沈欽海張盟輝秦召敏*劉 軍

(1.山東醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校醫(yī)學(xué)系,濟(jì)南 250002;2.山東省濟(jì)南市第四人民醫(yī)院普通外科,山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院,濟(jì)南 250000;3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院,濟(jì)南 250021)

肝缺血再灌注損傷常見(jiàn)于出血性休克、肝手術(shù)、肝移植術(shù)等過(guò)程中,可引起肝損傷、肝衰竭等,也是肝手術(shù)移植失敗的重要原因[1]。 自噬是一個(gè)將自身細(xì)胞器或細(xì)胞質(zhì)中的蛋白包被形成囊泡,通過(guò)自噬溶酶體,使囊泡內(nèi)容物降解的過(guò)程,在機(jī)體生理和病理過(guò)程中常見(jiàn)[2],其發(fā)揮的作用在不同組織和細(xì)胞中各不相同。 前人研究發(fā)現(xiàn),在肝缺血再灌注損傷過(guò)程中,上調(diào)細(xì)胞自噬具有保護(hù)肝功能的作用[3]。 另外,通過(guò)提高腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路調(diào)節(jié)的自噬,可緩解缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷[4]。 槲皮素是一種天然的膳食黃酮,具有顯著的抗氧化作用,可通過(guò)降低炎癥反應(yīng),對(duì)心臟等器官起保護(hù)作用[5]。 而且槲皮素能有效改善大鼠肝缺血再灌注損傷[6],但是槲皮素預(yù)處理對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的緩解作用及對(duì)AMPK/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)自噬途徑的影響,未見(jiàn)報(bào)道。 本研究使用槲皮素及自噬抑制劑氯喹預(yù)處理肝缺血再灌注損傷的大鼠模型,旨在從AMPK/mTOR 信號(hào)通路探討槲皮素對(duì)缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠(50 只,雄性,5 周齡,體重170～180 g)購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(魯)2018-0003],于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[SYXK(魯)2019-0043],符合山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定(2020-S-09),按照3R 原則關(guān)照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 主要試劑與儀器

槲皮素(原料藥,純度≥98%)購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;自噬抑制物-氯喹(規(guī)格:50 mg,純度:97%),購(gòu)自麥克林生化科技有限公司。

蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物 科 技 有 限 公 司; 單 丹 磺 酰 尸 胺(monodansylcadaverin,MDC)購(gòu)自上?；鶢栴D生物科技有限公司; β-actin 鼠抗購(gòu)自Sigma 公司;Beclin1、磷酸化(phosphorylation,p)-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR 一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗均購(gòu)自Abcam 公司。

全自動(dòng)生化分析儀(BK-200 型)購(gòu)自山東博科;酶標(biāo)儀(Fax-20100 型)購(gòu)自美國(guó)INStat;光學(xué)顯微鏡(SMZ745 型)購(gòu)自日本尼康;ChemiDoc-MP 全能型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自山東三瑞科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肝缺血再灌注大鼠模型的建立及分組

將SPF 級(jí)SD 大鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組,模型組、槲皮素組、氯喹組和槲皮素+氯喹組。手術(shù)前3 天,槲皮素組大鼠灌胃給予槲皮素(0.5%羧甲基纖維素鈉溶解),給藥劑量0.1 g/kg[7],氯喹組大鼠腹腔注射0.02 g/kg 氯喹[8](自噬抑制劑,蒸餾水溶解),槲皮素+氯喹組灌胃給予槲皮素同時(shí)腹腔注射氯喹,對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水和0.5%羧甲基纖維素鈉溶劑,每天1 次。 參考馬志勇等[9]方法構(gòu)建肝缺血再灌注大鼠模型:大鼠術(shù)前禁食12 h,自由飲水,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,固定于手術(shù)板上,切開(kāi)腹壁,游離肝蒂,使用血管夾鉗夾肝蒂進(jìn)行肝缺血,60 min 后松開(kāi)血管夾使血液灌注6 h,其中對(duì)照組僅游離肝蒂不進(jìn)行嵌夾,所有大鼠血液再灌注6 h 后處死,收集各組大鼠血液、肝組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠肝功能指標(biāo)

分離上述1.3.1 中收集的各組大鼠部分新鮮血液中血清(剩余血清置于4℃冰箱中,用于后續(xù)檢測(cè)),置于全動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)血清中谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸?；D(zhuǎn)移酶(AST)水平。 兩者用于反映肝功能的指標(biāo),水平越高表明肝損傷越嚴(yán)重。

1.3.3 HE 染色觀(guān)察各組大鼠肝組織病理學(xué)變化

取上述1.3.1 中收集的各組大鼠部分新鮮肝組織,經(jīng)過(guò)固定(4%多聚甲醛,24 h)、包埋(石蠟)、切片(5 μm),然后脫蠟(二甲苯)、脫水(梯度乙醇)、染色(蘇木精-伊紅)等過(guò)程,具體操作步驟嚴(yán)格按照HE 染色試劑盒進(jìn)行,最后在石蠟切片中滴1 滴中性樹(shù)膠進(jìn)行封片,光學(xué)顯微鏡觀(guān)察。

1.3.4 ELISA 法檢測(cè)血清中炎性因子含量

取上述1.3.1 中置于4℃冰箱中的各組大鼠剩余血清,嚴(yán)格按照IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.5 MDC 觀(guān)察并計(jì)算各組肝組織細(xì)胞中自噬率

取上述1.3.1 中收集的各組大鼠新鮮肝組織各0.05 g 剪碎、胰蛋白酶制成單細(xì)胞懸液(剩余肝組織置于-80℃冰箱中保存),接種至6 孔板(2 mL/孔),將6 孔板離心、PBS 緩沖液洗滌、1 mL 4%多聚甲醛固定、50 μmol/L MDC 染色、37℃溫育,30 min 后,觀(guān)察并計(jì)數(shù)MDC 陽(yáng)性細(xì)胞,MDC 陽(yáng)性細(xì)胞率即為細(xì)胞自噬率。

1.3.6 Western blot 法檢測(cè)各組大鼠肝組織中Beclin1、AMPK、mTOR 蛋白表達(dá)水平

取上述1.3.5 中置于-80℃冰箱中的大鼠肝組織,提取總蛋白并對(duì)蛋白進(jìn)行定量,然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,與Beclin1、AMPK、p-AMPK、p-mTOR、mTOR、β-actin鼠抗(稀釋比均為1 ∶2000)4℃孵育過(guò)夜,與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗(1 ∶5000)室溫孵育2 h 后、顯色、凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用軟件SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示計(jì)量數(shù)據(jù),多組間比較和進(jìn)一步兩兩間比較分別行單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn),P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注大鼠肝功能指標(biāo)的影響

模型組ALT 和AST 水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);槲皮素組ALT 和AST 水平顯著低于模型組(P＜0.05),氯喹組ALT 和AST 水平顯著高于模型組(P＜0.05)。 與槲皮素組相比,槲皮素+氯喹組ALT 和AST 水平顯著升高(P＜0.05);與氯喹組相比,槲皮素+氯喹組ALT 和AST 水平顯著降低(P＜0.05)。 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較(ˉx±s,n=10)Table 1 Liver function indexes of rats in each group

2.2 槲皮素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注大鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,無(wú)顯著壞死現(xiàn)象;模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞排列疏松,出現(xiàn)壞死,槲皮素組較模型組大鼠肝組織病理?yè)p傷有所緩解,氯喹組較模型組大鼠肝組織病理?yè)p傷加重;槲皮素+氯喹組較槲皮素組大鼠肝組織病理?yè)p傷加重,較氯喹組大黃素肝組織病理?yè)p傷減輕。 見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)HE 染色圖Figure 1 Hepatic histopathological HE staining of rats in each group

2.3 槲皮素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注大鼠血清中炎性因子含量的影響

模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);與模型組相比,槲皮素組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著降低(P＜0.05),氯喹組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著升高(P＜0.05)。 與槲皮素組相比,槲皮素+氯喹組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著升高(P＜0.05);與氯喹組相比,槲皮素+氯喹組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量比較(ˉx±s,n=10)Table 2 Contents of IL-6, TNF-α and IL-1β in serum of rats in each group

2.4 槲皮素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注大鼠肝組織細(xì)胞自噬率的影響

與對(duì)照組相比,模型組大鼠肝組織細(xì)胞自噬率顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,槲皮素組大鼠肝組織細(xì)胞自噬率顯著升高(P＜0.05),氯喹組大鼠肝組織細(xì)胞自噬率顯著降低(P＜0.05)。 與槲皮素組相比,槲皮素+氯喹組大鼠肝組織細(xì)胞自噬率顯著降低(P＜0.05);與氯喹組相比,槲皮素+氯喹組大鼠肝組織細(xì)胞自噬率顯著升高(P＜0.05)。 見(jiàn)表3、圖2。

注:箭頭所示為MDC 染色陽(yáng)性細(xì)胞。

表3 各組大鼠肝組織細(xì)胞自噬率比較(ˉx±s,n=10)Table 3 Autophagy rates in liver tissue cells of rats in each group

2.5 槲皮素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注大鼠肝組織Beclin1、AMPK、mTOR 蛋白表達(dá)水平的影響

模型組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達(dá)水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。槲皮素組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達(dá)水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著高于模型組(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著低于模型組(P＜0.05);氯喹組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達(dá)水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著低于模型組(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著高于模型組。 與槲皮素組比,槲皮素+氯喹組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達(dá)水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著降低(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著升高(P＜0.05);與氯喹組比,槲皮素+氯喹組大鼠肝組織中Beclin1蛋白表達(dá)水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著升高(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。 見(jiàn)表4、圖3。

表4 各組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達(dá)及AMPK 和mTOR 蛋白磷酸化水平比較(ˉx±s,n=10)Table 4 Comparison of Beclin1 protein and AMPK,mTOR phosphorylation proteins expression levels in liver tissue of rats in each group

圖3 各組大鼠肝組織中Beclin1、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR 蛋白表達(dá)條帶圖Figure 3 Expression of Beclin1, p-AMPK, AMPK,p-mTOR and mTOR proteins in liver tissue of rats in each group

3 討論

肝缺血再灌注是肝手術(shù)或肝移植的必要組成部分,缺血過(guò)程中不可避免會(huì)造成肝細(xì)胞損傷,再灌注后肝功能也不太可能迅速恢復(fù)正常[10]。 在大多數(shù)情況下,術(shù)后會(huì)出現(xiàn)肝炎癥、損傷甚至嚴(yán)重的肝功能障礙,嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致多器官功能衰竭甚至死亡[11]。 因此,預(yù)防和減輕肝缺血再灌注損傷對(duì)改善患者預(yù)后、降低死亡率具有重要影響。 何瑩等[12]研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠肝缺血再灌注損傷伴隨自噬作用降低及自噬相關(guān)蛋白水平顯著下降。 本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠肝缺血再灌注損傷,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞排列疏松,出現(xiàn)壞死,ALT 和AST 水平、IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著升高,肝組織細(xì)胞自噬率、Beclin1 蛋白表達(dá)水平顯著降低,提示肝缺血再灌注大鼠肝組織出現(xiàn)病理?yè)p傷及炎癥反應(yīng),且細(xì)胞自噬減少。

槲皮素可以降低血壓、血脂,抗癌、抗炎和抗氧化應(yīng)激,對(duì)多種心血管疾病具有良好的治療效果,廣泛存在于雙子植物中,是一種黃酮類(lèi)化合物[13]。其中,槲皮素不但能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14],還能誘發(fā)原發(fā)積液性淋巴瘤細(xì)胞的自噬[15]。另外,Uylas 等[16]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素在正確劑量下可有效預(yù)防肝缺血再灌注損傷,He 等[17]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過(guò)mTOR 途徑增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞自噬,治療缺氧相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓疾病。 本研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可顯著緩解肝缺血再灌注大鼠肝組織病理?yè)p傷,降低肝功能指標(biāo)ALT 和AST水平以及炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β 含量,提高肝組織細(xì)胞自噬率和Beclin1 蛋白表達(dá)水平,提示槲皮素能夠激活細(xì)胞自噬,緩解肝損傷。 但其中的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

Wang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)高血糖通過(guò)抑制AMPK/mTOR 介導(dǎo)的自噬,促進(jìn)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞NLRP3 炎癥小體的激活,加重急性肝損傷。 本研究發(fā)現(xiàn),肝缺血再灌注模型大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達(dá)水平、AMPK 蛋白磷酸化水平顯著降低,mTOR 蛋白磷酸化水平顯著升高,提示AMPK/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬在模型大鼠中處于抑制狀態(tài),而經(jīng)槲皮素預(yù)處理后,AMPK/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬得到激活。 另外,腎上腺髓質(zhì)素可能通過(guò)AMPK/mTOR 軸激活自噬,從而保護(hù)間質(zhì)細(xì)胞的甾體生成功能,防止細(xì)胞焦亡[19];阻礙AMPK/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬能夠促進(jìn)小鼠非酒精性脂肪肝[20]。 為進(jìn)一步探究槲皮素是通過(guò)AMPK/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬發(fā)揮肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,本研究通過(guò)采用自噬抑制劑氯喹單獨(dú)及槲皮素和氯喹聯(lián)合預(yù)處理肝缺血再灌注大鼠,發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織病理?yè)p傷程度介于槲皮素和氯喹單獨(dú)干預(yù)之間;ALT 和AST 水平、IL-6、TNF-α、IL-1β 含量以及mTOR 蛋白磷酸化水平比槲皮素單獨(dú)干預(yù)升高,比氯喹單獨(dú)干預(yù)降低,肝組織細(xì)胞自噬率、Beclin1 蛋白表達(dá)水平及AMPK 蛋白磷酸化水平比槲皮素單獨(dú)干預(yù)降低,比氯喹單獨(dú)干預(yù)升高,提示槲皮素改善肝缺血再灌注大鼠肝損傷的作用可被氯喹逆轉(zhuǎn),進(jìn)一步說(shuō)明槲皮素減輕肝缺血再灌注大鼠肝損傷的作用機(jī)制與激活A(yù)MPK/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)。

綜上所述,槲皮素預(yù)處理可能通過(guò)激活肝缺血再灌注大鼠肝組織中AMPK/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬,緩解肝損傷。 但是自噬涉及的信號(hào)通路較多且肝缺血再灌注的作用機(jī)制較為復(fù)雜,槲皮素預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用,是否還涉及自噬相關(guān)的其他信號(hào)通路,尚需進(jìn)一步研究。