何乃娟 阮國(guó)良 劉玉林 方 劉 王 乾 付運(yùn)銀 李生瑄 李青松
(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心, 荊州 434025)
克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)俗稱小龍蝦,具有適應(yīng)性廣、食性雜、繁殖力強(qiáng)、易飼養(yǎng)和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1], 是我國(guó)當(dāng)前養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)淡水甲殼類動(dòng)物[2]。但是, 在長(zhǎng)江中下游等地的蝦-稻共作與池塘精養(yǎng)中, 克氏原螯蝦在夏季養(yǎng)殖過程中極易受到持續(xù)性的高溫脅迫, 如在江漢地區(qū)的蝦-稻共作系統(tǒng)中其7月份的平均水溫和瞬時(shí)水溫分別高達(dá)31.4℃和39.7℃[3]。克氏原螯蝦生長(zhǎng)的最佳水溫為21—27℃[4—6], 高溫脅迫可引起該蝦代謝失衡和免疫紊亂從而最終影響其正常生長(zhǎng)甚至存活[7,8]。不僅如此, 一些研究表明高溫脅迫對(duì)螯蝦類動(dòng)物的生存、攝食、生長(zhǎng)、繁殖及抗逆性等均可造成廣泛的負(fù)面影響[9—12]。然而, 在目前有關(guān)蝦類及魚類高溫脅迫研究中, 多是采用急性試驗(yàn)的方法[7,8,13—15], 較長(zhǎng)周期的高溫脅迫試驗(yàn)不僅更能反映機(jī)體對(duì)環(huán)境壓力的真實(shí)響應(yīng), 而且更符合養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)際[9]。為此, 本試驗(yàn)以克氏原螯蝦為對(duì)象, 通過1℃/d的緩慢升溫后研究不同高水溫的長(zhǎng)期脅迫對(duì)該蝦生長(zhǎng)、消化及免疫功能的影響, 旨在探明該蝦對(duì)持續(xù)高溫脅迫的適應(yīng)性及響應(yīng)機(jī)制從而為其健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。
克氏原螯蝦幼蝦[均重(7.19±0.29) g, 均長(zhǎng)(5.94±0.19) cm]由荊州市萬(wàn)金小龍蝦養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供, 試驗(yàn)蝦在室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)的養(yǎng)殖缸(60 cm×40 cm×35 cm)中暫養(yǎng)7d后進(jìn)行正式試驗(yàn)。暫養(yǎng)期間, 水溫保持在(24.0±1.5)℃, 溶解氧>5 mg/L, pH為7.0—8.5,光周期為光照12h﹕暗12h。每天(8:30和17:30)投喂商品配合飼料2次, 日投喂量為該蝦體重的3%。飼喂2h后, 用虹吸管吸出殘餌和糞便, 以曝氣自來(lái)水作為補(bǔ)充水源, 日換水量為1/3—2/3。
在暫養(yǎng)結(jié)束后, 將活力好、大小相近的克氏原螯蝦平均分為4組, 根據(jù)克氏原螯蝦生長(zhǎng)的適宜和熱脅迫溫度范圍, 設(shè)置高溫梯度水平為29℃、32℃和35℃, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)養(yǎng)殖22尾蝦, 試驗(yàn)開始時(shí)測(cè)量其體長(zhǎng)、體重。第1組(對(duì)照組)繼續(xù)保持暫養(yǎng)水溫24℃, 其他3個(gè)高溫脅迫組養(yǎng)殖缸的水溫以1℃/d的速度從24℃開始分別緩升至目標(biāo)溫度。各高溫脅迫組的溫度采用加熱棒進(jìn)行持續(xù)的恒溫控制。試驗(yàn)期間, 所有處理組的其他養(yǎng)殖條件保持一致, 各脅迫組在換水前將所換水充分曝氣并升至相應(yīng)的目標(biāo)溫度。持續(xù)高溫脅迫養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為30d, 試驗(yàn)結(jié)束后從各組取所需組織。
在試驗(yàn)結(jié)束后禁食24h, 對(duì)每組蝦進(jìn)行計(jì)數(shù)和體重、體長(zhǎng)測(cè)定, 并計(jì)算增重及特定生長(zhǎng)率。每個(gè)處理隨機(jī)取6尾蝦, 用1 mL無(wú)菌注射器從蝦圍心腔處抽取0.5 mL全血放入無(wú)菌EP管中, 4℃靜置過夜,于4℃、12000 r/min離心15min, 取上清置于–80℃保存?zhèn)溆? 然后, 迅速冰上解剖并取出肝胰腺、胃和鰓等組織放入無(wú)菌EP管和無(wú)酶EP管中–80℃保存, 分別用于酶活性及基因表達(dá)測(cè)定。
存活與生長(zhǎng) 每天觀察蝦的存活、攝食與生長(zhǎng)情況, 30d的養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)其存活率與生長(zhǎng)率。存活率(SR, %)=(Nt/N0)×100; 增重率(WGR,%)=(Wt–W0)/W0×100; 特定生長(zhǎng)率(SGR, %/d)=(lnWt–lnW0)/t×100; 餌料系數(shù)(FCR)=F/(Wt–W0)。式中,N0和Nt分別為試驗(yàn)開始時(shí)和結(jié)束后的活蝦數(shù)量(尾),W0和Wt分別為試驗(yàn)開始時(shí)和結(jié)束后的蝦體重(g),t為試驗(yàn)天數(shù)(d),F為投餌量。
血淋巴免疫指標(biāo)凍存血淋巴置于4℃冰箱解凍, 血藍(lán)蛋白(HC)含量用稀釋至1%的血淋巴采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定[16], 酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性均采用南京建成生物工程有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
消化酶活性及肝胰腺免疫指標(biāo)凍存組織于冰上解凍, 取其肝胰腺和胃各0.1 g, 加入0.9 mL預(yù)冷生理鹽水在冰水浴中用組織研磨機(jī)制成10%勻漿, 于4℃、3000 r/min離心10min, 取上清立即進(jìn)行3種消化酶、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)及丙二醛(MDA)的測(cè)定, 所有指標(biāo)均采用南京建成生物工程有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
基因表達(dá)取肝胰腺、鰓組織的總RNA并電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量, 使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒進(jìn)行mRNA的純化和cDNA的合成, cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。肝胰腺和鰓中熱應(yīng)激蛋白基因(HSP70)的表達(dá)水平由熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè), 內(nèi)參基因?yàn)?8S RNA。擴(kuò)增引物參照Guo等[8]HSP70F: 5′-GTTG ACCAAGATGAAGGAGAC-3′、HSP70R: 5′-CTGA CGCTGAGAGTCGTTG-3′和18S F: 5′-CTGTGATGC CCTTAGATGTT-3′、18S R: 5′-GCGAGGGGTA GAACATCCAA-3′, 引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。使用SYBR?Premix DimerEraser?Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)試劑盒在StepOnePlus Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行分析, 其反應(yīng)體系如下: SYBR?Premix DimerEraser(2×) 10 μL, cDNA模板10 ng, ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL, 10 μmol/L正反向引物各0.6 μL, 使用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊到20 μL; 反應(yīng)條件: 95℃ 30s, 95℃5s、56℃ 30s、72℃ 30s, 40個(gè)循環(huán)。HSP70基因的相對(duì)表達(dá)采用2–??Ct法進(jìn)行分析。
所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA)及多重比較(Duncan’s法), 分別以P<0.05和P<0.01表示差異顯著或極顯著。
在試驗(yàn)結(jié)束后, 4個(gè)處理組的平均成活率分別為100%、95.45%、79.55%和63.63%, 因而隨著持續(xù)脅迫溫度的升高克氏原螯蝦的存活率顯著下降(P<0.05)。如表 1所示, 克氏原螯蝦在為期30d的實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖條件下, 隨著脅迫溫度的升高其終末體重(FBW)、終末體長(zhǎng)(FBL)、WGR和SGR等均呈先升后降的趨勢(shì)且在29℃時(shí)均顯著高于其他3個(gè)溫度組(P<0.05); 32℃組與24℃對(duì)照組的各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05), 而35℃組的各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)與24℃對(duì)照組相比均顯著降低(P<0.05)。
表1 持續(xù)高溫脅迫對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能的影響Tab. 1 Effects of sustained high-temperature stress on growth performance of P. clarkii
如圖 1所示, 3種消化酶活性隨溫度的升高出現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。29℃高溫組的胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均達(dá)到峰值并顯著高于其他3個(gè)溫度組(P<0.05); 與24℃對(duì)照組相比, 32℃高溫組淀粉酶、脂肪酶的活性顯著升高(P<0.05)而胃蛋白酶活性無(wú)顯著變化(P>0.05), 35℃高溫組淀粉酶、脂肪酶的活性無(wú)顯著變化(P>0.05)而胃蛋白酶活性顯著下降(P<0.05)。
圖1 持續(xù)高溫脅迫對(duì)克氏原螯蝦消化酶活性的影響Fig. 1 Effects of sustained high-temperature stress on digestive enzyme activities of P. clarkii不同字母表示處理之間差異顯著(P<0.05); 下同Different small letters indicate significant difference (P<0.05); the same applies below
如圖 2所示, 各高溫組(29℃、32℃和35℃)HC含量(32℃除外)、ACP活性及AKP活性較24℃對(duì)照組均顯著降低(P<0.05); 在4個(gè)處理中, 隨著溫度的上升AST活性和ALT活性逐步顯著上升, 且在35℃時(shí)達(dá)到最高(P<0.05)。
圖2 持續(xù)高溫脅迫對(duì)克氏原螯蝦血淋巴非特異性免疫指標(biāo)的影響Fig. 2 Effects of sustained high temperature stress on nonspecific immune indices in hemolymph of P. clarkii
如圖 3所示, 29℃組的T-AOC活性顯著低于24℃對(duì)照組和32℃組(P<0.05)而其他三組的TAOC活性差異不顯著(P>0.05); 29℃組的T-SOD活性均顯著低于其他三組(P<0.05), 32℃組的T-SOD活性顯著高于24℃對(duì)照組而35℃組的T-SOD活性與24℃對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05); 丙二醛(MDA)含量隨溫度上升而逐步顯著升高(P<0.05)。
圖3 持續(xù)高溫脅迫對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響Fig. 3 Effects of sustained high-temperature stress on antioxidant indices in hepatopancreas of P. clarkii
如圖 4所示,HSP70基因在35℃時(shí)表達(dá)量最高且與其他三組的差異極顯著(P<0.01); 與對(duì)照組相比, 29℃時(shí)兩組織中HSP70基因表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)而32℃時(shí)該基因的表達(dá)無(wú)顯著上升(P>0.05)。
圖4 持續(xù)高溫脅迫后克氏原螯蝦不同組織HSP70基因的相對(duì)表達(dá)Fig. 4 The relative expression of of HSP70 gene in different tissues of P. clarkii after sustained high-temperature stress
在水生環(huán)境中, 溫度是影響蝦蟹等甲殼動(dòng)物生存、代謝、免疫和細(xì)胞生理反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)境因素之一[7,17], 而克氏原螯蝦作為一種變溫動(dòng)物, 對(duì)環(huán)境溫度變化的響應(yīng)尤為明顯[18]。本研究的數(shù)據(jù)顯示,脅迫溫度越高, 克氏原螯蝦的成活率越低; 當(dāng)克氏原螯蝦長(zhǎng)期處于29℃的溫度時(shí), 其生長(zhǎng)性能顯著高于其他組; 而32℃以上的持續(xù)高溫則對(duì)其生長(zhǎng)、消化均顯著不利。一些研究表明, 克氏原螯蝦幼體生長(zhǎng)發(fā)育的適宜溫度為25℃左右, 但最高不能超過30℃[5,19]; 謝偉[6]的養(yǎng)殖試驗(yàn)表明30℃高溫可一定程度的促進(jìn)該蝦幼蝦(初始均重5.42 g以上)的生長(zhǎng);Huner等[20]發(fā)現(xiàn)水溫高于30℃時(shí)克氏原螯蝦停止攝食, 高于32.2℃時(shí)則停止生長(zhǎng)。此外, 對(duì)紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)的70d養(yǎng)殖試驗(yàn)表明, 在16—32℃范圍內(nèi)該蝦的存活率均在90%以上, 且水溫28℃是其最適生長(zhǎng)溫度[21]。本研究中的最適生長(zhǎng)溫度與上述其他研究相一致, 但在此溫度下長(zhǎng)期生活的克氏原螯蝦存在較大的健康風(fēng)險(xiǎn)。
本研究顯示, 3種消化酶在29℃時(shí)表現(xiàn)出最大活性且顯著高于其他3個(gè)溫度組(P<0.05), 這表明該蝦的生長(zhǎng)與消化功能存在明顯的一致性。消化酶活性的高低代表機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的消化能力[22—24]且與攝食之間存在相互促進(jìn)的交互作用[23]。Croll和Watts[25]的研究顯示, 在8—32℃內(nèi)克氏原螯蝦的攝食率和排便率隨溫度上升而提高, 且在高溫下該蝦的攝食和排便比另一種原螯蝦屬的Procambarus zonangulus更加旺盛。因而, 在較高溫度條件下, 克氏原螯蝦可大量攝食并通過較高的消化酶活性分解主要營(yíng)養(yǎng)素而獲得較高生長(zhǎng)性能。另外在本研究中, 32—35℃引起3種消化酶活性的顯著下降, 這可能是由于過高的養(yǎng)殖水溫超出了機(jī)體的耐受范圍并引起代謝紊亂, 從而抑制了消化酶分泌及其活性[26]。
非特異性免疫系統(tǒng)是無(wú)脊椎動(dòng)物抵御脅迫的唯一防線[17]。甲殼類動(dòng)物的血藍(lán)蛋白兼具攜氧與免疫功能, 水溫升高不利于血藍(lán)蛋白與氧結(jié)合[27],外來(lái)脅迫可誘導(dǎo)血藍(lán)蛋白的酚氧化酶免疫活性和抗菌肽活性[27,28]。在本研究中, 當(dāng)克氏原螯蝦處于29℃及以上的高水溫時(shí)其血淋巴血藍(lán)蛋白含量顯著下降, 這表明持續(xù)高溫脅迫可能使該蝦血氧親和力與免疫功能同時(shí)受損。AKP和ACP是兩種重要的代謝調(diào)節(jié)酶[8], 其在甲殼動(dòng)物的非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[29,30]。一些研究顯示, 溫度升高會(huì)顯著降低克氏原螯蝦ACP和AKP活性, 從而損害蝦的免疫功能[31,32], 本研究結(jié)果表明隨著溫度上升血淋巴中的ACP和AKP活性顯著降低, 這與上述其他研究一致; 此外, 脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)[33]和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[34]中也有類似結(jié)果。
血淋巴中ALT和AST的活性可反映肝胰腺組織損傷程度[35], 在正常情況下肝胰腺中的ALT和AST僅少量釋放于血淋巴中, 但肝胰腺的組織病變可導(dǎo)致大量轉(zhuǎn)氨酶被釋放[36]。在本研究中, 克氏原螯蝦持續(xù)高溫組的血淋巴中ALT和AST活性較常溫組均顯著上升, 且其活性與水溫高低呈顯著正相關(guān)。這表明, 持續(xù)高溫脅迫可能使該蝦的肝細(xì)胞在受損后其膜的通透性增加, 從而導(dǎo)致這兩種轉(zhuǎn)氨酶大量逸出肝胰腺。
水生生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了抵御氧化損傷的抗氧化系統(tǒng)[14,37], 過量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的產(chǎn)生會(huì)激活機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)從而導(dǎo)致抗氧化酶類成分發(fā)生改變[38,39]。脂質(zhì)過氧化物(Lipid peroxide, LPO)被認(rèn)為是ROS氧化脂質(zhì)的產(chǎn)物之一[40], MDA是脂質(zhì)過氧化代謝終產(chǎn)物, 其含量高低作為氧化損傷的指標(biāo), 可反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞的受自由基攻擊程度及受損的嚴(yán)重程度[41];SOD是一種重要的抗氧化酶, 通過專一性催化超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為分子氧(O2)和過氧化氫(H2O2), H2O2再經(jīng)過氧化氫酶(Catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)等的催化生成水和O2從而使活性氧自由基得以清除;T-AOC是衡量所有酶促抗氧化劑(如SOD、CAT和GPx)累計(jì)作用的一個(gè)總體表現(xiàn)指標(biāo)[42,43]。一些關(guān)于螯蝦的其他脅迫研究表明, 窄爪螯蝦(Astacus leptodactylus)在長(zhǎng)期饑餓過程中其SOD活性與MDA水平分別顯著下降和顯著上升[38], 而克氏原螯蝦在環(huán)境毒物有機(jī)硅處理后其肌肉中的SOD活性與MDA水平呈不同程度的上升[44,45]。本研究結(jié)果顯示, 肝胰腺的總抗氧化能力(T-AOC)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性在29℃時(shí)最低且在35℃時(shí)也略低于常溫組; 持續(xù)脅迫溫度越高其MDA水平也顯著越高。因此, 遭受環(huán)境脅迫的螯蝦類會(huì)啟動(dòng)氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致MDA水平上升。但是, SOD活性的升降可能與脅迫的類型、條件和程度等有關(guān),Guo等[8]的急性高溫脅迫試驗(yàn)結(jié)果顯示, 克氏原螯蝦在6—48h內(nèi)其SOD活性顯著升高, 但在72h時(shí)恢復(fù)正常水平。然而, 從本研究的總體結(jié)果可初步推斷, 持續(xù)高溫應(yīng)激導(dǎo)致了克氏原螯蝦抗氧化應(yīng)激能力下降與MDA有害物在體內(nèi)的積累。
HSP70通過促進(jìn)內(nèi)源性過氧化物酶活性來(lái)應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激[46], 從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷[47]。已有研究表明, 該基因的表達(dá)主要由熱處理誘導(dǎo)所致[48]。高溫脅迫可導(dǎo)致蝦體內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)含量增加, 從而引發(fā)HSP70基因的過表達(dá), 而被溫度誘導(dǎo)的熱應(yīng)激蛋白最終用以修復(fù)因高溫脅迫損傷的蛋白質(zhì)[49]。在適宜溫度條件下螯蝦HSP70基因的表達(dá)量較低, 但高溫環(huán)境下會(huì)使其表達(dá)量顯著升高[8,50]; Mohamad等[47]在對(duì)羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)進(jìn)行30d的高溫脅迫處理后,發(fā)現(xiàn)其肝胰腺中HSP70基因的表達(dá)量在35℃時(shí)較28℃顯著上升。在本研究中, 肝胰腺和鰓組織中HSP70基因在29℃時(shí)顯著上升, 且在35℃時(shí)其表達(dá)量顯著高于其他處理組, 這與上述其他的研究結(jié)果類似。因此可以推斷,HSP70表達(dá)升高可能是克氏原螯蝦響應(yīng)水溫升高的一種應(yīng)激保護(hù)機(jī)制。
綜上所述, 相比于24℃的適宜生活溫度, 29℃的持續(xù)高溫雖可顯著促進(jìn)克氏原螯蝦的生長(zhǎng)與消化, 但對(duì)其免疫及抗氧化功能顯著不利, 而32℃以上的持續(xù)高溫脅迫則對(duì)其存活、生長(zhǎng)與消化、免疫及抗氧化功能均造成顯著的負(fù)面影響。為此, 在夏季的養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 有必要對(duì)持續(xù)高溫的養(yǎng)殖水環(huán)境進(jìn)行有效的綜合調(diào)控, 如采取加深水位、監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)水質(zhì)、維護(hù)良好的水草生態(tài)空間等生態(tài)措施以降低克氏原螯蝦的棲息水溫; 同時(shí), 通過營(yíng)養(yǎng)免疫和精準(zhǔn)投喂等營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方式來(lái)提高該蝦對(duì)持續(xù)高溫脅迫的免疫抵御能力。