吳俊頡 李光華 金方彭 趙靜霞 雷春云 高海濤 符世偉 周 睿 羅永新 薛紹偉 張文魁 冷 云 梁用本 馬春明 王 艷

(1. 云南省漁業(yè)科學研究院, 昆明 650224; 2. 玉溪市水產工作站, 玉溪 653100; 3. 澄江市水產工作站, 澄江 652599;4. 玉溪市撫仙湖管理局, 玉溪 653100)

鱇浪白魚(Anabarilius grahami)隸屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Culterinae)白魚屬(Anabarilius), 是撫仙湖特有的主要小型經濟型魚類之一, 其野生種質資源僅分布于云南省撫仙湖流域, 屬云南省六大名魚之一[1—3]。20世紀80年代鱇浪白魚產量約為(3—4)×105kg, 但因長期受到人類過度捕撈及外來物種引入等因素的影響,2004年產量銳減至不足1000 kg, 湖內野生種質資源曾一度趨于瀕危滅絕的邊緣[3—6]。為使鱇浪白魚野生種質資源得以恢復, 相關科研人員成功突破了人工繁殖技術[7,8]。隨后幾年, 云南省玉溪市撫仙湖管理局等部門連續(xù)在撫仙湖組織開展鱇浪白魚增殖放流活動, 截至2013年, 累計放流鱇浪白魚魚苗500余萬尾[9]。目前撫仙湖鱇浪白魚種質資源和遺傳多樣性處于什么水平及應當如何指導今后的增殖放流工作是目前非常值得關注的問題。

目前, 分子生物學方法評價物種群體遺傳分化和系統(tǒng)進化已經成為必要手段[10—12]。線粒體DNA(mtDNA)具有母系遺傳、結構簡單和進化速率快等特點, 被廣泛用于水生動物系統(tǒng)發(fā)育分析和群體遺傳研究[11,13]。其中, 線粒體D-loop控制區(qū)在物種進化過程中, 展現(xiàn)出變異速率快等優(yōu)點, 已在分子系統(tǒng)分類及遺傳結構評估等研究中被廣泛使用[14]。2008年, 楊君興等[15]利用D-loop分析了撫仙湖明星魚洞和牛摩村2個野生群體, 兩群體間基因交流明顯。2011年, 劉紅艷等[4]對29尾野生鱇浪白魚和養(yǎng)殖群體mtDNA Cytb進行分析, 檢測到較低的核酸多樣性和較高的單倍型多樣性。但早期研究均存在野生群體單一和樣本數量少等的問題; 此外, 隨著人工增殖放流和撫仙湖保護行動的逐年深入, 想必鱇浪白魚種質資源也隨之發(fā)生了重大的變化。面對這些亟須了解的問題, 本研究基于鱇浪白魚mtDNA D-loop控制區(qū)序列分析, 對2020年4月采捕的7個地理群體共133尾鱇浪白魚的種質資源遺傳多樣性進行評估, 以期為該物種提供遺傳多樣性基礎性資料, 并為其種質資源保護和新種質創(chuàng)制提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2020年4月采集撫仙湖西岸: 路岐(LQ)、祿充(LC)、明星漁洞(MX), 及東岸: 象山(XS)、太陽山(TY)、海鏡(HJ)和下壩(XB)共計7個地理群體鱇浪白魚133尾, 野生群體樣品采集地見圖 1。每尾魚剪取部分尾鰭, 保存于無水乙醇中–20℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 鱇浪白魚采樣點圖Fig. 1 Location of sampling sites at Fuxian Lake

1.2 基因組DNA提取

鱇浪白魚基因組DNA抽提采用醋酸銨沉淀法,具體步驟參照彭敏等[16]和吳俊頡[17]的操作。DNA抽提過程中避免核酸成分污染, 最大程度減少DNA降解。抽提和純化的DNA經Nase-free water充分溶解后, 利用NanoDrop2000紫外分光光度計進行DNA質量和濃度測定, DNA濃度稀釋至100 ng/μL后, 置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及測序

依據GenBank上已提交的鱇浪白魚線粒體基因組序列(Accession ID: MF370204.1)設計D-loop控制區(qū)全長擴增引物(引物序列為: kl-dloop-F: 5′-CCCTACATCATCATCGGACA-3′; kl-dloop-R: 5′-GGGGTTGCGGAGACTTG-3′)。選用擎科生物金牌高保真Mix作為PCR擴增酶, 根據產品說明書,PCR反應體系為25 μL, 其中Mix(金牌mix)23 μL,正、反向引物各0.5 μL(10 μmol/L); PCR反應程序為: 98℃預變性2min, 98℃變性10s, 57.5℃退火15s,72℃延伸18s, 35個循環(huán), 延伸72℃3min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 將目的條帶單一且清晰的PCR產物送至擎科生物科技有限公司進行純化及測序, 為保證序列準確性, 所有測序反應均采用雙向測序。

1.4 數據分析

將測序得到的鱇浪白魚D-loop正、反向序列結果(.ab1)導入DNAstar seqman軟件, 手動調整不一致序列后進行拼接[18]。使用MEGA 6.0 MUSCLE算法進行序列同源性比對并根據地理群體對數據集分組, 進行核酸組成、轉換/顛換比、種群內部及地理群體之間Kimura-雙參遺傳距離分析[19,20]。通過Dnasp5.0統(tǒng)計鱇浪白魚D-loop變異位點和單倍型數目、計算單倍型多樣性指數(Hd)和多態(tài)位點核苷酸多樣性指數(π)等主要遺傳多樣性參數[21], 通過Arlequin 3.11軟件估算遺傳分化參數(Fst); 利用Tajima’sD及Fu’sFs中性檢驗及核酸錯配分析判定鱇浪白魚群體歷史動態(tài)[22,23]; 通過分子方差(Analysis of Molecular Variance, AMOVA)分析群體間及群體內變異程度[24]。使用jModelTest 2.1.7評估核酸替代模型[25], 并將BIC結果導入MrBayes V3.2.7,以長江水系的雅礱白魚(Anabarilius liui yalongensis)和短臀白魚(Anabarilius brevianalis)作為外群,構建鱇浪白魚單倍型貝葉斯系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 鱇浪白魚mtDNA序列分析

本研究采集撫仙湖路岐LQ(23尾)、祿充LC(20尾)、明星魚洞MX(17尾)、下壩XB(15尾)、海鏡HJ(21尾)、象山XS(17尾)和太陽山TY(20尾)7個群體, 共計133尾鱇浪白魚。PCR擴增獲得D-loop控制區(qū)全長序列為936 bp, 所有群體中腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)四種堿基含量分別32.74%、29.54%、22.79%和14.93%, A+T含量為62.28%, C+G含量為37.72%。共檢測到40個核酸變異位點(4.3%), 包括單核苷酸變異位點13個, 簡約信息位點27個, 變異位點在鱇浪白魚線粒體Dloop區(qū)均勻分布。轉換和顛換在4種堿基間存在,A-G轉換(45.28%)顯著高于C-T轉換(21.62%), AC顛換(13.3%)顯著多于A-T(7.21%)、T-G(5.99%)和C-G(6.59%), 轉換/顛換比(Ts/Tv)為1.81。

2.2 鱇浪白魚mtDNA單倍型及遺傳多樣性分析

使用DnaSp V5對鱇浪白魚7個群體133個個體mtDNA D-loop進行遺傳多樣性分析, 共發(fā)現(xiàn)單倍型36個, 單倍型多樣性指數(Hd)為0.791±0.036, 核酸多樣性指數(π)為0.00254±0.00027。7個鱇浪白魚地理群體單倍型多樣性指數(Hd)在0.657—0.846, 核酸多樣性指數(π)在0.00204—0.0031。各群體單倍型多樣性指數(Hd)與核酸多樣性指數(π)大致呈正比, 且均呈現(xiàn)出高單倍型多樣性、低核酸多樣性,即“高Hd低π”的遺傳多樣性特征; 與之前楊博等的研究(Hd=0.964—1,π=0.00339—0.00362)[15]相比, 撫仙湖鱇浪白魚整體遺傳多樣性有所下降; 撫仙湖西岸群體(Hd=0.826—0.846,π=0.00236—0.0031)較東岸群體(Hd=0.657—0.805,π=0.00204—0.00271)遺傳多樣性呈現(xiàn)出“西高東低”的分布特征, 位于西岸的明星漁洞MX(Hd=0.846±0.089,π=0.00236±0.00061)和路岐LQ群體(Hd=0.842±0.07,π=0.0031±0.00076)單倍型多樣性指數和核酸多樣性指數較高; 位于東岸的下壩XB群體(Hd=0.657±0.138, 0.00204±0.00056)遺傳多樣性水平最低, 可能與近年來鱇浪白魚增殖放流主要集中在撫仙湖東岸有關(表 1)。

表1 撫仙湖鱇浪白魚7個地理群體遺傳多樣性參數Tab. 1 The genetic diversity parameters of 7 Anabarilius grahami geographical populations from Fuxian Lake

133尾鱇浪白魚個體mtDNA D-loop共定義36個單倍型, 包括19個獨有單倍型及17個共享單倍型。其中, 單倍型Hap 1被鑒定到59次, 頻率最高(44.36%), 且為7個群體共享, 可能為祖先主體單倍型, 3個單倍型(Hap 2、Hap 7和Hap 21)為5個群體共享, 2個單倍型(Hap 6和Hap 11)被4個群體共享,1個單倍型(Hap 16)被3個群體共享, 7個單倍型(Hap 8、Hap 10、Hap 14、Hap 15、Hap 22、Hap 27和Hap 28)被2個群體共享。海鏡HJ群體含有4個特異單倍型(Hap 3—5、Hap 9), 祿充LC群體含有2個特異單倍型(Hap 12—13), 路岐LQ群體含有4個特異單倍型(Hap 17—20和Hap23), 明星魚洞MX群體有3個特異單倍型(Hap 24—26), 太陽山TY群體有3個特異單倍型(Hap 29—31), 下壩XB群體有2個特異單倍型(Hap 32—33), 象山XS群體有3個特異單倍型(Hap 34—36; 表 2和圖 2)。

圖2 鱇浪白魚單倍型網絡結構Fig. 2 Haplotype network structure of Anabarilius graham彩色圓圈面積表示單倍型頻率; 彩色區(qū)域表示在各單倍型中不同地理群體所占比例; 黑色圓點表示缺失單倍型The portion of circle represents frequency; the colored portion represents the proportion of each population in each haplotype; the black dot represents missing haplotypes

表2 撫仙湖鱇浪白魚7個地理群體單倍型分布Tab. 2 Haplotype distribution of 7 Anabarilius grahami geographical populations from Fuxian Lake

2.3 鱇浪白魚群體mtDNA D-loop遺傳距離及遺傳分化分析

在MEGA 6.0中, 基于Kimura雙參數遺傳距離法(Kimura 2-parameter)進行7個鱇浪白魚地理群體間和群體內部遺傳距離評估。結果顯示, 群體間遺傳距離在0.00215—0.00296, 路岐LQ與海鏡HJ群體遺傳距離最遠(0.00296), 象山XS和下壩XB群體遺傳距離最近(0.00215); 組間遺傳距離在0.00204—0.0031, 路岐LQ群體組內遺傳距離最大(0.0031), 下壩XB群體組內遺傳距離最小(0.00204; 表 3)。

采用Arlequin V 3.5進行鱇浪白魚群體間遺傳分化系數(Fst)分析, 分析結果表明, 7個地理群體兩兩之間遺傳分化指數(Fst)均為不顯著負值, 說明群體間不存在顯著遺傳分化(表 3)。

表3 撫仙湖7個鱇浪白魚地理群體遺傳距離與遺傳分化指數Tab. 3 The pairwise Fst of 7 Anabarilius grahami geographical populations from Fuxian Lake

采用Arlequin V 3.5對鱇浪白魚群體進行分子變異方差分析(AMOVA)。結果表明, 東西組間、組內和群體內部自由度(df)分別為1、5和126, 東西組間、組內和群體內部遺傳變異分別為0.3%、101.95%和–1.95%, 表明鱇浪白魚遺傳變異主要存在于群體內部(表 4)。

表4 撫仙湖7個鱇浪白魚地理群體組間、組內和群體內部分子方差分析Tab. 4 The AMOVA statistics of 7 Anabarilius grahami geographical populations from Fuxian Lake

2.4 鱇浪白魚群體系統(tǒng)發(fā)育與遺傳學關系分析

通過MrBayes V3.2.7對7個鱇浪白魚地理群體36個單倍型以及長江水系的雅礱白魚(Anabarilius liui yalongensis)和短臀白魚(Anabarilius brevianalis)作為外群構建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹顯示作為外群的雅礱白魚和短臀白魚聚為一支, 撫仙湖各群體的鱇浪白魚單倍型并未體現(xiàn)出與地理群體相應的譜系關系, 表明鱇浪白魚各群體間可能存在廣泛的基因交流, 群體間遺傳分化程度較低(圖 3)。

圖3 基于鱇浪白魚D-loop單倍型序列的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The Bayesian phylogenetic tree of Anabarilius grahami Dloop haplotypes分支節(jié)點左上角數字代表貝葉斯后驗概率The number upper left corner of node presents the Bayesian posterior probability

2.5 鱇浪白魚群體歷史動態(tài)分析

通過Tajima’sD和 Fu’sFs檢測及核酸錯配分布對鱇浪白魚群體進行中性檢測。總群體Tajima’sD檢測結果(Tajima’sD=–1.73617,P=0.03729)雖然為顯著負值, 但Fu’sFs檢驗(Fu’sFs=–1.64259,P=0.22771)結果均為不顯著負值(表 5)。通常認為,較Tajima’sD檢驗, Fu’sFs檢驗對種群歷史擴增事件的檢測準確度更高, 當Fu’sFs檢驗為不顯著而Tajima’sD為負值時符合中性進化[26,27], 說明鱇浪白魚群體沒有發(fā)生過群擴增歷史事件。

表5 鱇浪白魚7個群體Tajima’s D和Fu’s FS中性檢驗Tab. 5 The Tajima’s D and Fu’s FS neutrality tests of 7 different geographical populations of Anabarilius grahami from Fuxian Lake

撫仙湖鱇浪白魚群體近期未經歷過大規(guī)模種群擴增事件, 符合中性進化。此外, 核酸錯配分布呈雙峰, 并未展現(xiàn)出單峰“泊松分布”, 亦支持以上結論(圖 4)。

圖4 鱇浪白魚核酸錯配分布Fig. 4 The nucleotide mismatch distribution of Anabarilius graha

3 討論

鱇浪白魚, 俗稱抗浪魚, 其肉質細嫩味美, 為云南名貴魚類之一。在20—30年前, 撫仙湖外來物種的引入, 種間競爭關系加劇, 局部水域水質惡化, 加之人工濫捕嚴重, 鱇浪白魚難以形成優(yōu)勢種群, 已達到瀕臨滅絕邊緣[28]。經多方努力, 鱇浪白魚人工繁殖和池塘人工養(yǎng)殖技術先后獲得突破, 一批鱇浪白魚養(yǎng)殖企業(yè)和基地在撫仙湖周邊建立[28]。由于鱇浪白魚僅分布于撫仙湖流域, 養(yǎng)殖企業(yè)通常定期沿湖采捕野生鱇浪白魚個體(捕撈地點不固定), 人工馴養(yǎng)后作為親本開展人工繁殖, 子代通常于第二年由相關管理部門組織集中放歸撫仙湖。據玉溪市撫仙湖管理局資料記載, 近幾年, 鱇浪白魚人工增殖放流地點多集中在撫仙湖東岸和北岸[28]。本文通過沿湖采集7個地理群體共133尾鱇浪白魚的種質資源遺傳多樣性評估, 發(fā)現(xiàn)鱇浪白魚展現(xiàn)出高單倍型多樣性、低核酸性的遺傳多樣性特征; 其群體間遺傳分化不顯著。

3.1 鱇浪白魚mtDNA D-loop控制區(qū)核酸序列分析

動物線粒體基因組具有較高的突變性[29,30], 其中, D-loop控制區(qū)更為活躍, 具有進化速率最快, 符合中性進化原則等優(yōu)點, 適合于遺傳分化以及系統(tǒng)發(fā)育分析[31—34]。本研究測定了來自7個地理群體133尾鱇浪白魚mtDNA D-loop控制區(qū)序列, 共獲得936 bp D-loop區(qū)全長序列。其中, A+T堿基含量為62.28%, 高于C+G堿基含量(37.72%), 且各群體堿基差異較小。楊博等[15]對鱇浪白魚明星魚洞和牛摩村兩個群體進行mtDNA D-loop區(qū)序列進行分析,結果表明A+T含量為62.8%, 與本研究結果基本一致。而這種高 A/T的堿基偏好很可能是D-loop區(qū)快速進化造成的, 這一觀點在其他魚類中也有體現(xiàn)[35]。

3.2 鱇浪白魚7個地理群體遺傳多樣性分析

本研究分析結果表明, 7個地理群體133尾鱇浪白魚個體存在36個單倍型, 明星魚洞(MX)群體共17尾個體, 存在11個單倍型, 與之前的研究基本一致[15]。在動物遺傳多樣性研究中, 單倍型多樣性指數(Hd)和核酸多樣性指數(π)通常作為評估群體遺傳多樣性的重要指標[36,37]。在本研究中, 7個鱇浪白魚地理群體均出現(xiàn)了較高的單倍型遺傳多樣性(Hd=0.657—0.846)和相對較低的核酸多樣性(π=0.00204—0.0031), 呈現(xiàn)出一種mtDNA“高Hd低π”模式。形成 “高Hd低π”遺傳進化特征的原因可能主要歸結于: 第四紀冰期來臨之際, 全球氣溫急劇下降, 和其他灘涂魚類一樣[38,39], 鱇浪白魚種群數量可能經歷了急劇收縮, 致使低頻等位基因的大量丟失。伴隨上新世氣候回暖, 撫仙湖浮游生物大量繁殖豐富, 非常適合植食性魚類生長和繁衍[40], 鱇浪白魚屬植食性小型魚類, 很有可能在這一時期快速繁衍, 種群數量在一定程度上得以恢復。在這一過程中, 雖然突變得以積累, 群體單倍型數量有所提高, 但是DNA變異所需經歷的時間通常要遠遠長于單倍型數量變化的時間[38,39,41], 因而形成了“高Hd低π”的進化特征。

本研究(Hd=0.657—0.846,π=0.00204—0.00236)與較楊博等[15]的研究(Hd=0.964—1,π=0.00204—0.0031)比較發(fā)現(xiàn), 目前撫仙湖鱇浪白魚整體遺傳多樣性降低。這可能歸結為以下三方面原因: (1)早期楊博等[15]關于鱇浪白魚遺傳多樣性研究僅選擇2個地理群體,所用鱇浪白魚野生群體數較少; (2)20世紀80至90年代, 隨著人類在撫仙湖沿岸的活動(過渡捕撈和沿岸建筑修建), 加之外來物種的引入(太湖新銀魚[42]),壓縮了鱇浪白魚生境。這種外部環(huán)境帶來的進化壓力, 通常會導致魚類野生種群基因多樣性的降低和低頻等位基因的丟失[38], 致其遺傳多樣性丟失;(3)近年來開展鱇浪白魚人工增殖放流, 大量人工養(yǎng)殖群體進入撫仙湖(2007—2011年向撫仙湖投放人工繁殖鱇浪白魚共計365萬尾[28]), 人工養(yǎng)殖群體由于近親雜交和遺傳漂變等因素的影響, 養(yǎng)殖群體通常會丟失某些位點等位基因, 致使遺傳多樣性普遍低于野生群體[5,43]。

值得注意的是, 本研究發(fā)現(xiàn)撫仙湖東、西兩岸鱇浪白魚遺傳多樣性呈現(xiàn)出“西高東低”的分布特征。這可能是因為西岸路岐、祿充和明星漁洞一帶湖水水體較深, 水下巖石溶洞分布較多, 為鱇浪白魚群體提供了絕佳棲息地, 遺傳基礎得以大量保留; 此外, 據玉溪市撫仙湖管理局資料記載, 近幾年, 鱇浪白魚人工增殖放流地點多集中在撫仙湖東岸和北岸[28], 這也可能促使撫仙湖鱇浪白魚東岸太陽山(TY)和海鏡(HJ)群體, 北岸象山(XS)和下壩(XB)群體遺傳多樣性下降。

3.3 鱇浪白魚群體遺傳距離及遺傳分化

遺傳分化指數(Fst)是一個通常被用于評估群體之間遺傳分化程度的重要參數[44]。在本研究中, 鱇浪白魚各群體間遺傳分化指數(Fst)較小且均不顯著, 表明各群體間并未出現(xiàn)遺傳分化。此外, 單倍型貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型網絡也支持此觀點。AMOVA分析發(fā)現(xiàn), 變異主要來源于群體內部。造成鱇浪白魚地理群體間遺傳分化不顯著的主要原因一方面歸結于鱇浪白魚生活史特征[45]: 鱇浪白魚為營溪流魚類, 喜居于水流較大的沿岸淺水區(qū), 產卵場主要分散分布于沿岸出水口及有水流沖擊的潛水石灘。因而, 成魚可能隨著撫仙湖水流變化而呈現(xiàn)“隨波逐流”的分布趨勢。這種擴散式生活史導致了鱇浪白魚不同地理群體間的交配, 致使群體間基因交流頻繁, 遺傳分化水平低; 另一方面,自鱇浪白魚人工放流以來, 大量人工養(yǎng)殖群體的加入, 也是群體遺傳結構單一, 群體間遺傳分化程度較低的因素之一。此觀點在巖原鯉遺傳多樣性研究中亦得到證實[41]。

3.4 鱇浪白魚種群保護

鱇浪白魚是云南省撫仙湖特有的珍惜土著魚種, 20世紀90年代, 撫仙湖鱇浪白魚產量銳減, 種質資源岌岌可危。隨著近十年來人工增殖放流工作的程序化開展和撫仙湖治理工作的逐步深入, 其群體數量在撫仙湖中已開始逐漸恢復, 對于其種質資源保護意義重大。然而, 目前粗放式的人工增殖放流也在一定程度上制約鱇浪白魚遺傳多樣性的恢復。因而, 在加強漁業(yè)資源監(jiān)管的同時, 應在已有人工養(yǎng)殖群體的基礎上, 篩選遺傳多樣性較高的優(yōu)良個體作為親本, 建立更為科學、系統(tǒng)的人工繁殖與放流技術體系。

遺傳突變是物種進化的基礎, 豐富的遺傳多樣性可以在很大程度上維持物種的種群數量和環(huán)境適應能力[46]。目前, 線粒體DNA及核基因技術在評估魚類遺傳多樣性、探索其進化和系統(tǒng)發(fā)育方面已被廣泛運用[47]。線粒體DNA分子標記具有分子結構簡單、母系遺傳、進化速率快和拷貝數量多等特點[11,29,47]。核基因評價物種遺傳多樣性技術通常采用限制性內切酶片段長度多態(tài)性分子標記(RFLP)、隨機擴增多態(tài)特性分子標記(AFLP)和簡單序列重復(SSR)分子標記等在內的多種分子標記[47]。因為不同分子標記通常是從不同角度和層面去揭示遺傳相關信息, 所以線粒體DNA與核基因標記的聯(lián)合使用應該能更為充分、準確地反應魚類遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育特征[48]。本研究利用線粒體DNA開展了撫仙湖鱇浪白魚遺傳多樣性現(xiàn)狀的初步評估, 后續(xù)研究將聯(lián)合使用核基因標記和基因組重測序等技術, 針對鱇浪白魚遺傳多樣性、白魚屬魚類系統(tǒng)進化、物種形成與分化等內容開展更為深入的研究工作, 以期為鱇浪白魚種質資源保護及種業(yè)開發(fā)提供重要理論依據。