黃曉巍，王 宇，王亞杰，周 佳，王晉冀，律廣富，謝曉燕，辛 國*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)東北亞中醫(yī)藥研究院，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院后勤保障部，長春 130021）

失眠是普遍存在于女性和老年人中的睡眠障礙，嚴(yán)重者可干擾正常的生活活動[1]。有資料顯示[2]，我國患有失眠的人口高達38%，且有年輕化趨勢。數(shù)據(jù)顯示，陰虛型失眠占比為22.83%[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為失眠的發(fā)病機制與5-HT、DA、NE、γ-GABA、Glu有關(guān)[4]，針對失眠的治療以苯二氮卓類藥物為主，而中藥治療失眠歷史悠久，且副作用小。棗仁茯苓玉竹膏由棗仁、茯苓、玉竹、龍眼、甘草組成，均為藥食同源中藥。棗仁寧心安神為君藥；茯苓、龍眼裨益心脾、養(yǎng)血安神為臣藥；佐以玉竹滋陰降火；甘草調(diào)和諸藥為使。水煎液是臨床常用的提取溶劑，本研究選擇水為提取溶劑，并對其改善陰虛型失眠的作用進行研究，為中醫(yī)藥改善失眠的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗藥品及主要試劑

1.2 主要儀器

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1.3 動物

ICR小鼠，SPF級，60只，雌雄各半，體質(zhì)量18g~22 g，由長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號碼:SCXK(吉)2018-0007；SD大鼠，SPF級，雄性60只，體質(zhì)量180g~220 g，由長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號碼：SCXK(吉)2018-0007。

2 方法

2.1 戊巴比妥鈉閾下催眠劑量試驗

2.1.1 動物分組與給藥

小鼠共分為6組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組、棗仁茯苓玉竹膏高、中、低劑量組。其中陽性對照組給予天王補心丸0.26丸/天，棗仁茯苓玉竹膏高、中、低劑量組分別給藥5g·kg-1、10g·kg-1和20g·kg-1（按生藥劑量折算），其余組小鼠給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥一周。

2.1.2 行為學(xué)實驗

末次給藥30min后，小鼠自主活動測試儀測試每組小鼠自主活動次數(shù)，完成后每組小鼠腹腔注射28mg·kg-1戊巴比妥鈉，記錄每組小鼠入睡鼠數(shù)，計算每組小鼠入睡率（入睡率=每組小鼠入睡個數(shù)÷每組小鼠總數(shù)×100）。

2.2 棗仁茯苓玉竹膏對陰虛型失眠模型大鼠的影響

2.2.1 動物分組與給藥

大鼠共分為6組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組、棗仁茯苓玉竹膏高、中、低劑量組。其中陽性對照組給予天王補心丸0.18丸/天，棗仁茯苓玉竹膏高、中、低劑量組分別給藥5g·kg-1、10g·kg-1和20g·kg-1（按生藥量折算），空白對照組、模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給藥3周。

2.2.2 動物造模

除空白組外其他組在灌胃給藥2周后腹腔注射甲狀腺素0.5mg·kg-1，連續(xù)給藥1周。

2.2.3 曠場實驗

給藥3周結(jié)束后，將大鼠放于曠場中適應(yīng)3min，通過開場活動實驗系統(tǒng)，記錄每只大鼠2min內(nèi)總移動路程。

2.2.4 體質(zhì)量

測定每只大鼠體質(zhì)量。

2.2.5 飲水量、進食量

每只日攝食量=（上次加入的飼料總量-剩余飼料量）/（大鼠只數(shù)×間隔天數(shù)）

每只日飲水量=（上次加入的水總量-剩余水量）/（大鼠只數(shù)×間隔天數(shù)）

2.2.6 肛溫

體溫計測量每只大鼠肛溫，以溫度計的數(shù)值恒定不變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)。

2.2.7 ELISA法檢測大鼠血清中5-HT、DA、NE、γ-GABA、GLU、TSH、血漿中cAMP、cGMP含量

大鼠血清和血漿樣品在-4℃的條件下低溫離心15min，吸取上清液，于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。?yán)格按照試劑盒說明書測定大鼠血清中5-HT、DA、NE、γ-GABA、Glu、TSH、血漿中cAMP、cGMP含量。

2.2.8 Western Blot法檢測大鼠腦組織中CRH、ACTH表達水平

取各組大鼠腦組織0.1g，按北京索萊寶提供的全蛋白提取試劑盒說明書提取各組大鼠腦組織總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒對樣品進行蛋白定量，調(diào)節(jié)蛋白濃度為8.580 g·L-1；將蛋白樣品與等體積5×樣品緩沖液混合后，100℃水浴5 min后即刻放入冰浴中冷卻；將樣品加入到放置好SDS-PAGE膠的加樣孔內(nèi)，每孔加樣20μL，110V恒定電流轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，采用TBST洗滌3次，每次5 min，之后將膜放入5%脫脂奶粉中，水平搖床，室溫下封閉1 h。封閉結(jié)束后，將膜取出，TBST浸洗1次10min，浸洗2次，每次5 min，向洗膜盒中加入相應(yīng)的一抗CRH（1∶1000）、ACTH（1∶5000）稀釋液，4℃儲存，過夜。加HRP標(biāo)記二抗（1∶5000），水平搖床，室溫封閉1 h，TBST浸洗3次，每次5min。加入ECL發(fā)光液，室溫孵育膜1 min。將膜正面朝上放到凝膠成像儀內(nèi)，照相、記錄結(jié)果。對電泳條帶進行灰度值掃描，對各目的蛋白進行半定量分析。以目的條帶與Beta Actin灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達量[5]。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有結(jié)果采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，各指標(biāo)采用單因素方差分析，結(jié)果用（±s）表示，多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 戊巴比妥鈉閾下劑量試驗

實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組動物活動次數(shù)、站立次數(shù)、小鼠入睡率沒有明顯變化(P＜0.05)；與模型組比較，陽性對照組與棗仁茯苓玉竹膏高劑量組動物活動次數(shù)、站立次數(shù)明顯減少，小鼠入睡率明顯增加(P＜0.05)，但棗仁茯苓玉竹膏中劑量組和低劑量組相關(guān)指標(biāo)與模型組相比差異并不明顯。詳見表1。

表1 各組小鼠自主活動次數(shù)和入睡率結(jié)果(±s，n=10)Table 1 Mice spontaneous activity frequency and sleep rate results of each group(±s,n=10)

表1 各組小鼠自主活動次數(shù)和入睡率結(jié)果(±s，n=10)Table 1 Mice spontaneous activity frequency and sleep rate results of each group(±s,n=10)

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.2 曠場實驗

實驗結(jié)果表明，與空白組比較，模型組動物靜止時間明顯減少，運動時間、總移動路程明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，陽性對照組、棗仁茯苓玉竹膏高劑量組、中劑量組動物靜止時間明顯增加，運動時間、總移動路程明顯減少(P＜0.01)，棗仁茯苓玉竹膏低劑量組靜止時間和運動時間有明顯變化，總移動路程無明顯 差異(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠曠場實驗結(jié)果(±s，n=10)Table 2 Rat open field experiment results of each group(±s,n=10)

表2 各組大鼠曠場實驗結(jié)果(±s，n=10)Table 2 Rat open field experiment results of each group(±s,n=10)

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.3 體質(zhì)量

實驗結(jié)果表明，各組大鼠給藥前體質(zhì)量無明顯差異；與空白組比較，模型組大鼠給藥2周后，體質(zhì)量明顯增加，給予造模藥后，體質(zhì)量明顯下降(P＜0.01)。與模型組比較，各給藥組2周后體質(zhì)量明顯增加，給予造模藥后，陽性對照組大鼠體質(zhì)量明顯增加，棗仁茯苓玉竹膏高劑量組、中劑量組體質(zhì)量明顯下降，低劑量組大鼠體質(zhì)量下降不明顯(P＜0.01或P＜0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠體質(zhì)量結(jié)果(±s，n=10)Table 3 Results of body mass of each group(±s,n=10)

表3 各組大鼠體質(zhì)量結(jié)果(±s，n=10)Table 3 Results of body mass of each group(±s,n=10)

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.4 飲水量、進食量

實驗結(jié)果表明，除空白組和模型組外，各給藥組大鼠在2周內(nèi)飲水量明顯增加；第3周，與空白組比較，模型組大鼠飲水量增加，陽性對照組和高劑量組飲水量有下降趨勢(P＜0.01，P＜0.05)。各組大鼠2周內(nèi)進食量沒有明顯變化，在第3周，與空白組比較，模型組大鼠進食量明顯增加，與模型組比較，各給藥組大鼠進食量明顯減少(P＜0.01或P＜0.05)。詳見表4—5。

表4 各組大鼠飲水量結(jié)果(±s，n=10)Table 4 Results of water consumption of each group(±s,n=10)

表4 各組大鼠飲水量結(jié)果(±s，n=10)Table 4 Results of water consumption of each group(±s,n=10)

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

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表5 各組大鼠進食量結(jié)果(±s，n=10)Table 5 Results of food intake of each group(±s,n=10)

表5 各組大鼠進食量結(jié)果(±s，n=10)Table 5 Results of food intake of each group(±s,n=10)

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.5 肛溫

實驗結(jié)果表明，各組大鼠在造模前肛溫?zé)o明顯差異；造模后，與空白組比較，模型組大鼠肛溫明顯增加，與模型組比較，陽性對照組、棗仁茯苓玉竹膏高劑量組肛溫明顯下降(P＜0.01或P＜0.05)。詳見表6。

表6 各組大鼠肛溫結(jié)果(±s，n=10)Table 6 Results of anal temperature of each group(±s,n=10)

表6 各組大鼠肛溫結(jié)果(±s，n=10)Table 6 Results of anal temperature of each group(±s,n=10)

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.6 ELISA檢測結(jié)果

ELISA檢測結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠血清中5-HT、γ-GABA、血漿中cGMP含量明顯降低，DA、NE、Glu、TSH、血漿中cAMP表達水平明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，陽性對照組、棗仁茯苓玉竹膏高劑量組大鼠血清中5-HT、γ-GABA、血漿中cGMP明顯升高，DA、NE、Glu、TSH、血漿中cAMP均有明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。詳見表7。

表7 各組大鼠血清中5-HT、DA、NE、γ-GABA、GLU、TSH和血漿中cAMP、cGMP含量結(jié)果(±s，n=10)Table 7 Results of 5-HT,DA,NE、γ-GABA、GLU、TSH in serum and cAMP、cGMP in plasma of rats in each group(±s,n=10)

表7 各組大鼠血清中5-HT、DA、NE、γ-GABA、GLU、TSH和血漿中cAMP、cGMP含量結(jié)果(±s，n=10)Table 7 Results of 5-HT,DA,NE、γ-GABA、GLU、TSH in serum and cAMP、cGMP in plasma of rats in each group(±s,n=10)

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

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續(xù)表7

3.7 Western Blot檢測結(jié)果

Western Blot檢測結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組大鼠腦組織中CRH、ACTH表達水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中CRH、ACTH含量均有明顯降低（P＜0.01）。詳見表8，圖1。

圖1 各組大鼠腦組織中CRH、ACTH表達電泳圖Figure 1 Electrophoresis of CRH and ACTH expression in brain of rats in each group

表8 各組大鼠腦組織中CRH和ACTH水平（n=3,±s）Table 8 Expression levels of CRH and ACTH in brain of rats in each group

表8 各組大鼠腦組織中CRH和ACTH水平（n=3,±s）Table 8 Expression levels of CRH and ACTH in brain of rats in each group

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

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4 討論

通過腹腔注射戊巴比妥鈉催眠閾下劑量試驗，分別測定每組小鼠的自主活動和入睡率，結(jié)果表明，棗仁茯苓玉竹膏明顯減少小鼠自主活動，提高小鼠入睡率，具有協(xié)同戊巴比妥鈉催眠的作用。

甲狀腺[6]是人體最大的分泌腺，其功能是合成分泌甲狀腺激素。甲狀腺激素的主要作用是促進物質(zhì)與能量代謝，促進生長與發(fā)育過程，提高基礎(chǔ)代謝率，使產(chǎn)熱和氧耗量增加。給予大鼠過量的甲狀腺素，大鼠飲水量、進食量、肛溫明顯升高，體質(zhì)量明顯減少，在曠場實驗中，大鼠靜止時間明顯減少、運動時間和總移動路程明顯增加，動物出現(xiàn)中醫(yī)陰虛證并有交感神經(jīng)興奮性增強的特點，從而制備甲狀腺功能亢進引起的陰虛失眠動物模型。藥天王補心丸，能緩解陰虛型失眠動物的癥狀[7]。給予大鼠滋陰藥治療后，觀察各項臨床指標(biāo)。結(jié)果表明，給予棗仁茯苓玉竹膏后，癥狀和行為表現(xiàn)均有所改善，其趨勢與天王補心丸陽性對照組一致。

環(huán)核苷酸[8]是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能活動的重要物質(zhì)。cAMP是由ATP經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶及Mg2+的作用生成的，cAMP能對細(xì)胞內(nèi)很多代謝過程發(fā)生影響，如腎上腺素、腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素等。當(dāng)甲狀腺功能亢進時，機體內(nèi)的cAMP、TSH進一步升高，cGMP降低，因而出現(xiàn)基礎(chǔ)代謝增強[9]。血漿cAMP含量升高，表明機體代謝受到一定程度影響；Western Blot結(jié)果顯示，ACTH、CRH表達明顯升高，說明下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能受到影響。當(dāng)給予棗仁茯苓玉竹膏治療后，以上檢測指標(biāo)均有所改善。表明棗仁茯苓玉竹膏對甲狀腺激素所致陰虛型失眠引起的代謝增強及HPA軸功能紊亂有一定的改善作用。

睡眠的發(fā)生機制與神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE、γ-GABA及Glu等有關(guān)，本實驗通過檢測血清中含量，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中5-HT、γ-GABA含量明顯降低，DA、NE、Glu含量明顯升高，給藥后，各組大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量均有明顯改變，提示棗仁茯苓玉竹膏可能是通過改善神經(jīng)遞質(zhì)含量，從而改善睡眠。

綜上所述，棗仁茯苓玉竹膏對甲狀腺功能亢進陰虛型失眠所致基礎(chǔ)代謝增強[10]和HPA軸功能紊亂有一定調(diào)節(jié)作用，在減少機體的基礎(chǔ)代謝率，改善癥狀、體征、行為表現(xiàn)和失眠相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)方面有一定作用。本文初步探討了棗仁茯苓玉竹膏對失眠動物行為學(xué)、相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)及激素的影響，其具體的作用機制仍有待于進一步研究。