王晨 林栩 唐志明 韋美理 吳昱升 王蓉

【摘要】 目的 建立重癥MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）動(dòng)物模型，并對(duì)模型成功與否進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步探索狼瘡性腎炎與足細(xì)胞蛋白nephrin、P-cadherin的相關(guān)性。

方法 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組：空白組、模型組和脂多糖組?？瞻捉M為雌性C57小鼠8只，模型組及脂多糖組為雌性MRL/lpr小鼠各8只，其中脂多糖組腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），空白組及模型組每周注射等量生理鹽水。20周后檢測(cè)小鼠尿蛋白，處死動(dòng)物，收集各組小鼠腎組織。蘇木精-伊紅染色法 （hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察小鼠腎臟組織。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)腎組織中nephrin、P-cadherin的mRNA及蛋白表達(dá)。

結(jié)果 與空白組相比，模型組小鼠尿蛋白升高，腎臟病理?yè)p傷嚴(yán)重;與模型組相比，LPS組小鼠尿蛋白升高，腎臟損傷進(jìn)一步加重;此外腎組織中nephrin、P-cadherin表達(dá)水平在三組間逐步下降（P<0.01）。

結(jié)論 用 LPS腹腔注射的 MRL/lpr小鼠可誘導(dǎo)加重狼瘡，且狼瘡性腎炎的嚴(yán)重程度與 nephrin及P-cadherin相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 狼瘡性腎炎;細(xì)菌脂多糖;足細(xì)胞損傷;nephrin;P-cadherin

中圖分類號(hào)：R692?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.03.001

Establishment of a model of severe lupus nephritis and exploration of its correlation with podocyte proteins nephrin and P-cadherin

WANG Chen， LIN Xu▲， TANG Zhiming， WEI Meili， WU Yusheng， WANG Rong

（Nephrology Department of Affiliated Hospital， Guangxi Key Laboratory of Basic Medical Research Support for Immune Related Diseases，Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To establish the animal model of severe MRL/lpr mouse lupus nephritis （LN）， and to verify the success of the model， so as to further explore correlation between LN and nephrin and P-cadherin of podocyte proteins.

Methods Experimental animals were divided into three groups： blank group， model group and lipopolysaccharide group. There were 8 female C57 mice in the blank group， 8 female MRL/lpr mice in the model group and 8 female MRL/lpr mice in the? lipopolysaccharide group， the lipopolysaccharide group were injected intraperitoneally with lipopolysaccharide （LPS）， while the blank group and the model group were injected with the same amount of normal saline every week. After 20 weeks， the urine proteins of mice were detected， the animals were killed， and the renal tissues of mice in each group were collected. And then， hematoxylin-eosin staining （HE） was used to observe the renal tissues of mice， and RT-qPCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein expressions of nephrin and P-cadherin in renal tissues.

Results Compared with the blank group， the urinary proteins in the model group increased and the pathological damage of kidney was serious; compared with the model group， the urinary proteins in the LPS group increased， and the renal injury was further aggravated. In addition， the expression levels of nephrin and P-cadherin in renal tissues decreased gradually among the three groups（P<0.01）.

Conclusion MRL/lpr mice injected intraperitoneally with LPS can induce and aggravate lupus， and the severity of lupus nephritis is related to nephrin and P-cadherin.

【Key words】 LN; LPS; podocyte injury; nephrin; P-cadherin

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡整體發(fā)病率及死亡率高的主要危險(xiǎn)因素，且維持臨床狼瘡患者的腎功能至關(guān)重要。狼瘡性腎炎臨床上以免疫抑制劑治療為主，缺乏特異性。有研究指出Ⅰ型狼瘡性腎炎及Ⅱ型狼瘡性腎炎不需特殊治療，Ⅲ型及Ⅳ型則需要免疫治療，而Ⅴ型及Ⅵ型的治療方案則仍然存在爭(zhēng)議。因此，針對(duì)不同類型的狼瘡開發(fā)個(gè)性化療法，進(jìn)一步完善治療方案，改善狼瘡病人的生存質(zhì)量非常必要。同時(shí)nephrin作為足細(xì)胞標(biāo)志蛋白，其表達(dá)的變化反映足細(xì)胞損傷輕重程度，P-cadherin則參與足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腎小球硬化的進(jìn)程。故本研究使用脂多糖（LPS）建立重癥狼瘡模型，探究狼瘡與足細(xì)胞損傷的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制，建立狼瘡的治療框架提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡 MRL/lpr 雌性小鼠（B6.MRL Faslpr/Nju）16只及C57BL/6雌性小鼠8只（SPF級(jí)，上海斯萊克公司）。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

LPS（美國(guó)Sigma），尿蛋白試劑盒（南京建成），TRIzol Reagent（invitrogen），BeyoRTTMIIcDNA第一鏈合成試劑盒（D7168M），引物（上海生工），引物序列見表1。RIPA（強(qiáng)）、PMSF、BCA試劑盒（碧云天），P-cadherin抗體（13773-1-AP），nephrin抗體（ab216341），β-actin抗體（66009-1-lg）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠模型制備

將MRL/lpr小鼠隨機(jī)分成 2組， LPS組每周腹腔注射LPS（1 mg/kg），模型組及空白組腹腔每周注射生理鹽水。

1.3.2 組織病理學(xué)分析造模

12周后取小鼠腎臟，固定、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟切片病理變化并拍照。

1.3.3 腎功能檢測(cè)

給藥最后一周用代謝籠收集小鼠尿液，尿蛋白試劑盒檢測(cè)尿蛋白。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)

（1）TRIzol抽提RNA，測(cè)定A260/280及RNA 濃度，RNA純度均在1.8～2.0之間。（2）取2.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 具體操作按照碧云天逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。（3）LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。（4）數(shù)據(jù)處理：以GAPDH作為內(nèi)參，檢測(cè)P-cadherin、nephrin的mRNA表達(dá)，以2-△△CT法計(jì)算兩者mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 Western blot法檢測(cè)

（1）提取蛋白質(zhì)：收集處理好的各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟，加入裂解液及蛋白酶抑制劑30分鐘，12 000 g離心10分鐘后提取總蛋白。（2）BCA法測(cè)定蛋白濃度。（3）取蛋白加入上樣緩沖液煮沸10分鐘后，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育。稀釋比例為nephrin（1∶1000）、P-cadherin（1∶1000）、 GAPDH（1∶20 000）抗體，二抗（1∶6000）。（4）顯影：利用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)圖表用 Graph Pad Prism 8.0繪制。用Excel 建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用（±s）表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVE），兩兩比較選擇LSD-t分析法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)? 果

2.1 小鼠外形的觀察

實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠精神及身體狀態(tài)，空白組小鼠進(jìn)食正常，精神狀態(tài)好，體重持續(xù)增長(zhǎng)。模型鼠體重前期正常增長(zhǎng)，12周齡后體重不增反降，毛發(fā)有部分脫落，一些小鼠出現(xiàn)明顯的紅斑樣病變，LPS組出現(xiàn)如圖1所示頸部、腋下等全身多處淋巴結(jié)腫大。

2.2 HE染色

結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，未見增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組出現(xiàn)輕度的腎小球系膜細(xì)胞增生，伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。LPS組鏡下觀則有腎小球細(xì)胞明顯增大，且有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

2.3 尿蛋白水平

尿蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，各組與空白組相比，尿蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。模型組小鼠尿蛋白與空白組相比有增長(zhǎng)趨勢(shì)（P<0.001）。LPS組小鼠注射 LPS后，尿蛋白含量較模型組相比有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)（P<0.001）。如下表2、圖3所示。

2.4 RT-PCR檢測(cè)P-cadherin、nephrin的mRNA的表達(dá)

各組與空白組相比，P-cadherin、nephrin的mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;與模型組比較，LPS組足細(xì)胞蛋白P-cadherin、nephrin明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見圖4。

2.5 Western blot法檢測(cè)P-cadherin、nephrin蛋白的表達(dá)

與空白組比較，其余兩組P-cadherin、nephrin蛋白表達(dá)均降低（P<0.0001），與模型組比較，LPS組P-cadherin、nephrin蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（P<0.05）。各組蛋白電泳圖及柱狀分析圖見圖5。

3 討? 論

MRL/lpr小鼠是一種自發(fā)性狼瘡模型鼠，約20周齡可自發(fā)狼瘡性腎炎。其腎炎表現(xiàn)與人類相似，是較為常用的狼瘡模型。本研究采用自發(fā)性狼瘡小鼠MRL/lpr作為輕型模型組，LPS誘導(dǎo) MRL/lpr 小鼠產(chǎn)生重型狼瘡性腎炎，并檢測(cè)三組間nephrin及P-cadherin的表達(dá)，探討LN是否發(fā)生足細(xì)胞損傷，且足細(xì)胞損傷是否與狼瘡病情的發(fā)展有相關(guān)性。

MRL/lpr小鼠缺點(diǎn)是個(gè)體差異大，不能保證發(fā)病情況的同一性。LPS是革蘭陰性菌的外膜成分，其中脂A是最具生物活性的部分，是內(nèi)毒素和主要毒力因子，起促進(jìn)感染過程的核心作用。脂多糖組以LPS加快 MRL/lpr小鼠狼瘡發(fā)病進(jìn)程，與不注射LPS的模型組小鼠相比腎臟病變更加統(tǒng)一，尿蛋白水平顯著升高，腎臟病理炎性改變明顯，狼瘡足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)減少，且隨著狼瘡病情的加重可進(jìn)一步下降。這表明足細(xì)胞損傷是狼瘡性腎炎發(fā)病機(jī)制之一，且與病情的發(fā)展密切相關(guān);足細(xì)胞的損傷是LN進(jìn)展的原因之一，可通過減少足細(xì)胞的損傷延緩狼瘡性腎炎的發(fā)展。

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障（glomerular filtration barrier，GFB）的基本成分，在其特殊分子和電荷特性中起著重要作用。足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整及功能正常對(duì)于腎臟維持正常的生理功能至關(guān)重要。腎小球疾病患者往往與足細(xì)胞損傷相關(guān)。足細(xì)胞損傷在狼瘡性腎炎前期的發(fā)病過程中就可能起到至關(guān)重要的作用。研究表明足細(xì)胞裂孔蛋白nephrin可以激活整合素β1，影響足細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的附著，從而使足細(xì)胞丟失和腎小球基底膜剝脫，最終導(dǎo)致慢性腎臟病。為了進(jìn)一步探討狼瘡分子水平的發(fā)病機(jī)制，在建立輕重狼瘡模型的基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步將足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin納入研究范疇，以期發(fā)現(xiàn)狼瘡性腎炎進(jìn)展的分子基礎(chǔ)。

同時(shí)腎小球的硬化也是腎臟疾病需要關(guān)注的一大方向，延緩腎小球的硬化對(duì)于改變狼瘡病人的預(yù)后有著舉足輕重的作用。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）即上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特征，獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特征。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)P-cadherin是乳腺癌發(fā)生中一個(gè)重要的臨床預(yù)后因素和可能的治療靶點(diǎn)，可以作為EMT的標(biāo)志物。Jagge/Notch等多種途徑信號(hào)通路可誘導(dǎo)糖尿病腎病中足細(xì)胞EMT發(fā)生。臨床研究證明Jagge/Notch在狼瘡病人足細(xì)胞中的表達(dá)可能是蛋白尿和腎小球硬化發(fā)展的共同（下游）途徑。足細(xì)胞屬于一種上皮細(xì)胞，在受外界損傷性刺激時(shí)會(huì)發(fā)生足細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。足細(xì)胞EMT發(fā)生后，nephrin、podocin、ZO-1表達(dá)下調(diào)，縫隙橫膈膜（slit diaphragm，SD）改變，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重新排列，2型EMT是從E-cadherin到N-cadherin的轉(zhuǎn)換，不同于2型EMT的是，足細(xì)胞EMT上皮樣表型標(biāo)志蛋白P-cadherin會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镹-cadherin，也是導(dǎo)致腎小球硬化的重要病理機(jī)制。本研究通過PCR和Western blot考察裂孔蛋白nephrin與跨膜蛋白P-cadherin的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證狼瘡與足細(xì)胞損傷及腎小球硬化的相關(guān)性。

本研究LN模型成功建立證明MRL/lpr小鼠模型具備面部紅斑等典型癥狀及淋巴結(jié)腫大、腎小球病變等臨床特征。且使用LPS誘導(dǎo)MRL/lpr小鼠建立LN模型在加重小鼠狼瘡病情同時(shí)可確保發(fā)病時(shí)機(jī)一致，減少狼瘡重癥造模過程中小鼠的意外死亡。可以為L(zhǎng)N發(fā)病機(jī)制及臨床治療研究提供良好的前期基礎(chǔ)，同時(shí)本研究將足細(xì)胞損傷及狼瘡性腎炎聯(lián)系起來(lái)，進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin及P-cadherin參與了狼瘡性腎炎的發(fā)病機(jī)制，且與病情進(jìn)展一致，可作為L(zhǎng)N疾病進(jìn)展的標(biāo)志，為狼瘡性腎炎的治療提供了靶點(diǎn)，針對(duì)足細(xì)胞相關(guān)蛋白的治療可以應(yīng)用于臨床狼瘡的治療，也可作為預(yù)后分析指標(biāo)對(duì)臨床用藥起指示作用，為新的特異性藥物的研發(fā)提供了指導(dǎo)作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-10-21 修回日期：2021-12-11）

（編輯：梁明佩）