邢寶松，張家慶，任巧玲，呂玲燕，王獻(xiàn)偉，陳俊峰，高彬文，馬 強(qiáng)

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2. 廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西 南寧 530001；3. 河南省畜牧總站，河南 鄭州 450008）

氧化應(yīng)激（Oxidative stress，OS）是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)之間嚴(yán)重失衡，引起動(dòng)物細(xì)胞和組織氧化損傷的現(xiàn)象[1]。自由基中對(duì)機(jī)體危害最大的為活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[2]。在正常生理狀態(tài)下，ROS 作為第二信使在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用[3]。然而，在現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，許多外源或內(nèi)源刺激（空氣質(zhì)量、飼養(yǎng)密度、冷熱應(yīng)激、束縛應(yīng)激、妊娠、泌乳、霉菌毒素、疾病等）均可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)ROS 水平急劇增加，誘發(fā)氧化應(yīng)激。因此，OS常被認(rèn)為是影響動(dòng)物健康和繁殖性能的重要因素[4]。

顆粒細(xì)胞（GC）是卵巢中十分重要的功能細(xì)胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的發(fā)育、排卵以及激素分泌等功能活動(dòng)[5]。大量研究表明，卵巢氧化應(yīng)激顯著促進(jìn)了顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖，并且發(fā)現(xiàn)，卵泡液中ROS 增加或抗氧化能力降低引起卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，導(dǎo)致受精率降低，甚至還會(huì)引起一系列并發(fā)癥，如胎兒生長(zhǎng)受限，流產(chǎn)、早產(chǎn)、弱仔率增高等[6-8]。相反，通過(guò)補(bǔ)充抗氧劑可抑制卵泡中ROS 的產(chǎn)生與活性，同時(shí)能夠顯著減輕由OS 引起的顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖的發(fā)生[9-10]。

原花青素（OPC）是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑[11-12]。研究表明，OPC 抗自由基氧化能力是維生素E 的50 倍、維生素C 的20倍[13]。近年來(lái)，有關(guān)OPC 的生理活性和藥用價(jià)值已進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)OPC 具有重要作用，如抗氧化、抗炎活性、抗衰老、促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù)等[14]。鑒于此，為了進(jìn)一步證實(shí)OPC 拮抗豬顆粒細(xì)胞氧化損傷的能力，采用過(guò)氧化氫（H2O2）制備豬顆粒細(xì)胞氧化損傷模型，研究OPC 對(duì)豬顆粒細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以期闡明OPC 抗豬顆粒細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制，旨在為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

原花青素B2（GSPB2）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；胰酶、DAPI 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Trizol Reagent、TaqDNA 聚合酶和RT-PCR 試劑盒購(gòu)TaKaRa 公司；ROS 試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；H2O2（30%，AR 級(jí)）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（MTT），過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；p16 和Stir1 抗體購(gòu)自Abcam 公司；p21 抗體購(gòu)自Proteintech公司。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用卵巢采自鄭州市肉聯(lián)屠宰場(chǎng)，卵巢來(lái)自體質(zhì)量為（120±5）kg 的三元母豬。母豬屠宰后，根據(jù)卵泡發(fā)育狀況采集處于卵泡期且發(fā)育良好的卵巢，去掉系膜等殘余組織立即放入37 ℃生理鹽水的保溫杯，于2～3 h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。卵巢運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后將100 U/mL 青霉素和50 mg/L 鏈霉素添加至預(yù)熱生理鹽水（37 ℃）進(jìn)行洗滌3 次。然后將卵巢放于37 ℃滅菌的生理鹽水中置于水浴鍋內(nèi)。

1.3 顆粒細(xì)胞分離與培養(yǎng)

使用20 mL 注射器抽取直徑為3～5 mm 的健康卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞，將抽吸的卵泡液與顆粒細(xì)胞放置于50 mL 離心管內(nèi)，在37 ℃水浴鍋中自然沉降10～15 min，1 000 r/min 離心5 min，然后利用注射器緩慢吸取上清后，利用PBS 清洗顆粒細(xì)胞2 次，1 000 r/min 離心5 min，去除PBS。然后將預(yù)熱的DMEM/F12+10% 胎牛血清（FBS）培養(yǎng)基（含100 U/mL 青霉素和50 mg/L 鏈霉素）1～3 mL 添加至顆粒細(xì)胞中，使用攜帶1 mL槍頭的移液器充分吹打顆粒細(xì)胞至完全散開(kāi)。調(diào)整好所需細(xì)胞密度后，接種于T25 培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后觀察顆粒細(xì)胞貼壁情況，去除培養(yǎng)基、卵母細(xì)胞及未貼壁的顆粒細(xì)胞，PBS清洗一次，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代，用于后續(xù)相關(guān)研究。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分3 組：（1）空白對(duì)照組（CK），換DMEM/F12+5%FBS 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（2）氧化應(yīng)激組（H2O2），換DMEM/F12+5%FBS 培養(yǎng)基24 h 后，加入終濃度為200 μmol/L H2O2培養(yǎng)12 h；（3）GSPB2+H2O2組，換DMEM/F12+5%FBS 培養(yǎng)基，不同濃度的GSPB2預(yù)處理24 h后加H2O2孵育12 h。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 細(xì)胞活力分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的顆粒細(xì)胞，每孔2 000 個(gè)接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后，按分組要求給予不同因素的處理，每組設(shè)6個(gè)平行孔，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，室溫振搖10 min，然后在酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)定每孔的OD值，取其6孔的平均值，計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.5.2 細(xì)胞凋亡測(cè)定 各組細(xì)胞爬片用PBS 清洗3次，4%多聚甲醛固定。采用缺口末端標(biāo)記法（TUNEL 法）檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。相關(guān)操作按照羅氏細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體（細(xì)胞核中呈現(xiàn)綠色小體）即為T(mén)UNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。選取豬顆粒細(xì)胞分布均勻的視野，在熒光顯微鏡下選擇5個(gè)視野，記錄凋亡的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算凋亡細(xì)胞率。

1.5.3 ROS 活性分析 各組細(xì)胞爬片用PBS 清洗3次，采用GENMED 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激ROS 紅色熒光試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS 活性。相關(guān)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用倒置熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞ROS 活性，在熒光顯微鏡下記錄5 個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)量，采用Image J軟件測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.5.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 利用移液器吸去各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，利用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞后，立即放入預(yù)冷的PBS中，在4 ℃條件下離心沉淀，冰浴中利用超聲破碎細(xì)胞，分別測(cè)定不同處理組顆粒細(xì)胞內(nèi)CAT、SOD、GSH-Px 活性及MDA含量，測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。選取不同處理組顆粒細(xì)胞，應(yīng)用β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測(cè)衰老細(xì)胞。

1.5.5 定量PCR 檢測(cè)和Western blot 分析 利用TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和定量PCR 檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。本研究中所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。收集各組顆粒細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western blot 分析，采用Image J 軟件進(jìn)行分析Sirt1、p16和p21蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primers for real-time fluorescence quantitative PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。均值比較采用單因素方差分析，差異顯著水平為P＜0.05，差異極顯著水平為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2和GSPB2對(duì)豬顆粒細(xì)胞存活率的影響

利用H2O2處理豬顆粒細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞體外氧化應(yīng)激損傷模型。如圖1A 所示，顆粒細(xì)胞在不同濃度（50、100、200、300、500、1 000 μmol/L）H2O2作用12 h 后，隨著H2O2濃度的升高，顆粒細(xì)胞的活力逐漸下降。與對(duì)照組相比，200 μmol/L H2O2處理12 h，顆粒細(xì)胞活力極顯著降低（P＜0.01）。如圖1B所示，用不同濃度（1、5、10、25、50、100 μmol/L）的GSPB2預(yù)處理豬顆粒細(xì)胞24 h，GSPB2濃度在1～25 μmol/L對(duì)顆粒細(xì)胞無(wú)毒性，但當(dāng)濃度超過(guò)50 μmol/L 時(shí)對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出了毒性作用。因此，選取1～25 μmol/L作為后續(xù)試驗(yàn)使用濃度。如圖1C 所示，GSPB2（10、25 μmol/L）預(yù)處理24 h能顯著提高由H2O2損傷的顆粒細(xì)胞存活率（P＜0.05）。

2.2 GSPB2 對(duì)H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞ROS水平和凋亡的影響

細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性（ROS）紅色熒光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2A 和圖2B。與對(duì)照組相比，H2O2模型組（200 μmol/L）細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著升高（P＜0.05）；與H2O2模型組相比，GSPB2 組（10 μmol/L）細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低（P＜0.05）。采用TUNEL 方法檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡，結(jié)果見(jiàn)圖2C 和圖2D。與對(duì)照組相比，H2O2模型組（200 μmol/L）凋亡細(xì)胞率明顯增加（P＜0.05）；與H2O2模型組相比，GSPB2 組（10 μmol/L）凋亡細(xì)胞率顯著降低（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，GSPB2 可通過(guò)抑制顆粒細(xì)胞ROS 水平和凋亡來(lái)保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的豬顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

2.3 GSPB2對(duì)H2O2損傷豬顆粒細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

如圖3A—D 結(jié)果所示，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可引起豬顆粒細(xì)胞SOD、GSH-Px 及CAT 活性明顯降低（P＜0.05）；與H2O2模型組（200 μmol/L）相比，GSPB2 預(yù)處理后顆粒細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px 及CAT活性明顯升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，H2O2模型組（200 μmol/L）顆粒細(xì)胞中MDA 含量明顯增高（P＜0.05）；與H2O2模型組相比，GSPB2（10 μmol/L）預(yù)處理后顆粒細(xì)胞中MDA 含量顯著降低（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，GSPB2 能顯著增強(qiáng)顆粒細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性和降低過(guò)氧化脂質(zhì)含量，從而增強(qiáng)顆粒細(xì)胞清除自由基的能力。

圖3 GSPB2對(duì)H2O2損傷豬顆粒細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of GSPB2 on oxidative stress indexes in H2O2-injured PGCs

2.4 GSPB2對(duì)H2O2損傷豬顆粒細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的影響

定量PCR 分析結(jié)果（圖4）顯示，豬顆粒細(xì)胞經(jīng)H2O2（200 μmol/L）處理12 h，Bcl-2/Bax比值、Sirt1的mRNA 水平與對(duì)照組相比明顯下降，Caspase3、Bim、Fas和Puma的mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）。與H2O2模型組（200 μmol/L）相比，GSPB2（10 μmol/L）預(yù)處理后顆粒細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平具有顯著改善作用（P＜0.05）。這表明GSPB2 可能是通過(guò)調(diào)控Sirt1及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)減緩了H2O2誘導(dǎo)的豬顆粒細(xì)胞氧化損傷。

圖4 GSPB2對(duì)H2O2損傷豬顆粒細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of GSPB2 on expression of related genes in H2O2-injured PGCs

2.5 GSPB2 對(duì)H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞衰老的保護(hù)作用

β-半乳糖苷酶檢測(cè)分析（圖5A）表明，豬顆粒細(xì)胞經(jīng)H2O2（200 μmol/L）處理12 h，顆粒細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性與對(duì)照組相比顯著提高（P＜0.05）。與 H2O2模型組（200 μmol/L）相比，GSPB2（10 μmol/L）預(yù)處理24 h 后，顆粒細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性顯著降低（P＜0.05）。Western blot分析結(jié)果顯示（圖5B、5C），與對(duì)照組相比，H2O2（200 μmol/L）處理豬顆粒細(xì)胞24 h 后，Sirt1 蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，p16 和p21 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。用10 μmol/L 的GSPB2 預(yù)處理24 h 后，Sirt1 蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，p16 和p21 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，GSPB2 可能是通過(guò)調(diào)控Sirt1、p16 和p21 蛋白的表達(dá)，減緩了氧化應(yīng)激誘發(fā)的豬顆粒細(xì)胞衰老。

圖5 GSPB2對(duì)H2O2誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞衰老的保護(hù)作用Fig.5 Protective effect of GSPB2 on senescence of PGCs induced by H2O2

3 結(jié)論與討論

本研究采用H2O2處理豬卵巢顆粒細(xì)胞，建立顆粒細(xì)胞體外氧化應(yīng)激損傷模型，添加GSPB2 進(jìn)行干預(yù)，探索其緩解顆粒細(xì)胞氧化損傷的分子靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。H2O2誘導(dǎo)的豬顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激可使細(xì)胞存活率顯著降低，而添加不同濃度的GSPB2 預(yù)處理后可提高顆粒細(xì)胞活力，抑制H2O2誘導(dǎo)的豬顆粒細(xì)胞氧化損傷作用。TUNEL 和ROS 檢測(cè)結(jié)果表明,用低濃度的GSPB2 預(yù)處理豬顆粒細(xì)胞再進(jìn)行氧化應(yīng)激處理，顆粒細(xì)胞凋亡率和ROS 水平顯著降低。

SOD 是機(jī)體內(nèi)自由基的頭號(hào)殺手，能快速將體內(nèi)有害自由基分解成無(wú)害的水分子和氧分子從而消除組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化[15-17]。GSH-PX 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，可使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能免受過(guò)氧化物的損害[11]。CAT存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物體內(nèi)，主要職責(zé)是催化過(guò)氧化氫分解成氧和水[12]。MDA 是機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝中產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，間接反映組織細(xì)胞的損傷情況[6]。本研究結(jié)果表明，GSPB2 可拮抗H2O2引起的豬顆粒細(xì)胞中SOD、GSH-PX和CAT活性降低，以及MDA 含量的升高，這表明GSPB2 具有清除顆粒細(xì)胞氧自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，其作用在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。

Sirt1 蛋白是組蛋白脫乙?；涪蠹易宄蓡T，參與多種細(xì)胞生理過(guò)程。大量研究表明，Sirt1 蛋白在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中起重要調(diào)控作用[18]。GAY 等[19]報(bào)道，Sirt1 蛋白表達(dá)水平在神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷中顯著下調(diào)；王飛清等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1基因在衰老雌鼠卵巢中的表達(dá)量顯著下調(diào)。p21 蛋白是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老及死亡過(guò)程[21]。p16 蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，在細(xì)胞衰老中發(fā)揮了重要的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中，多種信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑都涉及p16和p21基因表達(dá)的改變[23]。本研究在豬顆粒細(xì)胞體外氧化損傷中也發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L H2O2處理12 h 可誘發(fā)豬顆粒細(xì)胞氧化損傷，同時(shí)Sirt1 蛋白表達(dá)下調(diào)，p16 和p21 蛋白表達(dá)上調(diào)；而補(bǔ)充GSPB2 再經(jīng)H2O2處理，Sirt1、p16 和p21 的表達(dá)顯著抑制，表明GSPB2 具有抗顆粒細(xì)胞氧化損傷和延緩衰老的作用。

綜上所述，GSPB2 可有效抑制H2O2誘導(dǎo)的豬顆粒細(xì)胞氧化損傷，降低了凋亡數(shù)量。GSPB2 可能是通過(guò)提高Bcl-2/Bax表達(dá)比例，上調(diào)Sirt1 蛋白表達(dá)，下調(diào)p16 和p21 蛋白的表達(dá)，抑制顆粒細(xì)胞氧化損傷及衰老。