周穎 張謝 許豐 馬燕燕 吳俊男 邵初曉

急慢性肝損傷的患者常常存在腸道菌群失調(diào)，表現(xiàn)為菌群多樣性及雙歧桿菌等益生菌數(shù)量明顯減少，而腸球菌、腸桿菌及厭氧梭菌等致病菌的數(shù)量顯著増多[1]。有研究顯示，益生菌對(duì)肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其中乳桿菌亞種如鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用[2]。干酪乳桿菌屬于乳桿菌屬，常和嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌并稱為“健康三益菌”。研究表明干酪乳桿菌具有降低膽固醇、免疫調(diào)節(jié)等作用，還能改善乳糖不耐受、緩解過(guò)敏[3-4]，但目前還鮮有干酪乳桿菌是否對(duì)急性肝損傷具有保護(hù)作用的報(bào)道。因此，本研究擬探究干酪乳桿菌培養(yǎng)上清液（lactobacillus casei-supernatants,LC-cs）對(duì)四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取美國(guó)癌癥研究所（Institute of Cancer Research,ICR）培育的雄性ICR小鼠24只，無(wú)特定病原體級(jí)，8周齡，體重20～25 g。由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)在12 h的光/暗循環(huán)條件下，維持25℃的飼養(yǎng)環(huán)境。

1.1.2 干酪乳桿菌培養(yǎng) 干酪乳桿菌購(gòu)自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。將干酪乳桿菌種子液接種于番茄汁培養(yǎng)基中，40～42℃培養(yǎng)16～20 h后置于2～6℃培養(yǎng)12～16 h。培養(yǎng)液離心，收集上清液并用膜過(guò)濾器分離過(guò)濾，得到細(xì)胞外代謝物，即LC-cs。

1.1.3 主要試劑和儀器 CCl4購(gòu)自上海麥克林生物科技有限公司；ALT、AST試劑盒購(gòu)自南京建城生物工程研究所；丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）及脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL） 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1,HMGB1）、TNF-α 和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B cell lymphoma 2,Bcl-2）、Bcl-2相關(guān) X 蛋白（Bcl-2 associated X protein,BAX）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein 78,GRP78）、活化轉(zhuǎn)錄因子 6（activating transcription factor 6,ATF6）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；NF-E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；山羊抗鼠和山羊抗兔IgG-HRP二抗均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司；Trizol RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量q-PCR試劑盒均購(gòu)自北京寶日醫(yī)生技術(shù)有限公司。激光共聚焦顯微鏡（Ti-U型）購(gòu)自日本Nikon公司；高速低溫離心機(jī)（micro21R型）購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；凝膠成像系統(tǒng)（chemidoc XRS+型）購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；熒光定量PCR（Light Cycler 480Ⅱ型）購(gòu)自瑞士羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型制備 將24只小鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為CCl4組、LC-cs+CCl4組和對(duì)照組，每組8只。LC-cs+CCl4組小鼠用加有LC-cs的飲用水喂養(yǎng)2周，保證小鼠攝入LC-cs 1 ml/d，另兩組用普通飲用水；2周后LC-cs+CCl4組和CCl4組腹腔注射用玉米油稀釋為0.2%的CCl4 10 ml/kg以誘導(dǎo)急性肝損傷，對(duì)照組小鼠用玉米油（10 ml/kg）腹腔注射。所有操作均符合溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)機(jī)構(gòu)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定。

1.2.2 小鼠急性肝損傷評(píng)估 腹腔注射24 h后對(duì)小鼠稱重，采用水合氯醛麻醉，經(jīng)眶靜脈留取外周血，處死小鼠后留取肝臟組織并稱重。計(jì)算各組小鼠的肝臟指數(shù)（肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/小鼠體重）。外周血離心后取血漿，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定小鼠血漿ALT、AST和HMGB1水平。取小鼠肝臟組織約4 g，用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm切片后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變。

1.2.3 小鼠肝臟組織炎癥因子測(cè)定 采用ELISA法按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝臟組織中IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平，RT-PCR法測(cè)定肝臟組織中IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)時(shí)先用Trizol一步法提取小鼠肝臟組織總RNA，再按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物由上海生物工程股份有限公司合成，序列見表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)的引物序列

1.2.4 小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL試驗(yàn)檢測(cè)肝臟組織凋亡細(xì)胞，根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書操作，在熒光顯微鏡下觀察。采用Western blot法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2表達(dá)情況。具體步驟如下：二喹啉甲酸法測(cè)定肝臟組織總蛋白濃度，蛋白變性后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，3%胎牛血漿白蛋白封閉液，室溫孵育1 h，加入一抗（1∶1 000），4 ℃封閉過(guò)夜，棄一抗，用緩沖液洗 3遍；加入二抗（1∶10 000），室溫孵育 2 h后，棄二抗，緩沖液洗3遍，化學(xué)發(fā)光顯色劑顯色，曝光，測(cè)定蛋白表達(dá)量。

1.2.5 小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝臟組織GSH-Px、T-AOC、SOD及MDA水平。用Western blot法測(cè)定肝臟組織Nrf2蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 小鼠肝臟組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白測(cè)定 用Western blot法測(cè)定肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性肝損傷評(píng)估 小鼠肝臟指數(shù)及血漿ALT、AST、HMGB1水平比較見表2。小鼠肝臟組織病理學(xué)改變見圖1。

表2 小鼠肝臟指數(shù)及血漿ALT、AST、HMGB1水平比較

圖1 小鼠肝臟組織病理學(xué)改變（HE染色）

由表2可見，3組間小鼠肝臟指數(shù)及血漿ALT、AST、HMGB1水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。CCl4組小鼠肝臟指數(shù)、血漿ALT、AST和HMGB1水平均高于對(duì)照組，LC-cs+CCl4組小鼠上述指標(biāo)均低于CCl4組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

由圖1可見，CCl4組的肝臟組織出現(xiàn)了脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、小葉中心充血及壞死，LC-cs+CCl4組的肝損傷改變輕于CCl4組，而對(duì)照組小鼠肝臟組織病理學(xué)評(píng)估基本正常。

2.2 小鼠肝臟組織炎癥因子測(cè)定 見表3。

表3 小鼠肝臟組織炎癥因子測(cè)定

由表3可見，3組間小鼠肝臟組織IL-6和TNF-α蛋白及mRNA水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。CCl4組IL-6和TNF-α的蛋白及mRNA水平高于對(duì)照組，LC-cs+CCl4組IL-6和TNF-α蛋白及mRNA水平低于CCl4組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) TUNEL試驗(yàn)結(jié)果見圖2。小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白電泳圖見圖3，小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白表達(dá)水平見表4。

圖2 TUNEL試驗(yàn)結(jié)果

圖3 小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白電泳圖

表4 小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

由圖2可見，與對(duì)照組比較，CCl4組存在大量凋亡細(xì)胞，而LC-cs+CCl4組的凋亡細(xì)胞明顯少于CCl4組。

由圖3及表4可見，3組間小鼠肝臟組織BAX和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。CCl4組BAX表達(dá)高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；LC-cs+CCl4組BAX表達(dá)水平低于CCl4組，Bcl-2表達(dá)水平高于CCl4組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激檢測(cè) 小鼠肝臟組織GSH-Px、T-AOC、SOD和MDA水平見表5。小鼠肝臟組織Nrf2蛋白電泳圖見圖4。

圖4 小鼠肝臟組織Nrf2蛋白電泳圖

表5 小鼠肝臟組織GSH-Px、T-AOC、SOD和MDA水平

由表5可見，3組間小鼠肝臟組織GSH-Px、T-AOC、SOD和MDA水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。CCl4組GSH-Px、T-AOC和SOD水平低于對(duì)照組，MDA水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。LC-cs+CCl4組的GSH-Px、T-AOC和 SOD水平高于CCl4組，MDA水平低于CCl4組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01）。

由圖4可見，與對(duì)照組比較，CCl4組Nrf-2表達(dá)水平為 0.19±0.11，少于對(duì)照組的 0.35±0.14，LC-cs+CCl4組Nrf-2表達(dá)水平為1.06±0.23，高于CCl4組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。3組小鼠Nrf2比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.99，P＜0.01）。

2.5 小鼠肝臟組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白測(cè)定 小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白電泳圖見圖5，小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)水平見表6。

圖5 小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白電泳圖

表6 小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)水平

由圖5及表6可見，3組間小鼠肝臟組織GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。CCl4組GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，而LC-cs+CCl4組GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)水平低于CCl4組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）。

3 討論

肝臟是人體最重要的解毒器官，大部分藥物和毒物進(jìn)入人體后都需經(jīng)肝臟代謝，導(dǎo)致肝損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。急性肝損傷是臨床上常見的肝損傷類型，主要病因包括藥物、酒精和病毒感染等。其中藥物誘發(fā)的急性肝損傷越來(lái)越常見，我國(guó)一項(xiàng)大規(guī)模的多中心回顧性研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)的藥物性肝損傷年發(fā)病率高達(dá)23.80/10萬(wàn)[5]。CCl4是能夠引起肝細(xì)胞壞死的毒性化合物，經(jīng)肝臟細(xì)胞色素 P450代謝成三氯甲基自由基，由于CCl4在動(dòng)物體內(nèi)可部分重現(xiàn)人類肝臟損傷病程，是常用的動(dòng)物肝損傷模型的造模劑[6]。近年來(lái)，有研究顯示益生菌對(duì)急慢性肝病具有一定的治療作用，但因其不穩(wěn)定性和不良反應(yīng)限制了其臨床推廣[7]。也有研究證實(shí)，益生菌的治療作用可能得益于短鏈脂肪酸、胞外多糖等益生菌產(chǎn)生的生物活性代謝物[8]。因此本研究選用干酪乳桿菌的細(xì)胞外代謝物，即培養(yǎng)上清液作為干預(yù)藥物，證實(shí)其對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。

HMGB1是一種細(xì)胞核內(nèi)蛋白，也是一種炎癥因子，各種原因所致的肝損傷可導(dǎo)致HMGB1釋放，因此外周血HMGB1檢測(cè)可聯(lián)合肝功能指標(biāo)與病理學(xué)檢查共同評(píng)估肝損傷嚴(yán)重程度[9]。本研究結(jié)果顯示LC-cs預(yù)處理后CCl4誘導(dǎo)的肝損傷減輕，表現(xiàn)為肝臟指數(shù)下降，組織病理學(xué)改變減輕，ALT、AST及HMGB1下降，說(shuō)明LC-cs對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護(hù)作用。

本研究進(jìn)一步就LC-cs保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的機(jī)制進(jìn)行了探討。既往研究顯示炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是急性肝損傷發(fā)生的主要機(jī)制之一[10-11]。IL-6和TNF-α是常用的肝臟炎癥因子，TUNEL試驗(yàn)可顯示組織中的凋亡細(xì)胞數(shù)量，聯(lián)合促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白Bcl-2的測(cè)定可用于評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，LC-cs干預(yù)能顯著降低IL-6和TNF-α水平，減少細(xì)胞凋亡，說(shuō)明LC-cs通過(guò)抑制肝臟炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)肝損傷。

CCl4誘導(dǎo)的肝損傷中氧化應(yīng)激是主要機(jī)制之一[12]。因此，可以通過(guò)檢測(cè)肝臟組織的GSH-Px、T-AOC、SOD和MDA的水平來(lái)評(píng)估肝臟氧化損傷[13]。本研究結(jié)果表明，LC-cs干預(yù)能顯著提高肝臟組織GSH-Px、T-AOC和SOD水平，降低MDA含量。Nrf2抗氧化通路是體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)之一，Nrf2在肝臟中高表達(dá)，當(dāng)ROS攻擊細(xì)胞時(shí)，受Nrf2調(diào)控的抗氧化酶基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活[14]。該研究結(jié)果表明CCl4刺激降低肝臟Nrf2表達(dá)，而LC-cs干預(yù)可逆轉(zhuǎn)該變化。以上結(jié)果表明LC-cs可通過(guò)減少氧化應(yīng)激保護(hù)肝損傷。

有研究指出，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可減少肝臟中的脂肪酸氧化[15]。因此，可通過(guò)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、ATF6和CHOP蛋白表達(dá)來(lái)評(píng)估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平[16]。該研究結(jié)果顯示，CCl4處理后上述蛋白水平顯著升高，而LC-cs干預(yù)能使這些蛋白水平趨于正常，提示LC-cs可通過(guò)抑制肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)拮抗CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。

綜上所述，LC-cs對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，減輕氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等機(jī)制發(fā)揮作用。LC-cs中發(fā)揮保護(hù)作用的具體代謝物及作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。