張秀森，王海瑞，劉書培，趙 迪，高社干,2

食管癌是消化道常見惡性腫瘤，河南屬于高發(fā)區(qū)[1]。食管癌的早期診斷缺乏特異性，多數患者發(fā)現(xiàn)異常檢查確診時已處于中晚期[2]。盡管目前食管癌的治療手段頗多，但由于其惡性程度高、發(fā)現(xiàn)診斷晚，多數患者預后仍不佳[3]。因此，探討食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機制對發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和改善預后有重大意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度超過200個核苷酸、蛋白編碼能力極低的內源性RNA，已被證明基本參與了各種基礎生物學事件和疾病[4-5]。LncRNA ZEB2-AS1是一種新型的lncRNA，研究表明其異常表達與肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、結腸癌等的進展及預后有關。LncRNA ZEB2-AS1在食管癌中的表達情況及作用機制尚不清楚。本研究通過干擾LncRNA ZEB2-AS1在食管癌中的表達，探尋其對食管癌細胞增殖及侵襲影響的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人正常食管上皮細胞系HEEC及食管鱗癌細胞系(KYSE140、KYSE150、KYSE450、KYSE30、KYSE70、EC9706)均來源于河南科技大學第一附屬醫(yī)院河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室。細胞培養(yǎng)基為RPMI-1640(博士德生物工程有限公司)、蛋白印跡試劑盒(康為世紀生物科技股份有限公司)、熒光定量PCR試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)、INVI DNA RNA Transfection Reagent轉染試劑(美國invigentech公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、si-LncRNA ZEB2-AS1及si-NC序列由廣州易錦公司設計合成。

1.2 細胞培養(yǎng)完全培養(yǎng)基(RPMI-1640+10%FBS，1%青鏈霉素)培養(yǎng)KYSE150細胞，37 ℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d換液1次，細胞長至80%左右傳代，取對數生長期細胞做下一步實驗。

1.3 實時定量PCR提取人食管上皮細胞系HEEC及食管鱗癌細胞系(KYSE140、KYSE150、KYSE450、KYSE30、KYSE70、EC9706)的總RNA，逆轉錄為cDNA后采用RT-PCR測定LncRNA ZEB2-AS1 的mRNA相對表達量，反應條件為：95 ℃ 12 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。LncRNA ZEB2-AS1 PCR引物序列，正向，5’-ATG AAG AAG CCG CGA AGT GT-3’，反向,5’-CAC ACC CTA ATA CAC ATG CCC T-3’; GAPDH 正向,5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，反向,5’-TCC ACC CTG TTG CTG TA-3’。按2-ΔΔCt法計算上述細胞系中LncRNA ZEB2-AS1的表達水平。

1.4 細胞轉染轉染前1 d，將細胞接種于無抗生素的10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，按照密度為1×105個細胞/孔接種于6孔板中。取對數生長期細胞，使用INVI DNA RNA Transfection Reagent轉染試劑轉染，10 h后更換培養(yǎng)基。轉染24 h后，收集細胞進行下一步分析。

1.5 細胞增殖實驗采用CCK8法測定細胞系KYSE150的增殖能力，將對數生長的細胞以每孔3.0×103個細胞的密度接種在96孔板中。細胞分別孵育0、24、48、72和96 h。加入CCK8液10 μL，在450 nm波長下測定OD值，并制作細胞增殖曲線。

1.6 Transwell實驗根據不同的分組，在Transwell小室上腔室中加入1×105個細胞置于無血清或生長因子的培養(yǎng)基中，在下腔室中使用補充有10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為化學引誘劑。孵育24 h后，取出小室，用棉簽除去未侵入膜的細胞，用4%的甲醛固定小室上的穿膜細胞，用結晶紫染色，鏡下計數細胞量。

1.7 Western-blotting收集相應處理的細胞，加入裂解液，冰上勻漿。4 ℃離心，收集上清，提取蛋白。采用BCA定量法測定蛋白含量。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，80V轉膜2.5 h后封閉1 h。4 ℃一抗孵育過夜。使用含Tween-20的Tris緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)清洗3×5 min，加入二抗室溫孵育2 h。TBST 3×5 min清洗，暗室下加入ECL發(fā)光液曝光，拍攝圖片并記錄相應蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 LncRNA ZEB2-AS1在食管癌細胞系中的表達qRT-PCR結果顯示，食管癌細胞系KYSE140、KYSE150、KYSE450、KYSE30、KYSE70、EC9706中LncRNA ZEB2-AS1相對表達量均高于HEEC細胞系(P<0.05)，以KYSE150細胞系中相對表達量最高，因此后續(xù)選用KYSE150細胞進行實驗，見圖1。

①與HEEC組比較，P<0.05。

2.2 LncRNA ZEB2-AS1沉默細胞系構建實驗分為si-LncRNA ZEB2-AS1組、si-NC組、NC組，用慢病毒包裝試劑盒將LncRNA ZEB2-AS1及si-NC轉染到細胞系中，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞系，共聚焦顯微鏡觀察熒光效果，圖2A。qRT-PCR示，KYSE150細胞轉染si-LncRNA ZEB2-AS1后，si-LncRNA ZEB2-AS1組LncRNA ZEB2-AS1相對表達量為3.12±0.12，si-NC組LncRNA ZEB2-AS1相對表達量為10.49±0.32，NC組LncRNA ZEB2-AS1相對表達量為11.61±0.27，si-LncRNA組中LncRNA ZEB2-AS1相對表達量低于si-NC組和NC組(均P<0.01)，提示LncRNA ZEB2-AS1表達沉默成功，見圖2B。

A：LncRNA ZEB2-AS1沉默細胞；B：LncRNA ZEB2-AS1沉默效率測定。①P<0.01。

2.3 沉默LncRNA ZEB2-AS1表達可抑制食管癌細胞增殖CCK8示，轉染24 h，si-LncRNA ZEB2-AS1組、si-NC組及NC組A450nm值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；轉染48 h，si-LncRNA ZEB2-AS1組A450nm值低于si-NC組[(0.27±0.13)VS (0.52±0.1)，P<0.05]；轉染72 h，si-LncRNA ZEB2-AS1組A450nm值低于si-NC組[(0.53±0.13)VS (1.36±0.14)，P<0.05]；轉染96h，si-LncRNA ZEB2-AS1組A450nm值低于si-NC組[(0.62±0.13)VS(1.78±0.13)，P<0.05]，上述研究結果提示沉默si-LncRNA ZEB2-AS1表達后，細胞增殖能力受到抑制。見圖3。

①與si-LncRNA ZEB2-AS1組比較，P<0.05。

2.4 沉默LncRNA ZEB2-AS1表達抑制食管癌細胞侵襲Transwell侵襲實驗顯示：si-LncRNA組侵襲細胞數少于si-NC組[(63.0±1.58)VS (126.0±3.22)，P<0.05]，si-LncRNA組侵襲細胞數少于NC組[(63.0±1.58)VS (110±3.6)，P<0.05]，而si-NC組和NC組間侵襲細胞數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

2.5 沉默LncRNA ZEB2-AS1表達對食管癌細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響Western blot檢測結果顯示，沉默LncRNA ZEB2-AS1表達后，si-LncRNA ZEB2-AS1 組 Wnt1 蛋白相對表達量低于si-NC 組[(0.35±0.03)VS (1.25±0.03)，P<0.05]，而si-NC組與NC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，si-LncRNA ZEB2-AS1組β-catenin蛋白相對表達量低于si-NC組[(0.42±0.01)VS (0.90±0.06)，P<0.05]，而si-NC組與NC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

A：3組Wnt及β-catenin蛋白相對表達量比較；B：Western blot示3組Wnt及β-catenin蛋白表達。1：si-LncRNA ZEB2-AS1組；

3 討論

食管癌是發(fā)生于上消化道的常見惡性腫瘤之一，其死亡率居高不下，分布有明顯的地域性和種族性，在中國河南林州市高發(fā)。食管癌最典型的癥狀是進行性咽下困難，但早期癥狀不特異，發(fā)現(xiàn)時通常為晚期，預后極差。目前手術、放化療是食管癌的主要治療方法，但效果欠佳。因此，食管癌發(fā)生、發(fā)展及轉移相關分子靶點的尋找至關重要，以預測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后情況，針對新靶點的治療同樣具有極其重要的意義。鋅指E盒結合同源盒2反義RNA1(LncRNA ZEB2-AS1)是來自ZEB2啟動子的非編碼反義轉錄物，文獻報道在多種癌癥中發(fā)揮關鍵作用，促進癌癥的發(fā)生發(fā)展[6-8]。在非小細胞肺癌中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1通過下調PTEN來提高非小細胞肺癌細胞的生存力和惡性程度，從而促進非小細胞肺癌的進展[9]。在結腸癌中，lncRNA ZEB2-AS1可通過miR-143/bcl-2軸促進結腸癌細胞增殖并抑制凋亡，從而促進結腸癌的發(fā)展[10]。在胃癌中，LncRNA ZEB2-AS1表達量升高，可通過激活Wnt/β-catenin通路[11]，有助于胃癌的腫瘤形成，同時可通過miR-143-5p/HIF-1+軸影響細胞增殖和入侵[12]。LncRNA ZEB2-AS1還可通過調節(jié)miR-204/HMGB1軸促進胰腺癌細胞的生長和入侵[13]。

本研究結果顯示，LncRNA ZEB2-AS1在食管癌細胞系中表達上調，且在不同分化程度的細胞中表達量不同，分化程度越低，LncRNA ZEB2-AS1的表達量越高，在一定程度上可認為與患者的不良預后有關。CCK8法檢測下調LncRNA ZEB2-AS1表達對食管癌KYSE150細胞系增殖的影響，結果顯示，下調LncRNA ZEB2-AS1表達可顯著抑制KYSE150細胞增殖。Transwell侵襲實驗顯示下調LncRNA ZEB2-AS1表達后KYSE150細胞穿膜侵襲能力低于陰性對照組，提示下調LncRNA ZEB2-AS1表達可抑制食管癌細胞轉移。最近研究顯示在肝細胞癌中LncRNA ZEB2-AS1高表達，下調LncRNA ZEB2-AS1表達可顯著抑制肝癌細胞增殖和侵襲過程[14]，與上述結果一致。在膀胱細胞癌、肺癌、胰腺癌和乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)相似結果[15-18]，下調LncRNA ZEB2-AS1的表達可抑制體外培養(yǎng)的癌細胞的增殖和侵襲能力。LncRNA ZEB2-AS1可以正向調節(jié)ZEB2的表達，ZEB2負責Wnt/β-catenin信號通路的激活[19-20]。Wnt/β-catenin信號通路是癌細胞發(fā)生進展的重要信號通路，在正常細胞中其處于低水平表達狀態(tài)，當細胞發(fā)生癌變時，腫瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路的過度活化可促進其惡性進展，增強腫瘤細胞易轉移性，增加治療難度，同時惡化患者的預后[21-23]。本研究重點探討LncRNA ZEB2-AS1表達水平及其對食管癌細胞系中Wnt/β-catenin信號通路的影響，結果發(fā)現(xiàn)，敲低或沉默LncRNA ZEB2-AS1可顯著抑制Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白Wnt1和β-catenin的表達，阻礙Wnt/β-catenin信號通路激活，從而抑制食管癌細胞的增殖和侵襲。

綜上，食管癌細胞系中LncRNA ZEB2-AS1表達較高，通過下調LncRNA ZEB2-AS1表達可抑制食管癌細胞的增殖和侵襲能力，其機制可能與Wnt/β-catenin信號通路的抑制有關。因此，使LncRNA ZEB2-AS1表達下調可能是食管癌的一個新的潛在治療策略。