趙 萍，唐 紅*，劉興宇，何麗霞

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學 林學院，蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學 信息科學技術學院，蘭州 730070；3 甘肅省牡丹工程研究中心，蘭州 730046)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)為芍藥科芍藥屬落葉小灌木，是中國重要的觀賞植物與油料作物之一，同時還具有抗寒、抗旱、耐瘠薄等特性[1]。主要分布于四川北部、甘肅南部和陜西南部(太白山區(qū))等地[2]。牡丹花開花時間較早，花朵壽命較為短暫，單朵花從開放到衰老的時間僅有7～10 d，直接影響到牡丹花朵的觀賞價值，產(chǎn)量也受到較大程度的影響[3]。再者，因地域的不同，牡丹花開放的時間也有較大的差異性，因其開花時間的短暫性，花粉的壽命也極為短暫，對育種極為不利[4-5]。重瓣牡丹的結實性能極為低下，對其油用價值有極大的影響，制約了牡丹的進一步發(fā)展[6]。

花粉是種子植物的微小孢子堆，花粉由雄蕊中的花藥產(chǎn)生，由各種方法到達雌蕊，使胚珠授粉[7]。蔡祖國等[8]對矮牡丹花粉活力測定及花粉萌發(fā)特征的研究認為，硼酸和蔗糖對矮牡丹花藥離體萌發(fā)有著重要的影響。蓋偉玲等[9]通過研究4個牡丹品種的花粉在固體培養(yǎng)基萌發(fā)的情況，認為培養(yǎng)6 h左右是計算牡丹花粉萌發(fā)率的適宜時期。秦瑤等[10]研究表明單瓣品種萌發(fā)時間比重瓣品種萌發(fā)時間短且集中。成熟花粉的生活力因不同種類而變化很大?；ǚ郾Ｗo酶活性、丙二醛(MDA)和蛋白質含量保持穩(wěn)定是花粉保持高活力的生理特征[9]。保護酶活性的高低也是反映花粉活力的重要指標。保護酶活性、MDA和蛋白質含量的高低可以反映花粉的健康程度，與花粉壽命及生活力具有相關性，是花粉萌發(fā)力的直接表現(xiàn)[11-12]。目前，有關紫斑牡丹的研究主要集中在引種栽培[2]、遺傳學[3]、油用性能[13]等方面。關于其單瓣與半重瓣花粉結構、萌發(fā)特性和生理機制方面的系統(tǒng)研究尚未見報道。為此，本研究以甘肅省蘭州市榆中縣官灘溝紫斑牡丹培育基地紫斑牡丹(表1)為材料，探討了3個品種(‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’)單瓣與半重瓣紫斑牡丹花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基，不同品種單瓣和半重瓣紫斑牡丹花粉3 種保護酶的活性、蛋白質以及MDA含量，以期確定不同品種單瓣和半重瓣紫斑牡丹花粉生活力檢測的最佳、最可靠的培養(yǎng)基配方，明確單瓣和半重瓣紫斑牡丹的花粉活力，探討單瓣與半重瓣紫斑牡丹花粉保護酶活性、MDA和蛋白質的含量的相關性，為紫斑牡丹單重瓣研究和雜交育種提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

紫斑牡丹源自甘肅省蘭州市榆中縣官灘溝紫斑牡丹培育基地，于2021年6月中上旬9:00-11：00，采集同一株牡丹植株上同時具有單瓣與半重瓣的將開未開的紫斑牡丹花朵，按品種和單重瓣分別標號，迅速放入冰盒，帶回實驗室。在實驗室中將采回花朵的花萼與外輪花瓣剝去，倒扣在硫酸紙上，置于恒溫培養(yǎng)箱內散粉，24 h后取出，一只手用鑷子夾住倒置的花朵，另一只手輕彈花朵，收集散落的花粉。將收集好的花粉每個編號各分成兩份，一份用于花粉萌發(fā)的測定；另一份30 ℃鼓風干燥箱干燥24 h后，分裝至10 mL帶蓋離心管中儲存，寫好標簽，備用。品種性狀見表1。

表1 紫斑牡丹品種說明

1.2 花粉超微結構觀察

采集完全成熟的花藥，放入2.5%戊二醛溶液中固定4 h以上，生理鹽水清洗3次，每次10 min，30%、50%、70%、80%、90%、100%無水乙醇梯度脫水，醋酸乙戊二酯置換，二氧化碳臨界點干燥，用鑷子將花藥壁撕破，將花粉分別均勻地撒在粘有雙面膠帶的樣品臺上，真空噴金鍍膜，以備觀察、拍照。

1.3 花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基的篩選

選取對植物花粉萌發(fā)影響較大的硼酸和蔗糖作為試驗的2 個影響因素。

培養(yǎng)基配制:由某一濃度蔗糖、硼酸和瓊脂配制而成。將硼酸配制成0.1 g·L-1的溶液，用移液管吸取所需用量加入容量瓶中，將瓊脂稱量后也加入容量瓶中，加蒸餾水定容后加熱至沸騰，冷卻至30 ℃。

用吸管吸取培養(yǎng)液，滴在載玻片上，待其凝固后，蘸取花粉均勻播種在液滴上，將播種有花粉的載玻片放在鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為(25±1)℃、全光照培養(yǎng)6 h后，在顯微鏡下觀察。取4個視野，數(shù)取花粉總數(shù)及萌發(fā)數(shù)，計算萌發(fā)率。統(tǒng)計時，以花粉管長度等于或大于花粉直徑者為萌發(fā)。每個處理設3個重復?；ǚ勖劝l(fā)率計算如下：

花粉萌發(fā)率=花粉管長度大于花粉直徑的花粉數(shù)/觀察花粉數(shù)×100%。

培養(yǎng)基組分優(yōu)化:用A、B兩組配方。

配方A:蔗糖(50、100、150和200 g·L-1)+硼酸0.1 g·L-1+10 g·L-1瓊脂;

配方B:在配方A已初步確定蔗糖濃度的基礎上，硼酸濃度設置4個水平(0.05、0.10、0.15和0.20 g·L-1)。

1.4 花粉蛋白質和丙二醛含量及3種保護酶活性

粗酶液的提?。悍Q取(0.100±0.01) g紫斑牡丹花粉，放入4 ℃預冷研缽中，加入 2 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0)，勻速研磨 30～40 s，之后將研磨液轉移至10 mL離心管，定容至刻度線。將提取液于10 000 r/min 4 ℃離心 20 min，取出上清液，保存至4 ℃冰箱備用待測。

可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍法，過氧化氫酶測定采用(CAT)可見光分光光度法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶(SOD)測定采用氮藍四唑法，過氧化物酶(POD)測定采用愈創(chuàng)木酚法，試劑盒由天津市光復科技發(fā)展有限公司提供。

數(shù)據(jù)用 Excel 2010、SPSS 24和Origin2021進行作圖與方差分析。

2 結果與分析

2.1 花的形態(tài)與花粉特征

單瓣‘象牙白’花白色，花粉數(shù)量多(圖1， A)。半重瓣‘象牙白’花粉較少，部分雄蕊瓣化為花瓣(圖1， B-C)?；ǚ哿?個萌發(fā)溝，是孢粉學研究的最初類型，單瓣‘象牙白’平均極軸長為50.98 μm(47.07～57.34 μm)，平均赤道軸長為23.51 μm(21.73～26.69 μm)，P/E≈2.18(圖2， A)。半重瓣‘象牙白’平均極軸長為43.79 μm(39.63～48.00 μm)，平均赤道軸長為23.42 μm(19.31～24.83 μm)，P/E≈1.88(圖2， B)?；位ǚ坶L在 10～40 μm 之間，總體觀不飽滿、空癟，多為勺狀、三棱狀、不規(guī)則狀等，單瓣‘象牙白’畸形花粉約占觀察花粉總數(shù)的 20.50%；半重瓣‘象牙白’畸形花粉約占觀察花粉總數(shù)的 35.40%。

圖1 3個紫斑牡丹品種單瓣及半重瓣花形態(tài)特征比較

單瓣‘美人面’花粉色，花粉多數(shù)(圖1， D)。半重瓣‘美人面’花粉較多，部分雄蕊瓣化為花瓣(圖1， E-F)。單瓣‘美人面’平均極軸長為49.51 μm(44～56.39 μm)，平均赤道軸長為24.19 μm(22.04～26.51 μm)，P/E≈2.05(圖2， C)。半重瓣‘美人面’平均極軸長為52.37 μm(49.11～54.29 μm)，平均赤道軸長為25.55 μm(20.67～25.55 μm)，P/E≈2.05(圖2， D)?；位ǚ坶L在 10～40 μm之間，總體觀多為三棱狀、不規(guī)則狀等，單瓣‘美人面’畸形花粉約占觀察花粉總數(shù)的 19.50%；半重瓣‘美人面’畸形花粉約占觀察花粉總數(shù)的 35.40%。

單瓣‘紫金冠’花紅色，花粉多數(shù)(圖1， G)。半重瓣‘紫金冠’花粉較少，部分雄蕊瓣化為花瓣(圖1， H-I)。單瓣‘紫金冠’平均極軸長為49.32 μm(47.07～57.34 μm)，平均赤道軸長為24.08 μm(21.73～26.69 μm)，P/E≈2.06(圖2， E)。半重瓣‘紫金冠’平均極軸長為48.16 μm(39.63～48.00 μm)，平均赤道軸長為23.36 μm(19.31～24.83 μm)，P/E≈2.08(圖2， F)?；位ǚ坶L在 10～40 μm之間，單瓣‘紫金冠’畸形花粉約占觀察花粉總數(shù)的 18.50%；半重瓣‘紫金冠’畸形花粉約占觀察花粉總數(shù)的27.40%。

圖2 3個紫斑牡丹品種單瓣及半重瓣花花粉表觀特征比較

2.2 不同培養(yǎng)基對花粉萌發(fā)的影響

蔗糖與硼酸對牡丹花粉離體培養(yǎng)具有非常重要的作用，蔗糖能為花粉的萌發(fā)提供營養(yǎng)物質[14]，硼酸能夠促進花粉對于糖的吸收，促進花粉管壁的形成，提高萌發(fā)率[15-16]。從表 2 與表 3 可以看出，蔗糖和硼酸濃度對紫斑牡丹花粉萌發(fā)率都有顯著影響，總體趨勢相同。隨著濃度的增加，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)上升趨勢，到達最適濃度后，又開始下降。蔗糖濃度為100 g·L-1與硼酸濃度為0.15 g·L-1時，花粉萌發(fā)率整體最高， 3個品種紫斑牡丹單瓣花粉萌發(fā)率均顯著高于半重瓣花粉萌發(fā)率。紫斑牡丹花粉萌發(fā)最優(yōu)的培養(yǎng)基為蔗糖100 g·L-1+硼酸0.15 g·L-1+10 g·L-1瓊脂。在最適宜培養(yǎng)基下，3個品種花粉萌發(fā)率分別為：‘象牙白’單瓣(83.62±2.85)%, 半重瓣(72.06±2.55)%；‘美人面’單瓣(78.02±3.94)%，半重瓣(69.88±3.84)%；‘紫金冠’單瓣(61.65±2.28)%，半重瓣(55.92±1.89)%。

表2 不同蔗糖濃度對紫斑牡丹品種單瓣及半重瓣花粉萌發(fā)率的影響

表3 不同硼酸濃度對紫斑牡丹品種單瓣及半重瓣花粉萌發(fā)率的影響

2.3 紫斑牡丹的單瓣與半重瓣花粉可溶性蛋白含量比較

從圖 3可以看出，不同品種紫斑牡丹單瓣與半重瓣花粉可溶性蛋白含量顯著不同，同一品種單瓣與半重瓣花粉可溶性蛋白含量也顯著不同，單瓣花粉可溶性蛋白含量均顯著高于半重瓣花粉可溶性蛋白含量。其中，單瓣‘美人面’花粉可溶性蛋白含量最高，達到17.79 mg·g-1，為半重瓣‘美人面’的1.33倍；‘象牙白’花粉可溶性蛋白含量單瓣與半重瓣的差異最大，單瓣‘象牙白’為半重瓣‘象牙白’的1.53倍；半重瓣‘紫金冠’花粉可溶性蛋白含量最低，為9.31 mg·g-1，為單瓣‘紫金冠’的1.29倍。

圖3 紫斑牡丹品種單瓣及半重瓣花粉可溶性蛋白含量比較

2.4 紫斑牡丹的單瓣與半重瓣花粉 MDA 含量比較

從圖 4可以看出，不同品種紫斑牡丹花粉MDA含量顯著不同，同一品種單瓣與半重瓣花粉MDA含量也顯著不同，均為半重瓣花粉MDA含量高于單瓣。其中，半重瓣‘紫金冠’花粉MDA含量最高，達到6.97 μmol·g-1，約是單瓣‘紫金冠’的1.21倍；半重瓣‘象牙白’MDA含量約為單瓣‘象牙白’的1.05倍；半重瓣‘美人面’MDA含量約為單瓣‘美人面’的1.10倍。

圖4 紫斑牡丹品種單瓣及半重瓣花粉MDA含量比較

2.5 紫斑牡丹的單瓣與半重瓣花粉保護酶活性比較

2.5.1 SOD活性差異從圖 5，A可以看出，不同品種紫斑牡丹SOD活性有顯著差異，同一品種單瓣與半重瓣SOD活性顯著不同，半重瓣花粉SOD活性均顯著高于單瓣花粉；半重瓣‘美人面’花粉SOD活性達到最高，為154.933 U·g-1；單瓣‘紫金冠’花粉SOD活性達到最低，為106.588 U·g-1。半重瓣‘象牙白’花粉SOD活性為單瓣‘象牙白’的1.13倍；半重瓣‘美人面’花粉SOD活性為單瓣‘美人面’的1.25倍；3號品種單瓣與半重瓣‘紫金冠’花粉SOD活性差異最大，半重瓣‘紫金冠’花粉SOD活性為單瓣‘紫金冠’的1.45倍。

2.5.2 POD活性差異從圖 5，B可以看出不同品種紫斑牡丹POD活性有顯著差異，同一品種單瓣與重瓣POD活性顯著不同，半重瓣花粉POD活性均顯著高于單瓣花粉，單瓣‘紫金冠’花粉POD活性達到最高，為271.57 U·g-1，單瓣‘美人面’花粉POD活性達到最低，為102.50 U·g-1。半重瓣‘象牙白’花粉POD活性為單瓣‘象牙白’的1.23倍；半重瓣‘美人面’花粉POD活性為單瓣‘美人面’的1.18倍；‘紫金冠’單瓣與半重瓣POD活性差異最大，半重瓣‘紫金冠’花粉POD活性為單瓣‘紫金冠’的1.50倍。

2.5.3 CAT活性差異從圖 5，C可以看出，不同品種紫斑牡丹CAT活性有顯著差異，同一品種單瓣與半重瓣CAT活性顯著不同，半重瓣花粉CAT活性均顯著高于單瓣花粉，半重瓣‘美人面’花粉CAT活性達到最高，為40.89 mg·g-1，單瓣‘紫金冠’花粉CAT活性達到最低，為37.60 mg·g-1。半重瓣‘象牙白’花粉CAT活性為單瓣‘象牙白’的1.01倍，半重瓣‘美人面’花粉CAT活性為單瓣‘美人面’的1.03倍，半重瓣‘紫金冠’花粉CAT活性為單瓣‘紫金冠’的1.01倍。

圖5 不同紫斑牡丹品種單瓣及半重瓣花粉保護酶活性比較

3 討 論

3.1 不同培養(yǎng)基對紫斑牡丹花粉萌發(fā)率的影響

現(xiàn)有研究表明，不同種質牡丹的花粉萌發(fā)對于蔗糖和硼酸的需求差異性較大，‘鳳丹白’牡丹[17]最適培養(yǎng)基濃度為0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖；西藏‘黃牡丹’[10]、‘大花黃’[18]最適培養(yǎng)基濃度為120 g·L-1蔗糖+45 mg·L-1硼酸；日本牡丹[19]最適培養(yǎng)基濃度為蔗糖50 g·L-1+硼酸1 g·L-1，滇牡丹[20]最適培養(yǎng)基濃度為蔗糖50 g·L-1+10 mg·L-1。本實驗研究結果表明，蔗糖和硼酸對于紫斑牡丹的花粉萌發(fā)率影響極為顯著，這表明在用離體培養(yǎng)法測定花粉萌發(fā)率時，蔗糖和硼酸是影響紫斑牡丹花粉萌發(fā)的主要因素。紫斑牡丹萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為：100 g·L-1蔗糖+0.15 g·L-1硼酸+10 g·L-1瓊脂，蔗糖需求與‘鳳丹白’牡丹一樣，低于西藏‘黃牡丹’、‘大花黃’，高于日本牡丹和滇牡丹；硼酸需求高于‘鳳丹白’牡丹、西藏‘黃牡丹’、‘大花黃’和滇牡丹，低于日本牡丹。這種現(xiàn)象表明，不同的牡丹種質花粉對硼酸與蔗糖的適應性不盡相同，這些萌發(fā)特性的差異有可能是因為他們的基因型不同而造成的。

3.2 花粉萌發(fā)率與蛋白質含量的關系

很多學者在對植物雄性不育這方面的研究中發(fā)現(xiàn),蛋白質的含量與花粉育性息息相關。蛋白質是花藥發(fā)育過程中積累的營養(yǎng)物質，其作為細胞組成中重要的代謝物質和能源物質，對于花藥和小孢子的正常發(fā)育都極為重要?；ㄋ幍恼０l(fā)育以及小孢子形成過程中的細胞分裂、花粉內外壁形成等，均需蛋白質的參與[21]。花藥發(fā)育過程中蛋白質的缺失會直接影響花粉正常的新陳代謝，從而導致花粉敗育。周國昌等[22]在花藥發(fā)育過程中提出“物質虧損”，認為營養(yǎng)供應不足將會導致小孢子異常發(fā)育?！廊嗣妗目扇苄缘鞍缀孔罡?，而‘象牙白’的萌發(fā)率最高，造成這種差異的原因可能與花粉本身的大小、畸形等有關。本研究結果亦證明了這一結論，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’花粉萌發(fā)率均表現(xiàn)為單瓣花粉萌發(fā)率顯著高于半重瓣花粉萌發(fā)率，可溶性蛋白含量均表現(xiàn)為單瓣花粉高于半重瓣花粉，這與前人在大白刺[21]、玉米[22]、甜椒[23]等方面的研究結果一致。

3.3 花粉萌發(fā)率與MDA含量的關系

MDA是膜脂過氧化的一個重要指標，在花粉發(fā)育時期的大量積累會使細胞膜結構遭到破壞或損傷, 從而引起細胞內生理生化代謝的紊亂。MDA含量的高低代表細胞質膜透性的強度，與其是否受到傷害具有密切的相關性[24]。植物材料不同，MDA含量的高低不同。同一品種的紫斑牡丹，但因其半重瓣具有一定的不育性，MDA含量也具有一定的差異。田長恩等[25]認為，不育系花器中脂膜的破壞速度要快于可育花蕾，植物體內含有較高的 MDA 是造成膜脂過氧化增強，造成敗育的重要原因。而半重瓣花粉的萌發(fā)率也顯著低于單瓣花粉萌發(fā)率，造成這種現(xiàn)象的原因有花粉畸形、退化；花粉外觀畸形或結構異常；孢子囊或小孢子退化和花粉功能異常等[26-27]。半重瓣花粉MDA含量顯著高于單瓣花粉，造成這種差異的原因可能是MDA的積累導致物質代謝損虧，活性氧毒害的程度較高，使細胞膜系統(tǒng)受到破壞或損傷，造成細胞內生理代謝紊亂[28]。本研究結果也證實了這一結論，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’單瓣花粉MDA含量顯著低于半重瓣，由此推測，半重瓣紫斑牡丹萌發(fā)率低可能與花蕾中MDA的快速積累有關。

3.4 花粉萌發(fā)率與 3 種保護酶活性的關系

植物花粉在利用氧的過程中會形成活性氧, 這些活性氧會對植物本身產(chǎn)生毒害作用, 從而會發(fā)生體內相關組織的生理生化紊亂的現(xiàn)象, SOD、POD、CAT等抗氧化酶可以幫助清除植物體內積累的過剩有氧自由基, 防止活性氧過度積累而造成膜質受損。研究表明，保護酶活性一定程度上是生物體機能維持的重要指標[29-31]。保護酶活性的高低與植物花粉的正常發(fā)育具有相關性，這些保護酶與植物花粉敗育的理論研究，主要有兩種觀點:一種認為，敗育花粉中保護酶活性下降, 致使活性氧水平升高，膜脂過氧化作用增強而使細胞受損, 引起小孢子生長發(fā)育異常從而導致植物花粉敗育；另一種觀點認為，敗育花粉中保護酶活性水平高于其正?；ǚ郏J為這是花粉敗育對其體內活性氧水平升高的應答反應[32]。本研究結果與第二種觀點一致，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’單瓣花粉的SOD、POD和CAT活性均顯著低于半重瓣。保護酶活性偏高將加速生長素的分解、降低生長素活性,導致生長素濃度偏低, 對營養(yǎng)物質的競爭不利, 從而影響花粉的正常發(fā)育[33]。

在植物的代謝過程中會產(chǎn)生活性氧等有毒物質,這些物質能夠穿透生物膜而誘發(fā)膜脂質過氧化作用,從而損傷植物組織。半重瓣花藥中較高的SOD活性可能是導致花粉萌發(fā)率較低的一個重要因素。植物體內較高的POD 活性會促使生長素氧化分解，導致不能滿足花藥所需要的營養(yǎng)物質，另外造成花序中乙烯大量積累，造成細胞衰老，引起花藥敗育。CAT是一種保護性酶,能夠有效地清除生物體內的產(chǎn)生的自由基對細胞的傷害作用。本實驗研究結果表明，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’半重瓣花粉SOD、CAT、POD活性均高于單瓣花粉，這與何思等[23]在苧麻中的研究結果相一致。

4 結 論

紫斑牡丹花粉小粒、癟粒和畸形是導致其萌發(fā)率較低的主要原因?！笱腊住?、‘美人面’和‘紫金冠’花粉離體培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基配方為：100 g·L-1蔗糖+0.15 g·L-1硼酸+10 g·L-1瓊脂?！笱腊住?、‘美人面’和‘紫金冠’單瓣花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)率均顯著高于半重瓣，分別為：單瓣‘象牙白’(83.62 ±2.85)%；半重瓣‘象牙白’(72.06±2.55)%；單瓣‘美人面’(78.02±3.94)%；半重瓣‘美人面’(69.88±3.84)%；單瓣‘紫金閣’(61.65±2.28)%；半重瓣‘紫金閣’(55.92±1.89)%。

本研究對‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’單瓣與半重瓣花粉可溶性蛋白含量、MDA含量、SOD、POD和CAT活性指標進行分析，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’單瓣花粉的可溶性蛋白含量均高于半重瓣花粉，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’單瓣花粉MDA含量和3種保護酶活性均低于半重瓣花粉?；ǚ垠w內蛋白質虧損和MDA、CAT、SOD、POD的積累可能是引起半重瓣紫斑牡丹花粉萌發(fā)率低下和敗育的生理原因之一。