王世鋒， 銀芳柳， 高紅娟， 詹建立， 張秀英， 阿布都熱合曼·吐爾遜

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 喀什844000)

低氧是高原動(dòng)物生存的主要限制因子，高原動(dòng)物通過整體水平代償機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體的能量需求和血氧穩(wěn)定以適應(yīng)低氧環(huán)境[1]。這種低氧適應(yīng)不僅依賴于器官功能的變化，還通過調(diào)整細(xì)胞代謝和誘導(dǎo)抗低氧因子的方式，從分子水平適應(yīng)高原低氧環(huán)境[1]。

低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIFs) 是一種氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子，在缺氧調(diào)節(jié)過程中能誘導(dǎo)下游靶基因促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)的基因表達(dá)，即通過HIF-EPO信號(hào)通路(圖1)最終促進(jìn)紅細(xì)胞增殖[2]。低氧時(shí)，脯氨酸羥化酶2(Proline hydroxylase domain protein 2,PHD2 )，又名 EGLN1(Eglnine homolog 1) 基因，功能失活，導(dǎo)致HIF-2a亞基不被羥基化，失去與馮·希佩爾-林道腫瘤抑制蛋白(Von Hippel Lindau,VHL) 的結(jié)合，導(dǎo)致 HIF-2a 降解受阻而聚集增多。在腎皮質(zhì)近端小管附近的間質(zhì)細(xì)胞中，HIF-2a與另一家族成員HIF-β在EPO基因5′端與低氧反應(yīng)原件(Hypoxia response element,HRE)結(jié)合，啟動(dòng)了間質(zhì)細(xì)胞EPO基因的表達(dá)。EPO與骨髓中的紅細(xì)胞前體細(xì)胞膜上的EPO受體結(jié)合，引發(fā)二聚體化。同時(shí)，與EPO受體連接的Janus激酶使下游信號(hào)分子磷酸化，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[3]，從而促進(jìn)紅細(xì)胞的增殖。PHD、HIF-2a、VHL、EPO基因突變會(huì)引起EPO表達(dá)上調(diào)，在人類中引起紅細(xì)胞增多癥。

總之，細(xì)胞通過氧感受器及其下游信號(hào)通路特異地調(diào)節(jié)相關(guān)基因及其蛋白的表達(dá)水平來適應(yīng)低氧脅迫。

圖1 控制紅細(xì)胞生成的反饋回路(含HIF:EPO信號(hào)通路)[2]Figure 1 The feedback loop that controls red blood cell production(including HIF: EPO signaling pathway)[2]

在缺氧環(huán)境中，動(dòng)物生理適應(yīng)主要通過呼吸系統(tǒng)、血液、組織細(xì)胞水平的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。其中紅細(xì)胞數(shù)(Red blood corpuscle count,RBC)和血紅蛋白(Hemoglobin,HB)含量的增加使機(jī)體攜氧能力增強(qiáng)，但高紅細(xì)胞壓積(Hematocrit,HCT)導(dǎo)致血液黏滯性變大，增加了血流阻力，加重心臟負(fù)擔(dān)，對(duì)動(dòng)物造成不利影響[4]。王曉君等[5]研究表明高原鼢鼠和高原屬兔通過高RBC、低HCT、低平均紅細(xì)胞容積(Mean corpuscular volume,MCV)適應(yīng)低氧環(huán)境；Fu等[6]給綿羊放血后發(fā)現(xiàn)，隨著失血增加血液氧含量降低，引起腎臟、肝臟EPO基因 mRNA含量上升，HB含量下降，HCT降低。

EPO是最早被發(fā)現(xiàn)與低氧適應(yīng)有關(guān)的基因，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，全長為2 389 bp[7]。其表達(dá)產(chǎn)物EPO是一種肽類激素，為I型細(xì)胞因子超家族成員，相對(duì)分子質(zhì)量為50 400，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成、促進(jìn)血管生成、骨髓紅系祖細(xì)胞生長、抑制紅系祖細(xì)胞凋亡、參與胎盤血管發(fā)生等功能，是紅細(xì)胞生成的主要調(diào)控因子[8]。魏登邦等[9]通過測定高原鼢鼠(洞穴生活)RBC、HB、心肌肌紅蛋白含量和骨骼肌肌紅蛋白含量，發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)明顯高于世居高原的地面動(dòng)物，推斷高原鼢鼠在低氧、高CO2濃度雙重因素誘導(dǎo)下，通過HIF-EPO信號(hào)通路提高EPO表達(dá)量來適應(yīng)低氧環(huán)境。EPO與藏豬血液中紅細(xì)胞的含量有密切關(guān)系，分析藏豬EPO基因的多態(tài)性有利于闡述藏豬對(duì)高原缺氧環(huán)境的適應(yīng)性[10]。許海霞等[11]對(duì)藏羊、蒙古羊、灘羊、小尾寒羊、牦牛、黃牛EPO基因進(jìn)行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)EPO優(yōu)勢基因頻率及單倍型隨著海拔的升高而發(fā)生改變。包鵬甲等[4]對(duì)藏羊、盤羊EPO基因和血液生理指標(biāo)(RBC、HB含量、MCV)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。

塔什庫爾干羊生活于帕米爾高原3 000～5 000 m的東坡，是區(qū)別于其他脂臀羊的高山放牧品種，具有適應(yīng)力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)[12]。尚未見到有關(guān)新疆地方綿羊EPO基因與高原低氧適應(yīng)機(jī)制方面的報(bào)道。通過分析塔什庫爾干羊EPO基因遺傳多樣性，為進(jìn)一步闡明動(dòng)物高原低氧適應(yīng)機(jī)制，為高山放牧型綿羊的提純復(fù)壯提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

39只塔什庫爾干羊(來自海拔4 200 m的塔什庫爾干縣麻扎種羊場)，個(gè)體間無血緣關(guān)系，頸靜脈采集血液，ACD抗凝，混合均勻，用放有冰袋的泡沫箱帶回實(shí)驗(yàn)室，-70 ℃超低溫冰箱冷凍保存待用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

采用全血基因組DNA快速提取試劑盒(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)提取血液基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度和純度，120 V，在1%瓊脂糖凝膠(Gold view 0.05 μL/mL)中電泳20 min。

1.2.2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增與測序

根據(jù)三江黃牛EPO基因(GenBank登錄號(hào)為EF:374049)，參考許海霞等[11]的研究設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-GTCCCAGTGCCTAAGTGGAA-3′，下游引物：5′-CAAGAGCCAGGTTGTGGTT-3′。PCR擴(kuò)增首先采用25 μL反應(yīng)體系：其中2×TaqMix 12.5 μL，上下游引物各0.75 μL(100 μmol/L)，模板DNA(40～50 mg/L)2 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測無誤后，擴(kuò)大至50 μL為體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測合格的PCR產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

使用Chromas version 2.5.0 軟件根據(jù)測序峰圖對(duì)所得序列進(jìn)行校正。使用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，用MEGA 5.05軟件拼接序列、計(jì)算堿基含量、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用Dnasp 5.10軟件分析單倍型多樣度、核苷酸多樣度、多態(tài)位點(diǎn)等。

計(jì)算不同個(gè)體各位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、期望基因型頻率，并對(duì)基因型頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)是否符合哈迪-溫伯格平衡。另外計(jì)算遺傳雜合度(Heterozygosity,He)和多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPO基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

EPO基因擴(kuò)增后的結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠在120 V電壓下電泳20 min，電泳檢測結(jié)果見圖2，各電泳泳道均擴(kuò)增出目的基因條帶，且條帶清楚，大小與目的基因相符，估計(jì)大小為1 400 bp，沒有冗余的雜帶和拖尾現(xiàn)象，可進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序分析。

圖2 塔什庫爾干羊EPO基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳Figure 2 The 1% agarose gel electrophoresis of EPO gene PCR amplification of Tashkurgan sheep

2.2 塔什庫爾干羊EPO基因的全序列堿基組成分析

本文所測塔什庫爾干羊EPO基因的序列長度為1 382 bp。通過對(duì)39個(gè)個(gè)體EPO基因堿基組成分析，發(fā)現(xiàn)A、T、G、C含量分別為21.6%、21.4%、28.8%和28.3%，其中A+T含量為43%，G+C含量為57% ，G+C的含量明顯高于A+T的含量。結(jié)果符合功能基因序列的特點(diǎn)。

2.3 塔什庫爾干羊EPO基因序列多態(tài)性分析

以三江黃牛序列EF374049.1(Hap1)為對(duì)照，共發(fā)現(xiàn)60個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，占總分析位點(diǎn)的4.34%。研究共發(fā)現(xiàn)7種單倍型，單倍型多樣度Hd為0.588，單倍型多樣度的方差為 0.007，單倍型多樣度標(biāo)準(zhǔn)差為0.083，平均核苷酸差異數(shù)k為 3.268，核苷酸多樣度Pi為0.009。其中Hap2～Hap8單倍型是首次發(fā)現(xiàn)的，Hap3為優(yōu)勢單倍型(占64%)，利用MEGA 5.05軟件對(duì)許海霞等[11]的8種單倍型進(jìn)行分析并命名為Hap9至Hap16，變異位點(diǎn)及其頻率見表1。

表1 EPO基因序列的單倍型分析

2.4 EPO基因型頻率及哈迪-溫伯格法則檢驗(yàn)

對(duì)綿羊序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNP位點(diǎn)(圖5)，其中SNP911位于第2內(nèi)含子內(nèi)，SNP1763、1878、1991、2121位于3′UTR序列內(nèi)。其中SNP1991和2121與許海霞等[11]發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)一致，其他3個(gè)位點(diǎn)為本文首次發(fā)現(xiàn)。

通過Chromas version 2.5.0軟件比對(duì)測序峰圖，對(duì)5個(gè)SNP進(jìn)行基因分型，有套峰判斷為雜合子，單一峰判定為純合子，統(tǒng)計(jì)個(gè)體間的多態(tài)位點(diǎn)上的等位基因(圖3)，并判斷基因型(表2)。

表2 塔什庫爾干羊基因型頻率及哈迪-溫伯格法則檢驗(yàn)

由表2得出，各位點(diǎn)PIC值均小于0.25，表明塔什庫爾干樣EPO基因5個(gè)SNPs為低度多態(tài)(PIC<0.25)?？ǚ綑z驗(yàn)表明前3個(gè)SNP位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05) ，后兩個(gè)SNP位點(diǎn)不符合哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)(P<0.01) 。

2.5 EPO基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

為分析EPO等位基因間的遺傳關(guān)系，使用MEGA 5.05軟件，采用最大似然法(Maximum Likelihood,ML) Kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對(duì)拓?fù)鋱D進(jìn)行1 000次自展檢驗(yàn)以確定各分支的置信度，將從GenBank下載的7個(gè)序列：EF374048.1、EF374047.1、EF405921.1、XM019987344.1、XM015460412.1、XM005697818.2和XM005956237.1，分別命名為Hap17至Hap23。序列信息見表3。以EF374049.1(Hap1) 為參照，構(gòu)建不同物種單倍型的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。

表3 單倍型序列信息

由圖4得知，塔什庫爾干羊的Hap2～Hap8單獨(dú)聚為一支，說明與其他綿羊群體遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.6 EPO氨基酸多態(tài)性分析

該段核苷酸序列擴(kuò)增出1 382 bp，為EPO基因第3～5外顯子的全部編碼區(qū)。將序列進(jìn)行剪接，切除非編碼區(qū)和內(nèi)含子后得到426 bp的編碼區(qū)序列[11]。運(yùn)用MEGA 5.0.5軟件將所得單倍型的核酸序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列，以綿羊mRNA序列(NM_001024737.1)為參照，分析得到141個(gè)氨基酸，最后一個(gè)為終止密碼子。發(fā)現(xiàn)16個(gè)單倍型氨基酸序列一致，綿羊與牛有4處氨基酸不一致(圖5)。

圖中各分支數(shù)值來自1 000次自展分析的百分率。圖4 EPO基因不同單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 4 Phylogenetic tree of different haplotype of EPO gene

圖5 EPO基因的不同單倍型對(duì)應(yīng)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Figure 5 The amino acid sequence alignment results of different haplotypes of EPO gene

3 討論與結(jié)論

EPO是正常紅細(xì)胞生成的主要調(diào)節(jié)因子，其特定基因型能在低氧條件下引起藏族人群紅細(xì)胞增多癥，目前對(duì)該基因的關(guān)鍵序列位置研究還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)：塔什庫爾干羊EPO基因有5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和7種單倍型，與許海霞等[11]通過對(duì)6個(gè)綿羊品系和包鵬甲等[4]對(duì)野生盤羊、歐拉羊、藏羊的研究結(jié)果(6個(gè)變異位點(diǎn)、8個(gè)單倍型)相似。說明塔什庫爾干羊EPO基因相對(duì)保守，遺傳多樣性呈低度多態(tài)。劉金鳳等[10]對(duì)高海拔低氧環(huán)境中飼養(yǎng)的藏豬和長白豬EPO基因進(jìn)行直接測序和PCR-RFLP研究，發(fā)現(xiàn)該基因具有保守性。

不同海拔的物種EPO基因較保守，而核苷酸水平的變異頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氨基酸水平[4]，與本研究結(jié)果基本一致。與其他綿羊品種或野生羊種對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn)：該基因在進(jìn)化上較為保守，編碼區(qū)在綿羊品種間及與野生羊種間沒有引起氨基酸改變的變異，推斷突變位點(diǎn)位于非編碼區(qū)。結(jié)果表明：EPO參與高海拔低氧適應(yīng)突變發(fā)生在基因表達(dá)或調(diào)控區(qū)，而不是編碼區(qū)。

研究發(fā)現(xiàn)的7種單倍型與許海霞等[11]發(fā)現(xiàn)的8種單倍型不同，可能由于不同地方品種的差異所致，但基因序列在C1991A、G2121C變異相同。許海霞等[11]研究發(fā)現(xiàn)C1076A(即本文的C1991A)僅在藏羊群體的甘加羊和喬科羊中出現(xiàn)，與高原低氧適應(yīng)有關(guān)，原因是核苷酸多態(tài)位點(diǎn)可能與EPO在低氧中高表達(dá)有關(guān)。C1991A位點(diǎn)可以解釋塔什庫爾干羊適應(yīng)高原低氧的分子機(jī)制。另外，藏羊(甘加羊、喬科羊)、小尾寒羊、蒙古羊、塔什庫爾干羊EPO氨基酸序列相同，說明綿羊不同品種的EPO基因非常保守[11]。另外，作為3′UTR的4個(gè)突變位點(diǎn)，可能影響基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致不同物種適應(yīng)高海拔低氧生態(tài)環(huán)境能力的改變。

作為高海拔地區(qū)的塔什庫爾干羊、甘加羊、歐拉羊、蒙古羊在EPO基因1183 bp處為G，而平原地區(qū)的小尾寒羊?yàn)锳，G1186A位點(diǎn)位于EPO基因內(nèi)含子3中，可能與低氧適應(yīng)有關(guān)，其適應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

李孝儀等[13]發(fā)現(xiàn)西藏曲松綿羊通過RBC和 HB升高來提升血液攜氧能力，保證對(duì)機(jī)體的供氧，并通過減小MCV和降低纖維蛋白原濃度來降低血液黏稠度，保證血液流動(dòng)的通暢性，使西藏曲松綿羊在血液生理水平上適應(yīng)低氧生存環(huán)境。陳偉[14]研究表明在EPO基因 3′端有低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)子，低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)子與細(xì)胞核內(nèi)反式作用因子如低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和轉(zhuǎn)錄因子ATF-1、CREB-1特異結(jié)合，相互協(xié)調(diào)作用，能使EPO基因表達(dá)提高3～13倍。通過比對(duì)綿羊EPO基因，發(fā)現(xiàn)綿羊在內(nèi)含子4中即1 477 bp(對(duì)應(yīng)EF374049的2 438 bp)位置有“TGCCAAGGAAACCCCCT”1個(gè)序列片段的增添，3′UTR區(qū)2 216 bp(對(duì)應(yīng)EF374049的3 177 bp)位置上有“TTTGTCCACTT”的1個(gè)序列片段的增添，保守性很高。這可能與EPO基因 3′端低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，從而激活EPO基因高表達(dá)有關(guān)。趙生國等[15]通過對(duì)不同品系的藏豬EPO基因全序列分析，發(fā)現(xiàn)有義突變 3 個(gè)。藏豬和海拔 2 300 m的 4 個(gè)八眉豬存在“TTGGGAAGTCTCAT”的一個(gè)連續(xù)的14 bp片段缺失，氨基酸變異及其核苷酸組成的單倍型可能是藏豬適應(yīng)高寒低氧的生理及分子機(jī)制，是在長期進(jìn)化過程中對(duì)高原低氧環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。劉金鳳等[10]研究發(fā)現(xiàn)高海拔生活的藏豬相對(duì)于低海拔生活的長白豬，存在很多突變，共計(jì)16個(gè)轉(zhuǎn)換，有“AAGTCTCAT TTGGGG”15 bp片段的缺失。吳洪等[16]研究表明高原大約克夏豬腎臟組織內(nèi)EPO蛋白質(zhì)的高表達(dá)，則是大約克夏豬適應(yīng)高原低氧環(huán)境的生理調(diào)節(jié)過程。藏豬EPO基因的mRNA表達(dá)量高于低海拔地區(qū)豬種。王永等[17]研究發(fā)現(xiàn)EPO基因在高原綿羊的各組織中均具有較高的表達(dá)水平，推測EPO可能是最終對(duì)高原動(dòng)物低氧適應(yīng)性起關(guān)鍵作用的基因。柏瑪?shù)萚18]研究發(fā)現(xiàn)牦牛通過EPO基因啟動(dòng)子低甲基化從而促進(jìn)EPO高表達(dá)，以適應(yīng)低氧環(huán)境。因此綿羊也可能通過EPO高表達(dá)來適應(yīng)高原低氧環(huán)境。

經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)，EPO基因前3個(gè)SNP位點(diǎn)都處于哈迪-溫伯格平衡，可能是由于不同基因型個(gè)體在生理生態(tài)適應(yīng)方面已經(jīng)達(dá)到某種程度的協(xié)調(diào)關(guān)系，并且人工選擇的作用較弱，經(jīng)過長期進(jìn)化和自然選擇而達(dá)到遺傳平衡，與陳雪梅等[19]的牦牛EPO基因研究結(jié)果一致。后2個(gè)SNP位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡，可能是基因突變、自然或人工選擇、研究樣本數(shù)量偏少等原因造成。本文中PIC<0.25，說明5個(gè)SNP位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)，沒有發(fā)現(xiàn)中度和高度多態(tài)位點(diǎn)，說明綿羊品種相對(duì)較純。陳雪梅等[19]通過PCR-SSCP研究牦牛EPO基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)隨著海拔的升高，不同品種牦牛群體He和PIC逐漸降低，A基因頻率升高。這可能與低氧的地理環(huán)境有關(guān)，高原低氧環(huán)境可能使基因受選擇壓力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致基因純合并固定，表現(xiàn)為該品種的“保守性”，成為品種特征之一。綿羊也表現(xiàn)低He、PIC，可能是通過使某基因純合或基因頻率升高來適應(yīng)高原低氧環(huán)境。

綜上所述，低氧適應(yīng)機(jī)制較為復(fù)雜，推測EPO可能是通過調(diào)節(jié)EPO含量參與低氧適應(yīng)，而不是序列本身。因此，今后應(yīng)結(jié)合EPO基因表達(dá)水平(mRNA和蛋白質(zhì)水平)、血液生理指標(biāo)、HIF-2a和HIF-β等基因多態(tài)性和表達(dá)水平綜合分析動(dòng)物高原低氧適應(yīng)的生理學(xué)及分子機(jī)制，進(jìn)一步揭示新疆高原動(dòng)物與青藏高原動(dòng)物在分子水平上是否存在低氧適應(yīng)的趨同性進(jìn)化。