周 潔，陳 靜，劉琪琪，宗時宇，劉 洋，張 紅，穆 珺，王春柳*，李 曄，

（1.陜西中醫(yī)藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

疼痛與炎癥常常伴隨多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程［1］。疼痛會從心理、生理、精神等方面嚴重影響著患者的生活質(zhì)量，已成為全球性的公共健康問題［2-3］。目前，臨床上常用鎮(zhèn)痛藥主要分為阿片受體類鎮(zhèn)痛藥及解熱鎮(zhèn)痛藥；抗炎藥主要有甾體抗炎藥與非甾體抗炎藥。各類鎮(zhèn)痛抗炎藥雖然臨床療效好，但常會出現(xiàn)由于不合理用藥或藥物的不良反應引發(fā)各種安全性問題。因此，研發(fā)高效低毒的天然鎮(zhèn)痛抗炎藥物是研究者長期奮斗的目標［4］。而中藥目前在鎮(zhèn)痛抗炎活性研究方面已取得了較好的發(fā)展。

駱駝刺（Alhagi sparsifoliaShap，AS）為豆科駱駝刺屬植物的干燥莖枝［5-6］，也是駱駝在沙漠中能夠維持生存的糧食來源，故又被形象的稱為“駱駝草”［7］。駱駝刺被收錄于《新疆主要飼用植物志》和《中國植物志》中［8］。駱駝刺作為維吾爾醫(yī)與藏醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)用民族藥材，資源豐富，分布廣泛，民間應用歷史悠久，臨床上主要作為治療牙痛、頭痛、腹痛腹脹等疾病的常用藥［9］。其單方可用于治療各種疼痛疾病，如頭痛、牙痛、寒濕性關節(jié)炎等；復方主要在臨床用于慢性風濕性關節(jié)炎、咽喉疼痛、腹痛腹瀉等癥的治療。但駱駝刺作為鎮(zhèn)痛抗炎藥用時有效部位不明確，藥效作用機制不清楚，且未見有相關制劑研究。本實驗將以駱駝刺氯仿提取物（AS chloroform extract，ASE）為研究對象，通過小鼠熱板試驗、醋酸扭體試驗、福爾馬林致痛和二甲苯致耳腫脹試驗進行ASE 鎮(zhèn)痛抗炎活性評價，以期為駱駝刺開發(fā)成為鎮(zhèn)痛抗炎藥物奠定一定的科學基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥

ASE（實驗室自制）；熱板測痛儀（ZH-LB100，安徽正華生物儀器設備有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司）；醋酸（20190307，國藥集團化學試劑有限公司）；羅通定（20190806，泌陽盤古藥業(yè)有限責任公司）；吲哚美辛（20190322，上海信誼九福藥業(yè)有限公司）；阿司匹林（20190321，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限公司）。

1.2 動物

SPF 昆明小鼠，體重18～22 g；SD 大鼠，體重180～200 g，均購自西安交通大學實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK（陜）2012-003。

2 方法

2.1 ASE的制備

稱取駱駝刺干燥粗粉2.5 kg 置于圓底燒瓶中，加8 倍70%（v/v）乙醇回流提取2 次，2 h/次，過濾，合并兩次濾液，于40℃減壓濃縮回收乙醇后收集濃縮液；將濃縮液依次用石油醚、氯仿按照1：1（v/v）萃取3 次，合并氯仿層萃取液，于40℃減壓濃縮，揮干溶劑，干燥后稱重得ASE。

2.2 熱板試驗

雌性昆明小鼠適應性喂養(yǎng)3 d，分組前對小鼠進行預篩選。將熱板溫度設定為55±0.1℃，記錄小鼠足部自接觸熱板至出現(xiàn)舔后足、跳躍等行為的潛伏時間，作為痛閾指標。小鼠的正常痛閾一般在5～30 s，篩選合格小鼠，每只小鼠間隔20 min 測定一次，計算3 次測定結果的平均值記為正常痛閾。取合格小鼠30 只，隨機分為5 組，6 只/組，分別為生理鹽水組（20 mL·kg-1）、羅通定陽性藥對照組（0.02 g·kg-1）、ASE 高、中、低劑量組（1.00、0.50、0.25 g·kg-1）。連續(xù)灌胃給藥7 d，并于末次給藥后30、60、90 和120 min分別測定小鼠的痛閾值［10-11］。

2.3 醋酸扭體試驗

昆明小鼠雌雄各半，并隨機分為5 組，10 只/組，分別為羧甲基纖維素鈉對照組（1% CMC-Na，10 mL·kg-1）、吲哚美辛陽性藥對照組（0.01 g·kg-1）、ASE高、中、低劑量組（1.00、0.50、0.25 g·kg-1），按照各組給藥劑量，小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，最后一次給藥后1 h，腹腔注射0.2 mL 0.6%的醋酸，以小鼠腹部內(nèi)凹和伸后足的扭體反應為評價指標，觀察并記錄15 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù)作為痛閾指標，并計算抑制率（%）［12］。

2.4 福爾馬林試驗

昆明小鼠50 只，隨機分為5 組，10 只/組，分別為羧甲基纖維素鈉對照組（1% CMC-Na，10 mL·kg-1）、吲哚美辛陽性藥對照組（0.01 g·kg-1）、ASE高、中、低劑量組（1.00、0.5、0.25 g·kg-1），除吲哚美辛陽性藥對照組外，其余組均按照上述劑量連續(xù)灌胃給藥5 d。陽性藥對照組于第3 天開始按照20 mL·kg-1給藥0.65 mg·kg-1吲哚美辛混懸液1 次。末次給藥后1 h，按照20 mL·kg-1于小鼠右后足足底皮下注射2%福爾馬林溶液，觀察并記錄給藥后神經(jīng)疼痛期（第Ⅰ時相，0～10 min）與炎癥疼痛期（第Ⅱ時相，15～30 min）兩時相小鼠舔舐皮下注射足的累積時間，作為不同時相疼痛強度的評價指標［13-14］。

2.5 二甲苯致耳腫脹試驗

昆明小鼠雌雄各半，隨機分為5 組，每組10 只，分別為羧甲基纖維素鈉對照組（1% CMC-Na，10 mL·kg-1）、阿司匹林陽性藥對照組（0.01 g·kg-1）、ASE高、中、低劑量組（1.00、0.50、0.25 g·kg-1），按照上述劑量小鼠連續(xù)灌胃給藥5 d，末次給藥1 h后，每只小鼠一只耳朵的正反兩面各均勻涂抹二甲苯20 μL 致炎，30 min后處死小鼠，剪下雙耳，重疊后用6 mm 打孔器打出圓形耳片并稱重，計算腫脹度［15-16］。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對結果進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差（±s）表示，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 ASE對熱板致痛模型的影響

由圖1 可得，給藥30 min 時，陽性藥組與ASE高、中、低劑量組對熱刺激致痛均未顯示出鎮(zhèn)痛作用；在給藥后的60～120 min 中，ASE 中、高劑量組的痛閾值明顯延長，與基礎痛閾值相比，均顯示出統(tǒng)計學差異（P＜0.05），表明ASE 中、高劑量對熱刺激引發(fā)的疼痛抑制作用顯著，顯示ASE 具有一定的中樞鎮(zhèn)痛作用。

圖1 不同時間點小鼠熱板試驗痛閾值（-x±s，n=6）Fig.1 Pain thresholds of mice in hot plate experiment at different time points

3.2 ASE對醋酸刺激痛模型的影響

由表1、圖2 可知，CMC-Na 組給藥后的扭體次數(shù)為（46.2±15.5）次，ASE的低、中和高劑量組的扭體次數(shù)分別為（28.0±8.9）次、（31.3±8.8）次與（24.5±5.3）次。由統(tǒng)計分析結果可得，與模型組相比，ASE低、中、高劑量組對減少由醋酸所致疼痛模型小鼠扭體反應次數(shù)均有顯著性差異（P＜0.05），其抑制率分別為39.76%、32.72%和47.23%，陽性藥的抑制率可達67.88%（P＜0.001）。

表1 不同給藥組對醋酸刺激痛的影響（-x±s，n=10）Table1 Effects of different administration groups on pain stimulated by acetic acid（-x±s，n=10）

圖2 不同給藥組對醋酸致扭體次數(shù)的影響（-x±s，n=10）Fig.2 Influence of different administration groups on the number of acetic acid torsion（-x±s，n=10）

3.3 ASE對福爾馬林致痛模型的影響

由表2、圖3 可知，CMC-Na 組第Ⅰ、Ⅱ時相小鼠 的 舔 足 持 續(xù) 時 間 分 別 為（76.45±8.22）s 和（84.18±8.09）s，ASE 的中、高劑量組均可縮短福爾馬林致疼痛反應的第Ⅰ、Ⅱ時相小鼠累積舔足時長（P＜0.05），中劑量組兩時相舔足持續(xù)時間分別為（41.81±2.45）s 和（56.82±5.50）s，其抑制率分別為45.31%和32.50%；高劑量組兩時相舔足持續(xù)時間分別為（49.82±5.48）s 和（50.33±7.85）s，其抑制率分別為34.83%和40.21%。陽性藥吲哚美辛僅在第Ⅱ時相對福爾馬林致痛模型顯示抑制作用（P＜0.05），表明吲哚美辛僅對炎性致痛期有抑制作用。

表2 不同給藥組對福爾馬林致疼痛反應的影響（-x±s，n=10）Table2 Influence of different administration groups on pain response induced by formalin（-x±s，n=10）

圖3 不同給藥組對福爾馬林致疼痛反應的影響（-x±s，n=10）Fig.3 Effects of different administration groups on formalin-induced pain response（-x±s，n=10）

3.4 ASE對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

由圖4可知，正常小鼠耳廓經(jīng)二甲苯刺激后，明顯腫脹，表明已造模成功。與模型組相比，ASE 中、高劑量組均可使耳腫脹度顯著減?。≒＜0.001），表明其抗炎作用呈一定的劑量依賴性。

圖4 不同給藥組對二甲苯致耳腫脹的影響（-x±s，n=10）Fig.4 Influence of different administration groups on ear swelling induced by xylene（-x±s，n=10）

4 討論

疼痛是一種由現(xiàn)存的或潛在的組織損傷所引發(fā)的機體心理和生理不舒適的感覺［17］，常常會給患者身體和精神上帶來巨大影響［18］。疼痛會導致患者生活質(zhì)量低下及機體生理功能紊亂，也是對機體所處外界環(huán)境或機體不良狀態(tài)時的自我保護反應。炎癥是一種常見的組織器官的病理過程，是機體自身與致炎因子兩者之間斗爭的結果，炎癥發(fā)生的同時也常常會伴隨著發(fā)熱、腫痛和疼痛等反應［19-20］。

駱駝刺作為維吾爾醫(yī)與藏醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)用民族藥材，臨床上主要用于治療各種疼痛性疾病。據(jù)報道，駱駝刺中的主要成分為黃酮類化合物，其中包括異鼠李素、山奈素、芒柄花素、槲皮素等，是駱駝刺中主要發(fā)揮藥效的物質(zhì)。

課題組前期研究表明駱駝刺氯仿提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛活性最好，并利用UPLC-Q-TOF-MSE技術對ASE 進行了化合物成分，共解析出異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素等10 個化合物，發(fā)現(xiàn)ASE 中的主要成分為黃酮類化合物［21］。現(xiàn)代藥理研究表明，槲皮素可促進促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的產(chǎn)生，顯著提高TLR（Toll like receptor，TLR）信號負調(diào)節(jié)因子Toll 相互作用蛋白的表達，達到抗炎鎮(zhèn)痛的療效［22］?？寡讬C制通路中，一氧化氮在炎癥級聯(lián)反應中起到關鍵的調(diào)節(jié)作用，黃酮類化合物可通過影響環(huán)磷酸鳥苷水平，抑制轉錄因子NF-κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活化，影響多種炎癥因子的表達，達到抑制誘導型一氧化氮合酶和一氧化氮產(chǎn)生的作用［23］。因此我們推測可能黃酮類化合物與鎮(zhèn)痛抗炎作用有關。

因此，本試驗通過建立了4 種經(jīng)典疼痛及炎癥動物模型來評價ASE 的鎮(zhèn)痛抗炎作用。結果表明，駱駝刺氯仿部位提取物可以有效緩解二甲苯誘導的小鼠耳腫脹，具有顯著抗炎作用；可以減輕醋酸誘導的小鼠扭體反應和福爾馬林誘導駱駝刺氯仿部位提取物的鎮(zhèn)痛效果。該結果充分證明了ASE具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎活性，為駱駝刺氯仿提取物開發(fā)為潛在的抗炎鎮(zhèn)痛藥物提供了理論基礎。