劉 娟，王知斌，王秋紅,2，劉祥成，匡海學(xué)*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東省中藥飲片規(guī)范化炮制工程技術(shù)研究中心，廣州 510006；3.牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司，牡丹江 157011）

阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)，又稱為老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，起病隱襲，病程呈慢性進(jìn)行性。臨床主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀，嚴(yán)重影響社交、職業(yè)與生活功能[1]。阿爾茨海默病是臨床中所占比重最大的一種癡呆類型，其發(fā)病率與死亡率隨年齡的增長(zhǎng)而不斷加重，且該病具高致殘性，已發(fā)展為導(dǎo)致老年人死亡的第五大病因[2]。根據(jù)臨床表現(xiàn)，老年癡呆屬于中醫(yī)學(xué)“呆證”“善忘”“郁證”“癲狂”“不慧”“愚癡”等病癥，認(rèn)為年老體衰，腎精虧虛，五臟不足，腦髓漸空，痰濁上蒙，瘀阻腦絡(luò)為本病的基本病機(jī)。中醫(yī)認(rèn)為腎藏精，精能生髓，腦為髓海，如腎精不足，髓?？仗?，會(huì)導(dǎo)致癡呆。因此腎精虧虛所致的髓海不足是AD發(fā)病的關(guān)鍵[3]。臨床中該病多為虛實(shí)交錯(cuò)，病癥錯(cuò)雜，虛、瘀、痰互見[4]。而“補(bǔ)腎”作為治療該疾病的基本原則，在該疾病治療過程中貫穿始終[5]。一方面腎虛為主的五臟虛衰可導(dǎo)致痰濁、瘀血等的產(chǎn)生，即因虛而致實(shí)；另一方面，痰瘀為患又可影響氣血津液的化生和運(yùn)行，致本虛更甚，此所謂因?qū)嵍绿?。兩者互為因果，形成惡性循環(huán)，以致病程纏綿，見癥多端。有研究顯示[6]其發(fā)病可能是由遺傳、環(huán)境、代謝等多種復(fù)雜因素相互作用所致。

補(bǔ)腎益腦丸由16味藥組成，具有補(bǔ)腎生精，益氣養(yǎng)血的作用。用于腎虛精虧、氣血兩虛所致的心悸、氣短、失眠、健忘、遺精、盜汗、腰腿酸軟、耳鳴耳聾。有研究表明[7-8]，中醫(yī)藥在AD的防治上具有副作用小、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑的整合效應(yīng)，能夠通過多途徑發(fā)揮療效。因此，研究中藥復(fù)方補(bǔ)腎益腦丸治療阿爾茨海默癥作用對(duì)于傳統(tǒng)中藥復(fù)方的二次開發(fā)，挖掘其抗阿爾茨海默病藥效潛力具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

72只SPF級(jí)ICR小鼠，雌雄各半。體質(zhì)量為22-25g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)NO.SCXK（遼）2020-0001。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.2 藥物與試劑

補(bǔ)腎益腦丸（牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品 批 號(hào)：190703、200501、200902、200903、201201、210302）；鹽酸多奈哌齊片（衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，10mg/片，批號(hào)1911040）；Aβ1-42（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)bs-0107p，批號(hào)BJ02263853）；注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)制藥總廠，產(chǎn)品批號(hào)20110628-2）；碘伏；小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、小鼠環(huán)氧合酶2(COX-2)、小鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、小鼠谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)分別為MM-0163M2、MM-0132M2、MM-0356M2、MM-0040M2、MM-0758M2、MM-0389M2）。

1.3 儀器

DW-200型腦立體定位儀(成都泰盟科技公司)；泰盟TM-Vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（WMT-100 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（白鼠版））；低溫冰箱（海爾DW-86L626）；微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠，規(guī)格10μL）；醫(yī)用真絲非吸收縫線（揚(yáng)州市金環(huán)醫(yī)療器械廠，規(guī)格型號(hào)3-0，生產(chǎn)批號(hào)20200103）；脫脂棉球（陽谷景陽崗衛(wèi)生材料廠）；普通止血鉗（張家港市錦豐錦鹿刀剪廠，規(guī)格12.5cm直，蘇蘇食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2007第1010051號(hào)）；酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號(hào)：RT-6100）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：BPS-50CL）；洗板機(jī)（北京天石，型號(hào)：ZMX-988B）；微量高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司，儀器型號(hào)：TG16W）；高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號(hào)：KZ-II）；正置白光拍照顯微鏡（Nikon（Japan）型號(hào)Eclipse Ci-L）；掃描瀏覽軟件（3DHISTECH（Hungary）型號(hào)CaseViewer2.4）。

2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

72只ICR小鼠(雌雄各半)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按體質(zhì)量和性別隨機(jī)分為假手術(shù)組（Control）、模型組（AD model）、鹽酸多奈哌齊組（Donepezil）、補(bǔ)腎益腦丸低劑量組（BSYNW-L）、補(bǔ)腎益腦丸中劑量組（BSYNW-M）和補(bǔ)腎益腦丸高劑量組（BSYN-W-H），每組12只。

350mg/kg烏拉坦麻醉小鼠后，固定，剪去頭部毛，碘伏、酒精消毒頭部皮膚。切開小鼠頭部皮膚約2cm,找到鹵門位置，以鹵門為原點(diǎn)，向右移動(dòng)1mm,向后移動(dòng)0.5mm,深度為3mm,10min內(nèi)微量進(jìn)樣器緩慢注射3μl老化的Aβ1-42(5μg/μl)，彌散5min。消毒后傷口處涂抹適量青霉素鈉粉末，縫合傷口。置于鼠籠中飼養(yǎng)，術(shù)后前5d給予青霉素(1次/d)，以避免感染,同時(shí)注意術(shù)后保暖。假手術(shù)組注射等體積無菌生理鹽水。

2.2 給藥

補(bǔ)腎益腦丸高、中、低組給藥劑量分別為1.44、0.72、0.36g/kg和鹽酸多奈哌齊組（1.5mg/kg），每日一次灌胃給藥。取等量6個(gè)批次的補(bǔ)腎益腦丸，打成極細(xì)粉并將其充分混合均勻，鹽酸多奈哌齊同樣打成粉末備用。連續(xù)給藥60天,假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水。

2.3 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)

行為學(xué)測(cè)試采用Morris水迷宮來測(cè)試小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。小鼠接受BSYNW治療60d后，隨機(jī)每組選取6只小鼠(雌鼠3只雄鼠3只)進(jìn)行為期6d的訓(xùn)練并用圖像跟蹤軟件記錄其游泳路徑。用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件分析尋找逃生平臺(tái)的潛伏期。水迷宮主體是一個(gè)白色圓形水池(直徑120cm，高50cm)，在測(cè)試期間，圓形水池中裝滿了水并加入脫脂奶粉，池子被分成四個(gè)等面積的象限(1、2、3和4)。將平臺(tái)(高25cm，直徑10cm)放置于目標(biāo)象限的正中心，讓其淹沒在水面以下1cm處。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠背向平臺(tái)放置于平臺(tái)所在目標(biāo)象限的對(duì)角象限，共計(jì)時(shí)60s，各組小鼠依次進(jìn)行訓(xùn)練。若60s的時(shí)間內(nèi)小鼠找到平臺(tái)，則記錄該時(shí)間為此小鼠的逃避潛伏期，讓小鼠在平臺(tái)上停留10s后將其擦干放回籠中，若60s內(nèi)小鼠未找到目標(biāo)平臺(tái)，則引導(dǎo)該小鼠到達(dá)平臺(tái)，此小鼠逃避潛伏期記為60s。

2.4 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)

定位航行檢測(cè)結(jié)束后24h,即第7天，將透明平臺(tái)撤去，將小鼠背向平臺(tái)放置于目標(biāo)象限對(duì)角象限邊緣，使其自由運(yùn)動(dòng)60s,期間要記錄各小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和進(jìn)入平臺(tái)所在目標(biāo)象限累計(jì)時(shí)間。所有實(shí)驗(yàn)的過程中均要保持周圍環(huán)境安靜，且其他參照物的位置不能隨意挪動(dòng)。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)考察小鼠血清中炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠眼球取血后斷頭處死，4℃135000r/min條件下離心20min后分離血清，留下待檢測(cè)樣本后，其余-80℃保存?zhèn)溆?。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.6 HE染色檢測(cè)小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化

斷頭處死小鼠后，低溫?zé)o菌條件下快速取出整個(gè)腦組織，用冰冷等滲鹽水沖洗，從腦中線將腦組織分為左右半腦，以4%多聚甲醛溶液固定48h，自來水沖洗24h，脫水透明后石蠟包埋HE染色。其余的腦保存在-80°C以作進(jìn)一步分析。將切片放入白礬中浸泡5min，用自來水沖洗，然后進(jìn)行伊紅染色1min。切片在上升式酒精溶液中脫水，用二甲苯使其透明，然后密封。用德國(guó)Leica DM3000LED光學(xué)顯微鏡檢測(cè)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)的病理變化，并用Motic MED6.0數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。然后于顯微鏡下進(jìn)行鏡檢并拍照，并按病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[9]。

表1 海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎益腦丸對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

由圖1顯示結(jié)果可知，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠的逃避潛伏期均有不同程度的縮短。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示從第三天開始阿爾茨海默癥模型組小鼠的逃避潛伏期與其它各組小鼠相比較都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。說明補(bǔ)腎益腦丸可有效改善老年癡呆動(dòng)物模型空間記憶能力的減退，并且表現(xiàn)出劑量依賴性。其中，與Control組相比，AD model組小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01），BSYNW-H組的小鼠逃避潛伏期較AD model組的潛伏期降低明顯（P＜0.01），BSYNW-L組和BSYNW-M組小鼠的逃避潛伏期也有不同成度的縮短（P＜0.01或P＜0.05）。

圖1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的逃避潛伏期

圖2 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中各組小鼠代表性運(yùn)動(dòng)軌跡圖

圖3 補(bǔ)腎益腦丸對(duì)阿爾茨海默癥小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響（左：各組小鼠正確穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)；右：各組小鼠進(jìn)入平臺(tái)象限累計(jì)時(shí)間）

Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，AD model組小鼠在目的象限的累計(jì)停留時(shí)間明顯縮短，準(zhǔn)確穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)也較少，均具有顯著性差異（P＜0.01）。與AD model組相比較，BSYNW-H組和Donepezil組小鼠在目標(biāo)象限的累計(jì)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.01，P＜0.05），準(zhǔn)確穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯增加（P＜0.01）。說明補(bǔ)腎益腦丸對(duì)于改善阿爾茨海默癥模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力具有良好療效。

3.2 補(bǔ)腎益腦丸對(duì)AD小鼠血清中炎癥因子和氧化應(yīng)激因子水平的影響

由圖4、圖5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：AD model組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、COX-2、IL-6含量升高，SOD與GSH-PX含量降低，與control組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。與AD model組比較，BSYNW-H組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、COX-2、IL-6含量均降低，而SOD和GSH-PX含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AD model組比較，BSYNWM組和BSYNW-L組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、COX-2、IL-6含量也有不同成度的降低，SOD與GSH-PX含量則有不同程度的升高，且呈劑量依賴性。其中BSYNW-M組小鼠血清IL-6水平與AD model組比較也具有顯著差異（P＜0.05），說明補(bǔ)腎益腦丸可以抑制阿爾茨海默病模型小鼠血清中炎性因子的釋放，增加其相關(guān)抗氧化因子的釋放，說明其藥物作用機(jī)制可能與抗炎、抗氧化作用有關(guān)。

圖4 各組小鼠血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α、COX-2、IL-6的表達(dá)

圖5 各組小鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)因子超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的表達(dá)

圖6 小鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果（×200）

圖7 小鼠海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果（×200）

圖8 各組小鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)評(píng)分結(jié)果

3.3 BSYNW對(duì)AD小鼠海馬組織病理學(xué)改變的影響

觀察到AD model組小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元有明顯的細(xì)胞病理學(xué)改變，包括錐體細(xì)胞排列紊亂，變薄，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間隙變大，形狀不規(guī)則。神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂且數(shù)量也明顯減少，極度明顯可見細(xì)胞固縮及空泡化，與Control組相比，其病理形態(tài)學(xué)評(píng)分明顯上升;與AD model組相比，補(bǔ)腎益腦丸各給藥組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多、排列紊亂狀態(tài)有所改善、細(xì)胞固縮及空泡化現(xiàn)象明顯緩解，病理形態(tài)學(xué)評(píng)分明顯降低。其中，與AD model組相比，BSYNW-H組和Donepezil組小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)細(xì)胞僅有少量細(xì)胞病理改變，而正常小鼠則不存在這種改變。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，注射Aβ1-42后，AD model組小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量較Control組明顯減少，說明補(bǔ)腎益腦丸對(duì)于改善AD模型小鼠海馬病理形態(tài)學(xué)損傷具有良好的作用。

4 討論

中醫(yī)將AD歸屬于“癡呆”“神呆”等范疇，病機(jī)與五臟虛弱，腦髓生成乏源或腦絡(luò)不通，腦髓不純有關(guān)，腦氣凝滯皆由氣血不暢所致，腦與臟腑之氣不接，腦中氣血虧虛或不通是癡呆的關(guān)鍵病機(jī)[10]。中醫(yī)認(rèn)為腎主骨，骨生髓，腦為髓之海，腎精足則記憶力增強(qiáng)，行動(dòng)輕捷。當(dāng)腎精虧耗導(dǎo)致髓?？仗?，則出現(xiàn)癡頑呆滯，行作笨拙。因此腎虛、髓海不足是導(dǎo)致AD的重要原因[11]。另一方面腎主氣化是腎臟生理功能的高度概括，也是中醫(yī)陰陽平衡理論的體現(xiàn)，腎之精氣上達(dá)，化髓沖腦，灌髓海此為陽，下降之濁氣則排出體外此為陰，陰陽互根互用，相互對(duì)立制約，處于一種動(dòng)態(tài)的平衡[12]。

海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組織，主要參與學(xué)習(xí)、記憶、情感等高級(jí)生理功能[13]。海馬神經(jīng)元損傷可影響海馬功能，最終演變?yōu)閷W(xué)習(xí)障礙、記憶功能障礙、抑郁和顳葉癲癇等，是阿爾茨海默病表現(xiàn)出的病理特征之一。通過抑制海馬損傷，改善海馬神經(jīng)可塑性，一定程度上可達(dá)到緩解阿爾茨海默病癥狀的效果[14]。

神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病中也起著重要作用[15-16]。神經(jīng)炎癥是發(fā)生于腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，可由多種因素導(dǎo)致，如腦創(chuàng)傷、β-淀粉樣蛋白沉積、能量代謝障礙，甚至是衰老[17]。有研究顯示大量釋放促炎因子會(huì)損害神經(jīng)元，并引起突觸喪失和神經(jīng)元死亡，與患者病情發(fā)生相關(guān)，其在評(píng)估阿爾茨海默癥病況中有重要作用[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，老年癡呆患者體內(nèi)抗氧化能力下降、自由基堆積，是造成神經(jīng)細(xì)胞毒性的重要原因，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶功能[19]。SOD和GSH-PX是體內(nèi)重要的抗氧化酶，在學(xué)習(xí)記憶能力障礙患者體內(nèi)的活性下降，自由基大量產(chǎn)生，引起腦組織功能受損[20]。

歷代文獻(xiàn)和現(xiàn)代報(bào)道統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，熟地黃、川芎、遠(yuǎn)志、茯苓、當(dāng)歸均是老年癡呆治療的高頻使用中藥[21]，單味中藥的現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦為上述中藥治療癡呆提供了作證[22-24]。同時(shí)國(guó)際中醫(yī)臨床實(shí)踐指南也推薦腎虛血瘀的老年癡呆癥患者可選用山楂枸杞飲泡水代茶，經(jīng)常飲服[25]。而中藥復(fù)方補(bǔ)腎益腦丸中含有16味中藥，極大的涵蓋了可用于治療腎虛髓虧型老年性癡呆的多種單味藥[26]，推測(cè)其整體藥效會(huì)更加良好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，補(bǔ)腎益腦丸對(duì)于阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、炎性因子表達(dá)、氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)及海馬病理形態(tài)學(xué)變化均產(chǎn)生了積極影響，原因可能是此復(fù)方中的大部分單味藥在治療阿爾茨海默癥中均有較好療效，聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

綜上所述，補(bǔ)腎益腦丸在治療阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、減少相關(guān)炎癥因子表達(dá)、抗氧化應(yīng)激以及改善海馬病理形態(tài)學(xué)損傷的實(shí)驗(yàn)中均取得了較好療效，說明其具有緩解阿爾茨海默病的巨大潛力，接下來應(yīng)該更進(jìn)一步深入研究其中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，廣泛探尋其可能的作用機(jī)制，為更加廣泛的臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。