白福霞，李 梅，裴浩宇，安小婭，王 剛，王延濤，于 杰，黨瑞華*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.山東東阿阿膠公司，山東 東阿 252299)

生長(zhǎng)/分化因子-10(GDF10)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)家族的成員，也稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白-3b(BMP-3b)，與骨形態(tài)發(fā)生蛋白3(BMP-3)高度相關(guān)，BMP-3b和BMP-3的成熟區(qū)大約80%的氨基酸序列具有同一性[1-2]。最初是從大鼠股骨組織中發(fā)現(xiàn)的一種新型BMP-3相關(guān)蛋白[3-4]。GDF10存在于新生兒和成人骨樣本中，在顱骨中檢測(cè)到的水平高于在長(zhǎng)骨中檢測(cè)到的水平，并且GDF10基因表達(dá)與大鼠顱骨中成骨細(xì)胞的分化相關(guān)。因此，GDF10在調(diào)節(jié)參與骨骼形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞分化事件中發(fā)揮重要作用。GDF10不僅在骨骼和發(fā)育中的胚胎中高表達(dá)，而且在哺乳動(dòng)物脂肪組織中表達(dá)較高[5]。已有研究表明BMP-3b在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，以自分泌方式調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化，并作為獨(dú)特的非共價(jià)復(fù)合物由脂肪細(xì)胞分泌，在調(diào)節(jié)小鼠脂肪生成和代謝中具有重要作用[6-8]。GDF10基因多態(tài)位點(diǎn)與南德溫雜交肉牛和甘南牦牛的體斜長(zhǎng)、體高和胸圍生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)，可以作為牛生產(chǎn)性狀的候選分子標(biāo)記，為牛遺傳資源開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)[9-11]。

目前對(duì)于驢重要性狀的分子標(biāo)記主要集中在生長(zhǎng)，毛色、毛的長(zhǎng)短，乳用及皮用等性狀。Lai等研究結(jié)果表明德州驢肌肉組織中IGF1基因的表達(dá)量隨年齡增長(zhǎng)而降低。多態(tài)位點(diǎn)和單倍型組合關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，IGF1基因的2個(gè)突變位點(diǎn)與德州驢的生長(zhǎng)性狀有關(guān)[12]。Wang等發(fā)現(xiàn)TBX3基因內(nèi)含子2中g(shù).3624A>G SNP位點(diǎn)與德州驢體型性狀顯著相關(guān)[13]。ASIP、MC1R、KIT基因可作為毛色候選基因，將驢的毛色區(qū)分開來(lái)，可以作為驢品種鑒定和個(gè)體識(shí)別的重要依據(jù)[14-15]。運(yùn)用PCR-SSCP方法對(duì)疆岳驢PRLR基因側(cè)翼區(qū)進(jìn)行多態(tài)性分析，PRLR基因突變與泌乳性狀存在關(guān)聯(lián)性，可以作為疆岳驢乳用型選育的分子遺傳標(biāo)記之一[16]。

德州驢形成歷史悠久，以耐粗飼、抗病力強(qiáng)、飼料消耗較少、行動(dòng)靈活和善于運(yùn)輸而著稱，其體格高大，結(jié)構(gòu)勻稱，體質(zhì)緊湊、結(jié)實(shí)、方正，是我國(guó)重要的驢遺傳資源[17]。前期已有試驗(yàn)結(jié)果表明GDF10基因?qū)ε５纳L(zhǎng)性狀具有顯著影響，但是在驢中還缺乏該基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)研究。本研究以德州驢為研究對(duì)象，分析GDF10基因在德州驢群體中的遺傳多態(tài)性以及與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而得到與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的遺傳標(biāo)記，用于德州驢的分子標(biāo)記輔助選擇，并為育種提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

采集山東省東阿阿膠股份有限公司德州驢養(yǎng)殖基地440頭德州驢的血液樣品。并測(cè)量其生長(zhǎng)性狀的體尺數(shù)據(jù)，其中包括體高、體長(zhǎng)、胸圍、胸寬、胸深、管圍、尻長(zhǎng)、尻寬、尻高9個(gè)生長(zhǎng)性狀。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)苯酚—氯仿法從頸靜脈采集的血樣中提取DNA，并將DNA樣品保存于-80 ℃。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中驢公開的GDF10基因序列(登錄號(hào)：NW_014637621.1)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，并于北京擎科生物科技有限公司合成，引物相關(guān)信息見表1。

表1 驢GDF10基因PCR擴(kuò)增引物信息

1.3 PCR擴(kuò)增與基因分型

PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，包括：2xEs Taq Master Mix 6.25 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)群體遺傳學(xué)理論，計(jì)算基因型和等位基因頻率，應(yīng)用在線軟件(http://www.msrcall.com/)計(jì)算德州驢種群GDF10基因多態(tài)位點(diǎn)的純合度Ho(homozygosity)、雜合度He(heterozygosity)、有效等位基因數(shù)Ne(effective number of alles)和多態(tài)信息含量PIC(polymorphism information content)，并檢驗(yàn)SNP位點(diǎn)是否處于哈迪—溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡狀態(tài)。

利用SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析3個(gè)SNPs位點(diǎn)間的連鎖不平衡(LD)關(guān)系。并通過(guò)SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表明差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDF10基因SNPs位點(diǎn)篩選及質(zhì)譜分型結(jié)果

根據(jù)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GDF10基因的3′-UTR區(qū)域，外顯子和內(nèi)含子中共發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SNP位點(diǎn)，(g.2031481 A>G，g.2041898 A>G，g.2043035 C>T)，3個(gè)SNP位點(diǎn)均檢測(cè)到3種基因型，測(cè)序結(jié)果見圖1。

使用質(zhì)譜分型技術(shù)對(duì)檢測(cè)到的SNPs位點(diǎn)在德州驢群體中進(jìn)行基因型分型，g.2031481 A>G和g.2043035 C>T位點(diǎn)分型結(jié)果分別見圖2(a)和圖2(b)。

2.2 驢GDF10基因的群體遺傳參數(shù)分析

由表2可知，g.2031481A>G位點(diǎn)在母驢中的優(yōu)勢(shì)基因型為AG，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚，基因頻率為0.682，而在公驢中的優(yōu)勢(shì)等位基因型為GG，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚，基因頻率為0.722。g.2041898 A>G位點(diǎn)在母驢和公驢群體中的優(yōu)勢(shì)基因型均為AG，優(yōu)勢(shì)等位基因均為G，基因頻率分別為0.571，0.580。g.2043035 C>T位點(diǎn)在母驢和公驢群體中的優(yōu)勢(shì)基因型均為TC，優(yōu)勢(shì)等位基因均為T，基因頻率分別為0.547，0.521。3個(gè)SNPs位點(diǎn)均顯示突變后的基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，上述3個(gè)SNPs位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 德州驢GDF10基因型頻率、等位基因頻率及哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)

由表3可知，g.2031481 A>G位點(diǎn)上的遺傳參數(shù)純合度(Ho)的值大于雜合度(He)，PIC范圍在0.30左右，處于中度多態(tài)性。g.2041898 A>G位點(diǎn)純合度(Ho)的值均大于雜合度(He)，PIC范圍在0.30左右，處于中度多態(tài)性。g.2043035 C>T位點(diǎn)上純合度(Ho)的值均大于雜合度(He)，PIC范圍在0.30左右，處于中度多態(tài)性。

表3 德州驢GDF10基因群體遺傳參數(shù)

0.250.50。

2.3 GDF10基因多態(tài)的連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建

通過(guò)SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis)對(duì)德州驢GDF10基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果如圖2所示。在母驢和公驢中，rs2(g.2041898 A>G)和rs3(g.2043035 C>T)2個(gè)位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡(r2分別為0.681和0.792，均大于0.33)。

對(duì)GDF10基因的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，在本實(shí)驗(yàn)群體中各發(fā)現(xiàn)5個(gè)單倍型(frequency>0.03)，并標(biāo)記為Hap1-Hap5。母驢中優(yōu)勢(shì)單倍型為Hap5，頻率為0.304；而公驢中的優(yōu)勢(shì)單倍型為Hap3，頻率為0.339。

表4 驢GDF10基因SNPs位點(diǎn)單倍型構(gòu)建

2.4 GDF10基因多態(tài)的基因型、單倍型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

將德州驢GDF10基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)的不同基因型與德州驢體高、體長(zhǎng)、胸圍、胸寬、胸深、管圍、尻長(zhǎng)、尻寬和尻高9個(gè)生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，在母驢中，g.2031481 A>G位點(diǎn)AA基因型個(gè)體的尻高顯著高于GA基因型個(gè)體(P<0.05)；g.2041898 A>G位點(diǎn)AA基因型個(gè)體的體高和尻長(zhǎng)顯著高于GA基因型個(gè)體(P<0.05)；g.2043035 C>T位點(diǎn)CC基因型個(gè)體的尻長(zhǎng)顯著高于CT基因型個(gè)體(P<0.05)。在公驢中，除了g.2043035 C>T位點(diǎn)CC基因型個(gè)體的體高顯著低于CT基因型(P<0.05)，其余位點(diǎn)的基因型生長(zhǎng)性狀之間并沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

表5 GDF10基因SNPs位點(diǎn)與德州驢生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

目前，GDF10基因的研究結(jié)果較少，主要集中在一些疾病方面和骨骼發(fā)育方面。GDF10基因可以促進(jìn)中風(fēng)后神經(jīng)修復(fù)[18-19]，此外，這種基因可能充當(dāng)腫瘤抑制因子，并且該基因的表達(dá)降低與口腔癌有關(guān)[20]。GDF10基因在小鼠和人股骨組織中均有表達(dá)，并在成骨細(xì)胞分化中起重要作用，GDF10基因的缺失會(huì)影響胚胎顱骨的發(fā)育[4]。因此，GDF10基因在細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用，參與骨骼的發(fā)育和形成。已有研究報(bào)道GDF10基因與牛的生長(zhǎng)性狀有關(guān)，可以作為牛生長(zhǎng)發(fā)育的分子標(biāo)記。在GDF10基因家族的研究中，GDF-8 c.1231C>T多態(tài)性與Kielecka鵝在12周齡時(shí)的BW(體重)存在關(guān)聯(lián)[21]。GDF-8基因中的5′UTR區(qū)堿基對(duì)的插入缺失與山羊體高、胸寬指數(shù)顯著相關(guān)，特定基因型可能有利于山羊的標(biāo)記輔助選擇(MAS)[22]。GDF-9基因的單核苷酸多態(tài)性對(duì)羊的繁殖力性狀有影響，多見于產(chǎn)仔數(shù)方面[23-25]。但是目前為止，關(guān)于GDF10多態(tài)性與德州驢生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析未見報(bào)道。

本試驗(yàn)以GDF10基因?yàn)楹蜻x基因，對(duì)440頭德州驢進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，得到了3個(gè)SNPs位點(diǎn)。g.2031481 A>G位點(diǎn)突變產(chǎn)生2個(gè)等位基因A和G，3種基因型：AA、GA、GG，其中G為優(yōu)勢(shì)等位基因，而在母驢和公驢中的優(yōu)勢(shì)基因型不一致，母驢中的為AG，公驢中的為GG。g.2041898A>G位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因?yàn)镚，優(yōu)勢(shì)基因型為GA。而g.2043035 C>T位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因?yàn)門，優(yōu)勢(shì)基因型為CT。3個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因和基因型基本上為突變后的基因。3個(gè)位點(diǎn)的遺傳參數(shù)純合度均大于雜合度，且多態(tài)信息含量(PIC)均處于中度多態(tài)(0.25

已有較多的研究表明GDF10基因與骨骼發(fā)育有著重要作用，且與多個(gè)中國(guó)地方牛品種生長(zhǎng)性狀相關(guān)。通過(guò)對(duì)GDF10基因的3個(gè)SNPs位點(diǎn)和德州驢生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，在母驢中，g.2031481 A>G位點(diǎn)在尻高上表現(xiàn)出顯著性差異；g.2041898A>G位點(diǎn)在個(gè)體的體高和尻長(zhǎng)上表現(xiàn)出顯著性差異；g.2043035 C>T位點(diǎn)在尻長(zhǎng)上表現(xiàn)出顯著性差異。而在公驢中，只有g(shù).2043035 C>T位點(diǎn)顯著影響體高性狀。

GDF10基因多態(tài)性顯著影響德州驢的部分生長(zhǎng)性狀，可作為與德州驢產(chǎn)性狀有關(guān)的候選分子標(biāo)記，應(yīng)用于德州驢生產(chǎn)的分子標(biāo)記輔助選擇育種。

4 結(jié) 論

德州驢群體中GDF10基因的3個(gè)SNPs位點(diǎn)與部分生長(zhǎng)性狀(體高、尻高、尻長(zhǎng))有顯著的相關(guān)性，說(shuō)明GDF10基因可以作為生長(zhǎng)性狀分子輔助選擇的潛在遺傳標(biāo)記，以提高德州驢生長(zhǎng)性能。