徐逸群，郭 瑤，劉慶坡

（浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江 臨安 311300）

砷及砷化合物是重要的環(huán)境污染物[1]。高濃度的砷可嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[2]。與旱糧作物相比，水稻由于獨特的生理特性及種植方式具有更強的砷吸收與富集能力[3]。由此引發(fā)的水稻砷污染問題亟待解決。提高水稻的耐砷性有助于解決水稻砷污染問題。目前，已有少數(shù)水稻耐砷基因和miRNA被陸續(xù)鑒定[4-6]。但是，水稻的耐砷性是受多基因控制的。因此，迫切需要挖掘新的基因，并深入揭示它們在水稻響應(yīng)砷脅迫中的生物學(xué)功能。

漆酶（EC 1.10.3.2；LAC）是一類多銅氧化酶，能夠催化多種芳香族和非芳香族底物的氧化，廣泛分布于植物[7-13]、真菌[14]、細(xì)菌[15]和昆蟲[16]中。植物基因組中編碼漆酶的基因數(shù)量眾多[7-8，10-11，17]，它們具有不同的基因結(jié)構(gòu)和時空表達(dá)模式，暗示漆酶基因已發(fā)生了明顯的功能分化[17]。目前，大多數(shù)漆酶基因的功能尚未知。研究發(fā)現(xiàn)，漆酶影響植物的生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答[7，9，12-13]。擬南芥AtLAC4、AtLAC11、AtLAC17，白梨PbLAC1，竹子PeLAC10，棉花GhLAC1、GhLAC15等基因主要參與木質(zhì)素的合成[8-13]。其中，超表達(dá)GhLAC1和GhLAC15基因顯著增強了轉(zhuǎn)基因棉花對真菌病害和蟲害的耐受性[12-13]。

水稻（Oryza sativaL.）中共有30 個漆酶基因[7]，但目前僅有少數(shù)漆酶基因的功能被鑒定。YU 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，OsLAC13基因通過調(diào)節(jié)蔗糖運輸和過氧化氫生成影響水稻的結(jié)實率。LIU 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，OsLAC10基因受激素、干旱、高鹽和重金屬脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，超表達(dá)該基因明顯提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對銅離子的耐受能力。此外，miR397/OsLAC在控制水稻產(chǎn)量形成和除草劑抗性等方面具有重要作用[19-20]。但是，漆酶基因是否參與水稻砷脅迫應(yīng)答尚不清楚。為此，在水稻中超表達(dá)OsLAC6基因，分析轉(zhuǎn)基因株系在正常及亞砷酸鹽處理下的表型、生理生化指標(biāo)等，探討其在水稻亞砷酸鹽脅迫應(yīng)答中的作用，為深入分析漆酶基因調(diào)控水稻耐砷性的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

水稻材料為粳稻品種日本晴，由中國水稻研究所提供。植物表達(dá)載體為pCAMBIA1300，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及陽性鑒定

利用CTAB 法提取水稻葉片基因組DNA[21]。利用引物（5′-GGTACCATGGGCACTCCCCGTGGCCT-3′和5′-CCCGGGGCACTTGGGAAGATCCGACG-3′）從日本晴基因組中擴增出OsLAC6基因的編碼區(qū)序列（CDS）。使用KpnⅠ和SmaⅠ對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后連接至pCAMBIA1300 載體，采用熱激法將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。經(jīng)PCR 擴增及測序正確后，將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，再次PCR 檢測正確后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入日本晴愈傷組織，經(jīng)潮霉素抗性篩選后獲得超表達(dá)OsLAC6基因的轉(zhuǎn)基因植株。

利用OsLAC6基因特異引物（5′-AGCCCTGCCTTCATACGCTATTT-3′）結(jié)合載體特異引物（5′-CCAGTGGAACGAGACGTTGTA-3′）對轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行陽性鑒定。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃7 min。

1.3 OsLAC6基因的表達(dá)模式分析

分別收獲水稻幼苗期、分蘗期和成熟期的根系、莖、葉片，幼苗期根莖結(jié)合部，分蘗期節(jié)，孕穗期和抽穗期小穗，開花期穎殼和花。各時期每種材料分別取0.5 g，采用TRIzol 法提取各材料的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen）將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后在BIO-RAD CFX96 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴增。OsLAC6基因熒光定量PCR 引物序列為5′-GTTCGGTTCCTCGCCGACAATC-3′、5′-CACTTGGGAAGATCCGACGGC-3′。反應(yīng)程序如下：95 ℃5 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)；72 ℃7 min。以UBQ（Ubiquitin）基因（正向引物：5′-AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3′，反向引物：5′-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA-3′）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算OsLAC6基因在不同時期各組織部位的相對表達(dá)量。

1.4 漆酶活性檢測

參照BERTHET 等[22]的方法進(jìn)行漆酶活性檢測。取生長7 d 的轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻幼苗葉片0.8 g，用液氮充分研磨，加入植物蛋白質(zhì)提取液（1∶99，含Protease Inhibitor Cocktail）劇烈振蕩后，置于冰上孵育20 min，并在4 ℃條件下13 400×g離心20 min，收集上清液待用。將漆酶底物2，2′-疊氮基雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成終質(zhì)量濃度為11 g/L 的溶液，于-20 ℃保存。反應(yīng)體系包含100 mmol/L 乙酸鹽緩沖液（pH 值5.0）、1 mmol/L ABTS 和20 μL 蛋白質(zhì)提取物，總反應(yīng)體積為200 μL。待混合液在30 ℃反應(yīng)0.5 h 后，在420 nm 處測定吸光值，根據(jù)ABTS 氧化生成穩(wěn)定陽離子自由基情況來評估漆酶的活性。

1.5 幼苗培養(yǎng)及亞砷酸鹽脅迫處理

選取野生型（WT）日本晴和超表達(dá)OsLAC6基因水稻株系的健康飽滿的種子，用5 g/L NaClO 溶液消毒15 min，然后用純凈水漂洗3～5 次，浸泡24 h。將種子轉(zhuǎn)移至添加適量5 g/L CaCl2溶液的發(fā)芽盒中，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，培養(yǎng)條件設(shè)為30 ℃光照16 h/25 ℃黑暗8 h。待幼苗長至約4 cm，挑選長勢一致的幼苗置于營養(yǎng)液[0.091 mmol/L KNO3、0.183 mmol/L Ca（NO3）2、0.274 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L KH2PO4、0.183 mmol/L （NH4）2SO4、0.5 μmol/L MnCl2、3 μmol/L H3BO3、0.1 μmol/L（NH4）6Mo7O24、0.4 μmol/L ZnSO4、0.2 μmol/L CuSO4、40 μmol/L NaFe（Ⅲ）-EDTA、2 mmol/L 2-嗎啉磺酸，pH值5.5]中培養(yǎng)，每3 d換一次營養(yǎng)液。待苗齡21 d時，分別用0（對照，CK）、25 μmol/L 亞砷酸鈉[As（Ⅲ）]進(jìn)行處理。

1.6 根系相對伸長量及生理生化指標(biāo)的測定

1.6.1 根系相對伸長量 在As（Ⅲ）處理0 d 和7 d

時，測定WT 和超表達(dá)OsLAC6基因水稻株系幼苗的根長，計算根系相對伸長量。

1.6.2 葉綠素含量 As（Ⅲ）處理7 d后，取WT和超表達(dá)OsLAC6基因水稻株系葉片0.2 g，剪成1 cm 大小，隨后加入10 mL乙醇和丙酮混合液（1∶1）避光萃取，每隔3 h 晃動一次，待葉片完全變成白色后，分別在663 nm 和645 nm 處測定吸光值（A663和A645）。葉綠素a、b 含量按以下公式進(jìn)行計算：葉綠素a 含量=（12.72A663-2.59A645）×10/200，葉綠素b 含量=（22.88A645-4.67A663）×10/200。

1.6.3 過氧化氫含量 As（Ⅲ）處理后7 d，取WT 和超表達(dá)OsLAC6基因水稻株系相同部位的葉片，立即置于含有二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染液的離心管中，在室溫下進(jìn)行黑暗處理，直至出現(xiàn)明顯表型。然后，將染色后的葉片置于70%乙醇中保存，在體式顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.6.4 木質(zhì)素含量 根據(jù)胡琴等[23]的方法，選取WT和轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系相同部位的根系，浸沒于30 g/L 間苯三酚溶液（將3 g 間苯三酚溶于100 mL 95%乙醇）中，抽真空10 min，使染液充分滲入根系組織中。隨后，將染色的根系取出轉(zhuǎn)移至20%鹽酸溶液中浸泡10 min，置于體式顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0 中的最小顯著性差異法（LSD）進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsLAC6基因的表達(dá)模式分析

從圖1 可見，OsLAC6基因在水稻不同生長發(fā)育階段的組織中具有不同的表達(dá)模式，在分蘗期和成熟期的根系、莖、葉片以及分蘗期的節(jié)中表達(dá)量比較高；而在幼苗期的莖、葉片、根莖結(jié)合部以及孕穗期和抽穗期的小穗、開花期的穎殼和花中表達(dá)量較低。此外，與幼苗期的莖和葉片相比，OsLAC6基因在水稻幼苗期根系中的表達(dá)量相對較高。

圖1 OsLAC6基因在水稻不同生長發(fā)育階段各組織中的表達(dá)水平Fig.1 Expression level of OsLAC6 gene in tissues at different growth stages in rice

2.2 陽性轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻植株的鑒定

共獲得30 個轉(zhuǎn)OsLAC6基因T0植株。使用OsLAC6基因和載體的特異引物進(jìn)行PCR 檢測（圖2），發(fā)現(xiàn)24個為轉(zhuǎn)基因陽性植株（OE-OsLAC6），陽性率達(dá)80%。

圖2 部分轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻植株的PCR檢測Fig.2 PCR detection of partial transgenic rice plants overexpressing OsLAC6 gene

運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析OsLAC6基因在陽性轉(zhuǎn)基因水稻幼苗葉片中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)OsLAC6基因在各轉(zhuǎn)基因株系中均上調(diào)表達(dá)，特別是在OE-OsLAC6-4、OE-OsLAC6-20株系中的表達(dá)量分別極顯著上調(diào)了約5 458、1 236 倍（圖3）。綜合考慮各轉(zhuǎn)基因株系的種子量及OsLAC6基因的表達(dá)水平等，選擇上述2 個株系進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系葉片中OsLAC6基因的表達(dá)分析Fig.3 Expression of the OsLAC6 gene in the leaves of transgenic rice lines overexpressing OsLAC6 gene

2.3 轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻植系漆酶活性分析

從圖4 可以看出，轉(zhuǎn)基因株系OE-OsLAC6-4 和OE-OsLAC6-20 葉片中漆酶活性分別比WT 極顯著增加13.8%和23.9%，表明超表達(dá)OsLAC6基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因水稻漆酶活性。

圖4 轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系漆酶活性分析Fig.4 Analysis of laccase activity of transgenic rice lines overexpressing OsLAC6 gene

2.4 轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系的亞砷酸鹽耐受性分析

與WT 相比，經(jīng)25 μmol/L As（Ⅲ）處理3 d，轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系的葉片出現(xiàn)明顯卷曲，低葉位葉片開始黃化，并且隨著處理時間的延長，其葉片枯黃程度加劇。至處理7 d 時，WT 葉片僅輕微卷曲，而2個轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系的葉片大部分已枯萎（圖5）；且2個轉(zhuǎn)基因水稻株系的根系相對伸長量顯著低于WT（圖6），表明其根系的生長受到嚴(yán)重抑制。綜上，超表達(dá)OsLAC6基因明顯降低了轉(zhuǎn)基因水稻對亞砷酸鹽的耐受性。

圖5 As（Ⅲ）處理7 d后WT和轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系的表型Fig.5 Phenotypes of WT and transgenic rice lines overexpressing OsLAC6 gene after As（Ⅲ）treatment for 7 days

圖6 As（Ⅲ）處理7 d后WT和轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系根系相對伸長量的比較Fig.6 Comparison of relative root elongation of WT and transgenic rice lines overexpressing OsLAC6 gene after As（Ⅲ）treatment for 7 days

2.5 亞砷酸鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系生理生化指標(biāo)分析

2.5.1 葉綠素含量 葉片枯黃是水稻砷中毒的主要癥狀之一，這主要是因為葉綠素含量的改變[24]。從圖7 可以看出，在正常生長條件下，WT 和轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系葉片的葉綠素含量并無明顯不同。As（Ⅲ）處理后，WT 和轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系葉片的葉綠素含量均出現(xiàn)不同程度的下降。其中，WT未達(dá)到顯著水平，而2個轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系均達(dá)到顯著水平。

圖7 As（Ⅲ）處理后WT和轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系葉綠素含量的比較Fig.7 Comparison of chlorophyll content of WT and transgenic rice lines overexpressing OsLAC6 gene after As（Ⅲ）treatment

2.5.2 過氧化氫含量 在砷脅迫條件下，水稻體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧，使氧化還原平衡遭到破壞，對植株造成過氧化損傷[24]。DAB 可被過氧化氫氧化形成沉淀。因此，可通過DAB 染色推斷各水稻材料所受氧化脅迫的程度。從圖8 可以看出，在對照條件下，WT 和轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系間并無明顯差異；As（Ⅲ）處理7 d 后，相較于WT，轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系葉片的染色程度更深且范圍更廣，表明亞砷酸鹽脅迫下轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻比WT 遭受了更嚴(yán)重的氧化傷害。

圖8 As（Ⅲ）處理后WT和各轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系葉片的DAB染色Fig.8 DAB staining in the leaves of WT and transgenic rice lines overexpressing OsLAC6 gene after As（Ⅲ）treatment

2.6 轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻植株根系木質(zhì)素含量分析

從圖9 可以看出，在正常生長條件下，WT 植株的根系染色較深，呈現(xiàn)出明顯的紅色，而2 個轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系的根系染色明顯較淺，表明超表達(dá)OsLAC6基因使轉(zhuǎn)基因水稻根系中的木質(zhì)素含量大幅度減少。

圖9 WT和轉(zhuǎn)OsLAC6基因水稻株系根系木質(zhì)素含量比較Fig.9 Comparison of lignin content in the roots of WT and transgenic rice lines overexpressing OsLAC6 gene

3 結(jié)論與討論

近年來，有關(guān)水稻耐砷性基因的鑒定及耐砷機制解析等方面取得了重要進(jìn)展[4-5，25-28]。研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因OsPT4和OsPT8會顯著降低轉(zhuǎn)基因水稻的耐砷性[25-26]；相反，超表達(dá)砷酸還原酶基因OsHAC1；1、OsHAC1；2和OsHAC4以及C 型ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白基因OsABCC1的轉(zhuǎn)基因植株的耐砷性顯著增強[5，27-28]。這些基因主要負(fù)責(zé)水稻中As（Ⅴ）和As（Ⅲ）吸收、As（Ⅴ）還原以及阻隔砷向籽粒轉(zhuǎn)移等。此外，miRNA 也參與調(diào)控水稻應(yīng)答砷脅迫的生物學(xué)過程[6，29]。在水稻中，超表達(dá)miR528可致使轉(zhuǎn)基因植株對砷的敏感性增強[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，OsLAC6基因可負(fù)調(diào)控水稻對亞砷酸鹽的耐受性，這不僅豐富了對水稻漆酶生物學(xué)功能的認(rèn)識，更擴展了對水稻應(yīng)答砷脅迫機制的理解。

木質(zhì)素在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，而漆酶可通過調(diào)控植物木質(zhì)素代謝影響其生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答。ZHAO 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥Atlac4、Atlac11和Atlac17三突變體的根系中幾乎檢測不到木質(zhì)素，表明上述漆酶基因正調(diào)控木質(zhì)素的合成。水稻OsLAC10和棉花GhLAC1等基因通過促進(jìn)木質(zhì)素合成而增強植物對銅離子、病原菌和蟲害脅迫的耐受能力[7，12]。但是，超表達(dá)擬南芥AtLAC2基因可降低轉(zhuǎn)基因植株地上部木質(zhì)素含量，從而負(fù)調(diào)控植物的生長發(fā)育[30]。同樣地，本研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)OsLAC6基因會大幅降低轉(zhuǎn)基因水稻根系木質(zhì)素含量。因此，OsLAC6基因可能與漆酶家族中其他成員如OsLAC10基因等具有相反的生物學(xué)功能。推測超表達(dá)OsLAC6基因所出現(xiàn)的耐砷性下降也許與轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素含量減少有關(guān)，但具體的作用機制還需進(jìn)一步研究。