檢測(cè)速度，從而導(dǎo)致分析的成本較高；(3)由于靈敏度較低，血糖比色試紙難以滿足低濃度葡萄糖的檢測(cè)。因此，解決葡萄糖比色試紙存在的這些缺點(diǎn)迫在眉睫。

聚乙二醇化(PEG化)是一種生物相容性高的蛋白質(zhì)交聯(lián)固定化技術(shù)。這種技術(shù)可以通過(guò)將PEG高分子鏈末端的羥基改性為活潑基團(tuán)后，與蛋白質(zhì)表面的氨基或羧基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成酶-高分子共聚物。PEG化能夠穩(wěn)定酶蛋白的構(gòu)象，提高酶的穩(wěn)定性，并且對(duì)酶的活性影響較小[13 - 16]。基于此，本研究利用已經(jīng)PEG化的葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，制備了酶-高分子共聚物納米顆粒(mPEG -GOX& HRP conjugate nanoparticles,mCNPs)，并將其固載在紙芯片上用于葡萄糖的比色法檢測(cè)。圖1為mCNPs紙芯片檢測(cè)葡萄糖的原理示意圖。與已經(jīng)報(bào)道的一些基于載體的固定化酶的方式比較[17 - 19]，這種高分子鏈交聯(lián)固定酶的方式減弱了載體帶來(lái)的傳質(zhì)阻力，加快了酶反應(yīng)速率，可以快速完成葡萄糖的比色檢測(cè)。本方法構(gòu)建的mCNPs紙芯片具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，并且檢測(cè)結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性，為葡萄糖的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供了新的平臺(tái)。

圖1 mCNPs紙芯片檢測(cè)原理示意圖。(a)裁剪紙芯片；(b)mCNPs紙芯片的制備和顯色機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JSM-7001F型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)，JSM-7001F型X射線能譜儀(EDS)(日本，電子株式會(huì)社)；pHB-3C型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；FHG -9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司)；VORTEX-5型渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；FA2204N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)。

單甲氧基聚乙二醇醛(mPEG -ALD，5 kDa)購(gòu)于湖南華騰制藥有限公司；GOX(160 kDa，來(lái)源于黑曲霉)、HRP(44 kDa，來(lái)源于辣根)、牛血清白蛋白、Whatman?1#號(hào)濾紙和2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS顯色劑)，均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；HCl、Na2HPO4、NaH2PO4、酚酞和瓊脂糖均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaCl和KCl購(gòu)于成都科龍化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水葡萄糖和L-抗壞血酸購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。實(shí)驗(yàn)水為去離子水。

人血清樣本由成都某人民醫(yī)院提供。

1.2 mCNPs溶液的制備

mCNPs的合成參考文獻(xiàn)方法[20]。首先，使用0.1 mol/L的HCl將其配成pH=5的水溶液(筆式pH計(jì)校準(zhǔn))。然后，吸取1 mL的pH=5的水溶液，加入4 mg的GOX凍干粉和0.4 mg的HRP凍干粉，使用渦旋振蕩器(100 r/min)攪拌溶液1 min后，再加入4 mg的mPEG -ALD，攪拌溶液使其充分溶解混合。最后，將反應(yīng)溶液密封并置于室溫下靜置反應(yīng)24 h后，即得mCNPs溶液(本文中所用的mCNPs溶液均用此方法制備)。

1.3 mCNPs紙芯片的制備

1.3.1 紙芯片的制作為保證紙芯片尺寸均一且制作方便，使用市售的打孔機(jī)將纖維素紙裁剪成直徑為5.5 mm的圓形紙片，一次裁剪可得6張大小尺寸均一的紙芯片。

1.3.2 mCNPs紙芯片的制作首先，稱取5.5 mg的ABTS溶于1 mL水中制10 mmol/L的顯色劑溶液。然后，用移液槍吸取3 μL的顯色劑溶液滴加到紙芯片上，室溫下待其完全干燥。最后，用移液槍吸取3 μL的mCNPs溶液滴加到載有顯色劑的紙芯片上，然后將紙芯片置于溫度37 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥5～10 min。即得mCNPs紙芯片。

1.4 葡萄糖的檢測(cè)

在本文所采用的級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)中，葡萄糖在GOX的催化下產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2，緊接著H2O2能與顯色劑ABTS在HRP的催化下產(chǎn)生明顯的綠色物質(zhì)ABTS·+。取3 μL的葡萄糖溶液滴加到mCNPs紙芯片上，反應(yīng)30 s左右，使用智能手機(jī)攝像頭拍攝顯色照片。用Image -J軟件分析照片的灰度值變化(ΔIntensity%)，建立葡萄糖濃度與顯色灰度值的線性關(guān)系。ΔIntensity%的計(jì)算公式如下：

(1)

其中，Incontrol是指空白溶液滴加到紙芯片上的灰度值，Insample是指將樣品溶液滴加到紙芯片上后測(cè)得的灰度值。

1.5 真實(shí)樣品檢測(cè)

使用0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)將血清樣本稀釋10倍。取3 μL稀釋后的溶液滴加到mCNPs紙芯片上，反應(yīng)30 s左右，使用智能手機(jī)攝像頭拍攝顯色照片。使用Image -J軟件分析ΔIntensity%后，代入線性關(guān)系公式即得血清中的葡萄糖濃度。將所測(cè)得的濃度結(jié)果與臨床測(cè)試方法(全自動(dòng)生化分析儀，羅氏Cobas，c702)所得結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 mCNPs紙芯片的表征

對(duì)mCNPs的紙芯片進(jìn)行掃描電鏡(SEM)觀察。如圖2(a)和2(b)所示，mCNPs紙芯片較為粗糙，且能明顯觀察到顆粒負(fù)載于纖維表面上。圖2(c)為空白紙芯片的能譜(EDS)圖，出現(xiàn)了C和O元素的峰，這是因?yàn)槔w維素為天然多糖，主要由C、O、H三種元素組成。圖2(d)為mCNPs紙芯片的EDS圖，除了C、O元素的峰外，還出現(xiàn)了明顯的N元素的峰，說(shuō)明酶蛋白負(fù)載在了紙纖維上。以上結(jié)果證明了mCNPs成功固載在了紙芯片上。

圖2 mCNPs紙芯片的掃描電鏡(SEM)圖(a、b)；空白紙芯片(c)和mCNPs紙芯片(d)的能譜(EDS)圖

2.2 試劑及樣品的消耗體積的優(yōu)化

纖維素紙的吸水能力是有限的。加入的酶溶液體積過(guò)少，無(wú)法浸滿整個(gè)紙芯片，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確；加入酶溶液體積過(guò)多，超出紙芯片的吸水極限，溶液會(huì)溢出，造成浪費(fèi)。因此，實(shí)驗(yàn)探究了紙芯片的極限浸潤(rùn)量。為了更直觀的觀察紙芯片的吸水情況，在堿性溶液中添加酚酞制成紅色溶液，將不同體積的紅色溶液滴加到紙芯片上，待完全浸透后用手機(jī)攝像頭拍攝紙芯片的圖像。如圖3所示，1 μL和2 μL的酶溶液無(wú)法完全浸潤(rùn)紙芯片，4 μL和5 μL的酶溶液量過(guò)大，溶液有浸出現(xiàn)象，3 μL的酶溶液能使紙芯片剛好被完全浸潤(rùn)又不造成溶液浪費(fèi)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)在紙芯片上的酶溶液滴加量選為3 μL。

圖3 紙芯片的最佳溶液承載量探究

2.3 葡萄糖檢測(cè)條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶的濃度和檢測(cè)時(shí)間。如圖4(a)所示，隨著酶濃度的增加，顯色強(qiáng)度逐漸增加，在GOX的質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，顯色強(qiáng)度達(dá)到最大。因此，酶濃度被優(yōu)化為4 mg/mL。如圖4(b)所示，隨著時(shí)間的增加，顯色強(qiáng)度逐漸增大，在顯色時(shí)間為30 s時(shí)，顯色強(qiáng)度達(dá)到飽和。因此，將檢測(cè)時(shí)間定為30 s。

圖4 GOX濃度(a)和檢測(cè)時(shí)間(b)的優(yōu)化

2.4 比色法檢測(cè)葡萄糖的性能評(píng)估

在優(yōu)化的條件下檢測(cè)葡萄糖，建立顯色強(qiáng)度與葡萄糖濃度的線性關(guān)系。如圖5(a)所示，隨著葡萄糖濃度的增加，生成的綠色產(chǎn)物ABTS·+增多，因此mCNPs紙芯片上的綠色越深。在0.1～3.0 mmol/L的葡萄糖濃度范圍內(nèi)，顯色強(qiáng)度ΔIntensity%(y)與濃度(x)呈良好的線性關(guān)系(圖5(b))，線性方程為：y=23.721x+4.487(R2=0.9940)。使用3倍信噪比(S/N)的計(jì)算方法對(duì)本研究的檢測(cè)限(LOD)進(jìn)行計(jì)算，算得LOD為0.01 mmol/L。

圖5 (a)不同濃度葡萄糖與紙芯片的顯色圖像；(b)檢測(cè)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

與已經(jīng)報(bào)道的酶基比色試紙進(jìn)行性能比較，結(jié)果如表1所示。本方法的檢測(cè)限和檢測(cè)速度優(yōu)于大部分已發(fā)表的研究工作。

表1 本方法與其他葡萄糖比色試紙的性能比較

2.5 重現(xiàn)性和選擇性

為了探究mCNPs紙芯片檢測(cè)葡萄糖結(jié)果的重現(xiàn)性，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)1 mmol/L的葡萄糖溶液進(jìn)行了6次平行測(cè)定。結(jié)果如圖6(a)所示，顯色強(qiáng)度保持高度一致，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%。這種較高的結(jié)果重現(xiàn)性可以歸因于移液加樣的方法提高了紙芯片的檢測(cè)結(jié)果的可靠性?？紤]到實(shí)際檢測(cè)時(shí)樣本中可能含有干擾物，配制了2 mmol/L的不同干擾物(NaCl、KCl、牛血清白蛋白、L-抗壞血酸和瓊脂糖)用于鑒定紙芯片檢測(cè)葡萄糖時(shí)的選擇性。結(jié)果如圖6(b)所示，只有在樣本為葡萄糖時(shí)，紙芯片才能觀察到明顯的顏色變化。以上結(jié)果說(shuō)明mCNPs紙芯片具有良好的結(jié)果重現(xiàn)性和葡萄糖選擇性。

圖6 mCNPs紙芯片比色檢測(cè)葡萄糖的重現(xiàn)性(a)和選擇性(b)

2.6 穩(wěn)定性

為了探究mCNPs紙芯片在高溫環(huán)境下的穩(wěn)定性，將其置于40 ℃的恒溫箱中1～5 h后，滴加1 mmol/L的葡萄糖溶液觀察其顯色情況。將等量的游離酶滴加在干燥在紙芯片上，制備成游離酶紙芯片作為對(duì)照。如圖7(a)所示，在高溫環(huán)境下長(zhǎng)時(shí)間放置后，游離酶紙芯片的酶活性明顯下降，而mCNPs紙芯片表現(xiàn)出更優(yōu)的酶活穩(wěn)定性。為了探究mCNPs紙芯片的長(zhǎng)期儲(chǔ)存性能，將mCNPs紙芯片和游離酶紙芯片同時(shí)置于室溫條件下密閉放置7 d，每天檢測(cè)其對(duì)1 mmol/L的葡萄糖溶液的顯色情況。結(jié)果如圖7(b)所示，在長(zhǎng)期儲(chǔ)存下，mCNPs紙芯片的酶活保存情況良好，而游離酶芯片活性明顯下降。以上的結(jié)果可以歸因于PEG化的方法增強(qiáng)了酶的耐熱性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

圖7 mCNPs紙芯片與游離酶紙芯片的耐熱性(a)和長(zhǎng)期儲(chǔ)存性(b)對(duì)比

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法檢測(cè)了成都市某人民醫(yī)院提供的3名糖尿病人的血清樣本。如表2所示，本方法的檢測(cè)結(jié)果與臨床檢測(cè)的結(jié)果高度吻合，重現(xiàn)率在97.52%～101.76%之間，RSD在0.9%～1.1%之間。這說(shuō)明本方法用于血糖檢測(cè)時(shí)，結(jié)果精準(zhǔn)可靠，具備一定的應(yīng)用價(jià)值。

表2 糖尿病患者血清中葡萄糖的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用PEG化技術(shù)合成了mCNPs，并制備mCNPs紙芯片用于葡萄糖的快速比色法檢測(cè)。這種mCNPs紙芯片克服了游離酶制備的比色試紙穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，具有成本低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、響應(yīng)快速、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于真實(shí)血清樣本的檢測(cè)，為臨床測(cè)血糖和食品、藥品及化工等領(lǐng)域的葡萄糖現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供了一個(gè)新方法。