吳 姝， 陳 思， 胡 琪， 曹 爍， 曾鴻林， 陳 芳*

(華中科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，生物無機(jī)化學(xué)與藥物湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074)

葉酸(Folic Acid,FA)是一種水溶性維生素，由6-甲基蝶呤(MEP)殘留物、對氨基苯甲酸(PABA)殘留物和谷氨酸(Glu)殘留物三個部分組成。葉酸在許多生理化過程中起著非常重要的作用[1]。懷孕初期的婦女每天補(bǔ)充400 mg葉酸可以減少嬰兒神經(jīng)管缺陷和先天畸形的風(fēng)險[2]。缺乏葉酸則會導(dǎo)致貧血，并增加心臟病發(fā)作的可能性[3]。另一方面，葉酸無法從體內(nèi)的新陳代謝中合成，只能從飲食中獲取。葉酸在光照、受熱下易氧化分解，而且在食品加工過程中極易造成損失[4]。因此，提出一種簡單、快速的分析方法用于食品或藥劑中葉酸的檢測具有十分重要的實際意義。

目前，有多種方法可以用于測定食品或藥劑中葉酸的含量，包括電化學(xué)法[5]、化學(xué)發(fā)光法[6]、熒光法[7]、高效液相色譜法[8]、分光光度法[9]等。其中，熒光法具有響應(yīng)速度快、選擇性高的優(yōu)勢。Elisabet等人[10]提出了一種在線柱后光衍生化的液相色譜法分析葉酸及其兩種主要代謝物，但該方法檢測儀器貴重且需使用有機(jī)溶劑做流動相。Su[11]利用Fenton試劑作為氧化劑，建立了測定葉酸含量的間接熒光法。這些基于化學(xué)氧化的熒光衍生法通常需要加入過量的氧化劑，其氧化程度不可控。光催化技術(shù)是一種高級氧化技術(shù)，僅利用極其豐富、無污染和安全的太陽能，就可以實現(xiàn)對有機(jī)物的氧化。目前光催化技術(shù)在光催化制氫[12]、污染物的降解[13]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。光催化納米材料大多是金屬氧化物或硫化物等半導(dǎo)體材料，其中納米TiO2以其無毒、成本低、物理和化學(xué)穩(wěn)定性好，以及獨特的電子和光學(xué)性能受到了研究者們的極大關(guān)注[14]。將光催化氧化與熒光衍生結(jié)合可避免二次污染，提高氧化效率，同時氧化程度可控。目前，基于光催化的熒光衍生往往被用于檢測活性氧化物種，評價材料的光催化性能[15]，而用于化合物的檢測鮮有報道。

本文以納米TiO2為光催化劑，將光催化技術(shù)與熒光分析法相結(jié)合，建立了一種新的用于藥物中葉酸檢測的熒光分析新方法。在紫外燈的照射下，納米TiO2產(chǎn)生的羥基自由基氧化葉酸生成強(qiáng)熒光的蝶啶類物質(zhì)6-甲?；?6-FOP)。通過葉酸濃度與溶液熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系，實現(xiàn)對葉酸含量的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS -55型熒光分光光度計(美國，珀金埃爾默股份有限公司)。UV2600型紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)。FA1104B型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。KQ-50E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。85-1 A型磁力攪拌器(上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司)。液相色譜儀和質(zhì)譜儀(德國，安捷倫科技有限公司)。

葉酸(FA，上海伯奧生物科技有限公司)；三羥甲基胺基甲烷(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)；NaH2PO4(上海強(qiáng)順化工有限公司)；NH4Ac(上海山浦化工有限公司)；NH3·H2O、納米TiO2(P25)、NaAc·3H2O、Na2HPO4·12H2O、HCl、甲醇均購買自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，所有試劑均為分析純。實驗用水為去離子水。

1.2 葉酸的檢測

將0.0500 g葉酸溶于一定量NH3·H2O中，用去離子水定容至100 mL，得到0.500 g/L的葉酸儲備溶液。稱取0.0500 g納米 TiO2至50 mL容量瓶，定容得到納米TiO2為1.00 g/L的乳白色懸濁液。向小燒杯中分別加入1.00 mL一定濃度的葉酸溶液，1.00 mL 0.100 mol/L pH=4.2的HAc-NaAc緩沖溶液，100 μL納米TiO2懸濁液和7.90 mL去離子水。將混合溶液置于紫外燈下磁攪拌5 min，以增大納米TiO2的光接觸面積，提高氧化效率。在室溫下，用0.22 μm 的濾膜過濾混合溶液，然后以280 nm為激發(fā)波長，測定440 nm波長處濾液的熒光強(qiáng)度。

1.3 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱為C18柱，柱溫度設(shè)置為30 ℃。流動相為30%甲醇和70% 0.01 mol/L NH4Ac，流速為1 mL/min。進(jìn)樣量為20 μL。用高純度氮氣作為內(nèi)充氣體，干燥溫度設(shè)置為200 ℃。質(zhì)譜采用正離子模式進(jìn)行分析，掃描范圍為m/z50～1 200。

1.4 實際樣品預(yù)處理

斯利安葉酸片購買自某一藥房。將一片葉酸片研磨成粉末狀，溶于去離子水中并定容至100 mL,在室溫下超聲處理10 min，用分液漏斗過濾，靜置一段時間后，取上清液做為樣品溶液，置于冰箱中備用。為了防止葉酸被破壞，整個操作過程都是在弱光下進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉酸檢測系統(tǒng)的建立

分別測量了1.00 mg/L的葉酸溶液直接光氧化前后，以及光催化氧化后的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜。如圖1所示，葉酸自身幾乎沒有熒光，在紫外光下直接光氧化5 min后，葉酸的熒光信號增強(qiáng)，最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為280 nm和440 nm。而光催化氧化后，葉酸溶液的熒光強(qiáng)度大約為光直接氧化的5倍，且最大激發(fā)和發(fā)射波長不變。結(jié)果表明，相比于光直接氧化，光催化劑的引入極大提高了葉酸的熒光衍生程度。因此，光催化氧化熒光衍生葉酸可用于構(gòu)建葉酸的熒光分析方法。

圖1 葉酸氧化前(a1)、光氧化后(a2)、光催化氧化后(a3)的熒光激發(fā)光譜以及葉酸氧化前(b1)，光氧化后(b2)和光催化氧化后(b3)的熒光發(fā)射光譜

2.2 熒光衍生條件

2.2.1 緩沖溶液及pH影響考察了Tris-HCl緩沖溶液、HAc-NaAc緩沖溶液和磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，以及其pH值對葉酸氧化產(chǎn)物熒光的影響，發(fā)現(xiàn)在PBS和Tris-HCl緩沖溶液中，葉酸氧化產(chǎn)物的熒光較弱；以HAc-NaAc緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，pH=4.2時，熒光強(qiáng)度最大且穩(wěn)定，見圖2(A)。這可能是由于溶液酸度影響了葉酸分子中氨基的質(zhì)子化以及羧基的電離程度；也可能是因為在堿性條件下，由于納米TiO2表面負(fù)電荷和溶液中高濃度OH-，抑制了TiO2內(nèi)部的光生電子向催化劑表面的轉(zhuǎn)移過程，促進(jìn)了光生電子-空穴的復(fù)合[16]，影響光催化氧化效率。實驗選擇pH=4.2的HAc -NaAc緩沖溶液。

2.2.2 納米TiO2加入量影響圖2(B)為納米TiO2含量對熒光強(qiáng)度影響。可以看出，對1.00 mg/L葉酸，納米TiO2為0.010 g/L時熒光最強(qiáng)。納米TiO2的適量增加可以提供更多的反應(yīng)活性位點和光活性物質(zhì)，促進(jìn)葉酸氧化過程。過量納米TiO2粒子將掩蓋一部分光敏表面，影響紫外光的穿透，阻礙內(nèi)部溶液對光的吸收；也可能由于過量納米TiO2表面光反射率增加，導(dǎo)致光催化效率的降低[17]。選擇0.010 g/L納米TiO2。

2.2.3 光照時間的影響光照時間對熒光強(qiáng)度的影響如圖2(C)所示。隨光照時間增加，葉酸的熒光強(qiáng)度隨之增加，這表明可以通過控制光催化時間來控制熒光衍生程度。綜合考慮檢測靈敏度和檢測時間，光照時間選擇5 min。

圖2 pH(A)、TiO2加入量(B)和光照時間(C)對溶液熒光強(qiáng)度的影響

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限和重現(xiàn)性圖3為葉酸質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.001～1.300 mg/L范圍內(nèi)，葉酸濃度與440 nm處熒光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，線性方程式為：F=323c+0.497(F：熒光強(qiáng)度，c:mg/L),相關(guān)系數(shù)R2= 0.9960。以3倍信噪比(S/N=3)計算，該方法檢出限為 0.348 μg/L。10次獨立測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.87%，表明方法有良好重現(xiàn)性。

圖3 葉酸濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

與一些其它的葉酸檢測方法相比較(表1)，本方法在無需使用貴金屬、無需復(fù)雜的合成或操作步驟的前提下，具有更寬的線性范圍和更低的檢出限。

表1 測定葉酸的分析方法比較

2.3.2 抗干擾能力為了檢測該方法的抗干擾性能，測定了某些干擾物質(zhì)對熒光強(qiáng)度的影響，實驗結(jié)果如圖4所示。2.27×10-4mol/L葡萄糖、L-半胱氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、谷氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、MgSO4、KCl、CaCl2，1.13×10-4mol/L的牛血清白蛋白和1.13×10-5mol/L的色氨酸等都對檢測結(jié)果沒有明顯的影響。2.27×10-5mol/L的Cu(NO3)2和1.13×10-5mol/L抗壞血酸對葉酸熒光強(qiáng)度有一定的抑制作用，可能是由于Cu2+被光生電子還原后生成的Cu+對葉酸的氧化過程產(chǎn)生影響，而抗壞血酸為強(qiáng)自由基捕獲劑，捕獲了光催化產(chǎn)生的羥基自由基，導(dǎo)致葉酸的氧化程度降低。因此，該方法有較好的抗干擾能力。

2.4 實際樣品的測定

將預(yù)處理后的葉酸片溶液，經(jīng)上述方法熒光衍生后，測定440 nm處的熒光強(qiáng)度，并進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗，每組平均測定3次。具體結(jié)果如表2所示。實驗測得葉酸片中葉酸含量為0.401 mg/粒(標(biāo)注的含量：0.40 mg/粒)。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.33%～1.26%之間。表明該方法有較高的精確度和較好的重現(xiàn)性，可以應(yīng)用于實際樣品中葉酸的定量測定。

2.5 機(jī)理探討

測定了葉酸氧化前后的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜圖。圖中出現(xiàn)的m/z192.0對應(yīng)于6-甲酰基蝶呤(6-FOP)，該氧化產(chǎn)物與文獻(xiàn)報道[22,23]的葉酸的降解產(chǎn)物基本一致。葉酸本身幾乎沒有熒光，當(dāng)MEP部分被紫外光激發(fā)時，電子會從PABA環(huán)轉(zhuǎn)移到MEP部分，導(dǎo)致分子內(nèi)熒光“自猝滅”[24]。光催化氧化導(dǎo)致MEP與PABA之間的C-N鍵斷裂，分子內(nèi)的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)效應(yīng)消失，體系熒光顯著增強(qiáng)。溶液中被氧化MEP部分可進(jìn)一步光敏化葉酸分子的氧化反應(yīng)[25]，使葉酸的熒光衍生效率大大提高。

3 結(jié)論

建立了一種基于光催化的快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高的檢測葉酸的熒光分析法。一定條件下，熒光強(qiáng)度和葉酸的濃度具有良好的線性關(guān)系，可以用于分析葉酸片中葉酸的含量。光催化氧化與熒光分析法的結(jié)合是樣品分析中一個全新的檢測方法，可以用于各種氧化后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的分析。此外，可以通過摻雜其他原子來增大納米TiO2的表面空隙，防止電子-空穴對復(fù)合，提高該方法的氧化效率；也可以進(jìn)一步通過表面修飾提高氧化的選擇性和抗干擾能力等。