王怡，陳袁偉

[1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院（南京市口腔醫(yī)院），江蘇南京210008；2.同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，上海200072]

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤之一，是全球第六大最常見(jiàn)的癌癥[1-2]，發(fā)病率高，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且易復(fù)發(fā)[3-4]。雖然目前OSCC的臨床診斷和治療方法有所進(jìn)步，但是患者的5年生存率并沒(méi)有明顯的改善[5]。在過(guò)去的幾年中，越來(lái)越多的研究證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）參與了癌癥的進(jìn)展，有一部分研究還建議將其作為癌癥標(biāo)志物[6]。lncRNAs是一類(lèi)>200個(gè)堿基且不具有蛋白編碼能力的RNA分子[7]，在細(xì)胞中具有多種功能，可以充當(dāng)分子信號(hào)通過(guò)表觀遺傳，轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[8-9]。越來(lái)越多的證據(jù)表明lncRNAs在癌癥細(xì)胞增殖、分化、凋亡和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[10]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA 尿路上皮癌相關(guān)基因1（lncRNA UCA1）在膀胱癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌中異常表達(dá)，在多種腫瘤中發(fā)揮致癌作用，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膀胱癌、胃癌和前列腺癌等[11-14]。最近的研究也表明lncRNA UCA1參與了OSCC 的進(jìn)展[15]，然而其在OSCC 中的相關(guān)分子機(jī)制研究還很少。本研究旨在探討lncRNA UCA1靶向miR-206 調(diào)控YAP1基因?qū)SCC 細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響，初步闡明其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

HOK、TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3和SCC9 細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，Lipofectamine 3000 和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）相關(guān)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，YAP1 一抗、二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，RNA 引物由北京擎科生物科技有限公司合成，UCA1、miR-206、YAP1、miR-206 mimics、miR-206 inhibitor 均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，流式細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HOK、TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3 和SCC9細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、青霉素（100 u/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM 培養(yǎng)基中，在5%二氧化碳、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.3 采用Lipofectamine 3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將2×105個(gè)/mL密度的HN13細(xì)胞接種于6孔板中并生長(zhǎng)濃度至60%，換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。取濃度為100 nmol/L的siUCA1（陰性對(duì)照為siNC）或50 nmol/L miR-206 mimics（陰性對(duì)照為mimics NC）或50 nmol/L miR-206 inhibitor（陰性對(duì)照為inhibitor NC）分別加入200 μL 無(wú)血清培基稀釋，充分混勻，制成RNA 稀釋液。在2 μL 的Lipofectamine 3000 中加入198 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋液體，充分混勻，制成Lipofectamine 3000 稀釋液，室溫靜置5 min。將2 種稀釋液充分混合，室溫靜置15 min，制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將100 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到含有1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞上，前后移動(dòng)培養(yǎng)皿，混合均勻。在5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h，換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？刂平M不做任何處理，對(duì)照組使用隨機(jī)siRNA序列轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組使用siUCA1轉(zhuǎn)染。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)

采用TRIzol一步法提取細(xì)胞RNA，40 μL無(wú)核酸酶水溶解，置入-80℃冷凍保存。取0.5 μg 總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再行PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因。預(yù)先設(shè)計(jì)合成引物，將所得cDNA 加至PCR 反應(yīng)體系中擴(kuò)增目標(biāo)片段。在待測(cè)樣品中加入1 μL 模板、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、5 μL SYBR 探針和3 μL DEPC水避光混勻后，上機(jī)檢測(cè)相關(guān)分子的表達(dá)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH和U6作為內(nèi)參，根據(jù)2-??Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

以2×103個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于96 孔板中，設(shè)置24 h、48 h、72 h 和96 h 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞貼壁。待每組細(xì)胞處理并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。最后在酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)定吸光度（OD）值，重復(fù)3次，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)階段，轉(zhuǎn)染48 h 后胰酶消化，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）洗滌，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞1次，1 000 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞；加入300 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞；再加入5 μL Annexin V-FITC混勻，避光，室溫孵育15 min；加入5 μL PI 染色5 min，補(bǔ)加200 μL Binding Buffer。用FlowJo 10分析細(xì)胞凋亡比率。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)合位點(diǎn)

使用starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測(cè)miR-206 與UCA1、YAP1的靶向結(jié)合位點(diǎn)。將含UCA1 序列連接至雙熒光素酶載體pGL3，得到pGL3-UCA1-WT 載體。同時(shí)，通過(guò)定點(diǎn)突變將結(jié)合位點(diǎn)突變（MUT），構(gòu)建突變質(zhì)粒pGL3-UCA1-MUT。同理，構(gòu)建pGL3-YAP1-WT 和pGL3-YAP1-MUT 質(zhì)粒載體。將HN13 細(xì)胞接種于96 孔板中24 h，當(dāng)細(xì)胞融合到50%～70%時(shí)，分別將UCA1-WT 或UCA1-MUT 質(zhì)粒（YAP1-WT 或YAP1-MUT）與mimics NC 或miR-206 mimics 同時(shí)轉(zhuǎn)染HN13 細(xì)胞。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定48 h 熒光素酶相對(duì)活性。分別驗(yàn)證UCA1、YAP1的結(jié)合位點(diǎn)。

1.8 Western blotting檢測(cè)

將各組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并轉(zhuǎn)染24 h，胰酶消化并收集細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌，用RIPA 裂解液分離提取細(xì)胞樣本中的全蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，浸入含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）中，室溫下?lián)u床封閉2 h。加入YAP1一抗（1∶1 000），4℃共同孵育8 h。PBS洗滌3次，加入相應(yīng)二抗（1∶5 000），震蕩孵育2 h。洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色、膠片曝光。使用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，通過(guò)Image J軟件計(jì)算YAP1蛋白灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞lncRNA UCA1、miR-206 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

qRT-PCR 結(jié)果顯示，HOK 細(xì)胞lncRNA UCA1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（1.10±0.12）、TSCCA 細(xì)胞為（1.98±0.23）、SCCl5 細(xì)胞為（1.85±0.19）、HN13 細(xì)胞為（3.02±0.18）、CAL27 細(xì)胞為（2.32±0.15）、HSC3 細(xì)胞為（1.97±0.18）、SCC9 細(xì)胞為（2.59±0.15），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.580，P=0.000），TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3 和SCC9細(xì)胞均較HOK細(xì)胞升高（P<0.05）。

HOK 細(xì)胞miR-206 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（1.06±0.10）、TSCCA 細(xì)胞為（0.31±0.09）、SCCl5 細(xì)胞為（0.42±0.07）、HN13 細(xì)胞為（0.26±0.05）、CAL27 細(xì)胞為（0.38±0.08）、HSC3 細(xì)胞為（0.41±0.04）、SCC9 細(xì)胞為（0.40±0.13），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.070，P=0.000），TSCCA、SCCl5、HN13、CAL27、HSC3 和SCC9 細(xì)胞均較HOK 細(xì)胞降低（P<0.05）。其中HN13細(xì)胞miR-206 mRNA表達(dá)差異更顯著，故選擇該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 lncRNA UCA1促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡

qRT-PCR 結(jié)果顯示，對(duì)照組lncRNA UCA1相對(duì)表達(dá)量為（1.05±0.08）、控制組為（1.05±0.10）、實(shí)驗(yàn)組為（0.21±0.07），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=99.991，P=0.000）。對(duì)照組與控制組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

各組24 h、48 h、72 h 和96 h 的OD 值比較，經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的OD值有差異（F=191.904，P=0.000）；②各組OD值有差異（F=27.801，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組；③各組的OD 值變化趨勢(shì)有差異（F=9.042，P=0.000）。表明敲除lncRNA UCA1使細(xì)胞活力明顯降低。見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較（n=3，±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較（n=3，±s）

組別控制組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組24 h 0.19±0.05 0.21±0.03 0.21±0.05 48 h 0.32±0.04 0.31±0.03 0.25±0.03 72 h 0.50±0.04 0.51±0.03 0.35±0.03 96 h 0.88±0.10 0.99±0.13 0.56±0.06

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，控制組凋亡率為（4.14±0.94）%、對(duì)照組為（4.04±1.46）%、實(shí)驗(yàn)組為（14.96±1.59）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=64.221，P=0.000）。對(duì)照組與控制組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組凋亡率較對(duì)照組升高（P<0.05），敲除lncRNA UCA1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1。

圖1 3組NH13細(xì)胞凋亡率比較

2.3 lncRNA UCA1能夠靶向miR-206

通過(guò)starBase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA UCA1 與miR-206 存在結(jié)合位點(diǎn)，并構(gòu)建了突變序列（見(jiàn)圖2）。UCA1-WT 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics 熒光素相對(duì)活性為（0.48±0.08）、UCA1-MUT miR-206 mimics NC 為（1.04±0.09），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.849，P=0.001），UCA1-MUT 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics熒光素相對(duì)活性為（1.02±0.11），UCA1-MUT 轉(zhuǎn)染mimics NC 為（1.01±0.19），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.395，P=0.713），UCA1-WT 熒光素酶相對(duì)活性被顯著抑制（P<0.05），而UCA1-MUT 熒光素酶相對(duì)活性無(wú)顯著變化（P>0.05），證實(shí)兩者間的靶向結(jié)合關(guān)系。

圖2 lncRNA UCA1與miR-206的結(jié)合位點(diǎn)

將對(duì)照組均分為對(duì)照組1 和對(duì)照組2，并分別轉(zhuǎn)染siNC 和過(guò)表達(dá)空載體；將實(shí)驗(yàn)組均分為實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)組2 分別轉(zhuǎn)染siUCA1 和UCA1 過(guò)表達(dá)載體。qRT-PCR 結(jié)果顯示，對(duì)照組1 miR-206 相對(duì)表達(dá)量為（1.02±0.07）、實(shí)驗(yàn)組1 為（2.34±0.23）、對(duì)照組2 為（1.06±0.09）、實(shí)驗(yàn)組2 為（0.22±0.08），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=131.527，P =0.000），實(shí)驗(yàn)組1 較對(duì)照組1 升高（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組2較對(duì)照組2降低（P<0.05）。

2.4 YAP1是miR-206的靶基因

通過(guò)starBase 預(yù)測(cè)miR-206 與YAP1 存在結(jié)合位點(diǎn)，并構(gòu)建了突變序列（見(jiàn)圖3）。YAP1-WT 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics 熒光素相對(duì)活性為（0.42±0.07）、YAP1-MUT miR-206 mimics NC 為（1.03±0.10），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.398，P=0.001），YAP1-MUT 轉(zhuǎn)染miR-206 mimics 熒光素相對(duì)活性為（1.03±0.10），YAP1-MUT 轉(zhuǎn)染mimics NC 為（1.04±0.15），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.365，P=0.733），YAP1-WT mimics熒光素酶活性被抑制（P<0.05），而YAP1-MUT mimics 熒光素酶活性無(wú)顯著變化（P>0.05），證實(shí)兩者的靶向結(jié)合關(guān)系。

圖3 miR-206與YAP1的結(jié)合位點(diǎn)

控制組不做任何處理，對(duì)照組1和對(duì)照組2分別轉(zhuǎn)染mimics NC 和inhibitor NC，實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)組2分別轉(zhuǎn)染miR-206 mimics 和inhibitor。qRT-PCR 結(jié)果顯示，對(duì)照組1 的miR-206 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（1.01±0.18）、對(duì)照組2 為（1.04±0.21）、實(shí)驗(yàn)組1 為（2.56±0.19）、實(shí)驗(yàn)組2 為（0.22±0.08）、控制組為（1.05±0.10），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=84.583，P=0.000）。對(duì)照組1、對(duì)照組2與控制組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組1 miR-206 mRNA 相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組1 顯著升高（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組2 較對(duì)照組2 顯著降低（P<0.05），提示miR-206 mimics 和inhibitor 細(xì)胞轉(zhuǎn)染有效。另外，對(duì)照組1 的YAP1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（1.08±0.18）、對(duì)照組2 為（0.99±0.12）、實(shí)驗(yàn)組1 為（0.47±0.06）、實(shí)驗(yàn)組2 為（1.68±0.19）、控制組為（1.00±0.16），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.662，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組1 較對(duì)照組1 降低（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組2 較對(duì)照組2 升高（P<0.05）。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組1 的YAP1 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.58±0.08）、對(duì)照組2 為（0.59±0.05）、實(shí)驗(yàn)組1 為（0.31±0.04）、實(shí)驗(yàn)組2 為（0.84±0.06）、控制組為（0.59±0.09），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.324，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組1 較對(duì)照組1降低（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組2較對(duì)照組2升高（P<0.05）（見(jiàn)圖4）。

圖4 各組YAP1蛋白的表達(dá)

2.5 lncRNA UCA1 通過(guò)miR-206/YAP1 促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖并抑制凋亡

為進(jìn)一步驗(yàn)證該信號(hào)機(jī)制，筆者在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siUCA1 的同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor，對(duì)照組不做處理，實(shí)驗(yàn)組1 轉(zhuǎn)染siUCA1，實(shí)驗(yàn)組2 轉(zhuǎn)染siNC 和miR-206 inhibitor 的陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組3 轉(zhuǎn)染siUCA1和miR-206 inhibitor。對(duì)照組miR-206mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（1.05±0.11）、實(shí)驗(yàn)組1為（2.45±0.15）、實(shí)驗(yàn)組2 為（2.37±0.25）、實(shí)驗(yàn)組3 為（1.16±0.12），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=62.351，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組1較對(duì)照組升高（P<0.05），促進(jìn)了miR-206 的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組3 較實(shí)驗(yàn)組2 降低，抑制了miR-206 的表達(dá)（P<0.05）。對(duì)照組YAP1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為（1.09±0.16）、實(shí)驗(yàn)組1 為（0.45±0.07）、實(shí)驗(yàn)組2 為（0.43±0.08）、實(shí)驗(yàn)組3 為（0.96±0.13），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.863，P =0.000），實(shí)驗(yàn)組1 較對(duì)照組降低（P<0.05），抑制YAP1 mRNA 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組3較實(shí)驗(yàn)組2 升高（P<0.05），恢復(fù)YAP1 的表達(dá)。Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組YAP1蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.67±0.08）、實(shí)驗(yàn)組1為（0.42±0.06）、實(shí)驗(yàn)組2 為（0.43±0.10）、實(shí)驗(yàn)組3 為（0.74±0.10），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.503，P=0.003），實(shí)驗(yàn)組1 YAP1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低（P<0.05），抑制YAP1 蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組3 較實(shí)驗(yàn)組2 升高，恢復(fù)了YAP1蛋白的表達(dá)（P<0.05）（見(jiàn)圖5）。

圖5 各組YAP1蛋白表達(dá)

各組24 h、48 h、72 h、96 h 的OD 值比較，經(jīng)重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的OD值有差異（F=232.034，P=0.000）；②各組的OD 值有差異（F=24.691，P=0.000）；③各組的OD值變化趨勢(shì)有差異（F=8.123，P=0.000）（見(jiàn)表3）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（4.14±1.04）%、實(shí)驗(yàn)組1 為（14.14±1.49）%、實(shí)驗(yàn)組2為（14.54±1.81）%、實(shí)驗(yàn)組3為（6.06±1.67）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.312，P=0.000）。實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組升高（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組3 較實(shí)驗(yàn)組2 降低（P<0.05）（見(jiàn)圖6）。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較（n=3，±s）

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較（n=3，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與實(shí)驗(yàn)組2比較，P<0.05。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3 96 h 0.93±0.06 0.58±0.06①0.56±0.10 0.86±0.08②24 h 0.19±0.05 0.21±0.04 0.21±0.04 0.22±0.03 48 h 0.32±0.03 0.27±0.04 0.25±0.03 0.30±0.03 72 h 0.52±0.06 0.36±0.05①0.35±0.07 0.51±0.05②

圖6 各組NH13細(xì)胞流式細(xì)胞圖

3 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)了lncRNAs 通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移侵襲等生物學(xué)進(jìn)程參與癌癥的進(jìn)展[10]。目前發(fā)現(xiàn)多種lncRNA 在OSCC 中表達(dá)有差異， lncRNA HOXA11-AS、lncRNA AC007271.3 和lncRNA CASC9 等在OSCC 中高表達(dá)從而促進(jìn)OSCC 細(xì)胞增殖，抑制凋亡，加速OSCC 的進(jìn)展[16-18]?，F(xiàn)今lncRNA UCA1已經(jīng)被報(bào)道在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膀胱癌、胃癌和前列腺癌等癌癥中發(fā)揮致癌作用[11-14]。而少有的幾篇關(guān)于lncRNA UCA1在OSCC 中的研究證實(shí)了其在OSCC中表達(dá)升高，并能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和增強(qiáng)耐藥性[15，19-20]。本研究結(jié)果與其一致，證實(shí)lncRNA UCA1在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于人正?？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞，通過(guò)抑制lncRNA UCA1表達(dá)能夠顯著阻礙細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。并且通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)lncRNA UCA1通過(guò)miR-206/YAP1 促進(jìn)OSCC 進(jìn)展的分子機(jī)制，這是不同于先前報(bào)道的新發(fā)現(xiàn)。

miRNAs也是一種非編碼RNA且高度保守，長(zhǎng)度只有20～25 個(gè)核苷酸，能通過(guò)與靶基因mRNA 結(jié)合調(diào)控蛋白表達(dá)，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[21]。已有文獻(xiàn)證實(shí)miRNAs能夠參與各種疾病的進(jìn)展，尤其是癌癥[22]。其中，miR-206 在癌癥中作為一種抑癌因子，通常抑制癌癥進(jìn)展，這已在非小細(xì)胞肺癌[23]、前列腺癌[24]、甲狀腺癌[25]和宮頸癌[26]等研究中得到證實(shí)。目前關(guān)于miR-206 在OSCC 中的功能尚不清楚，而本研究證實(shí)miR-206 在OSCC 細(xì)胞中表達(dá)水平顯著降低，其作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，這與miR-206在其他癌癥中的研究結(jié)果相一致。并且本研究結(jié)果證實(shí)miR-206能夠與lncRNA UCA1互補(bǔ)結(jié)合，其表達(dá)被lncRNA UCA1調(diào)控，并進(jìn)一步影響下游基因表達(dá)。而通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-206 inhibitor 抑制miR-206 的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)siUCA1 的功能，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。此外，本研究結(jié)果證實(shí)了miR-206 是通過(guò)調(diào)控YAP1蛋白的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。

YAP1表達(dá)水平升高往往促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，相關(guān)研究表明YAP1能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成[27]，在乳腺癌[28]、甲狀腺癌[29]和胰腺導(dǎo)管癌[30]中都具有促癌作用。有研究表明，YAP1 同樣也在OSCC 中發(fā)揮了促癌作用，對(duì)其抑制能夠顯著抑制癌癥進(jìn)展[31-33]，本研究結(jié)果與以上結(jié)果一致，YAP1 能夠促進(jìn)OSCC 細(xì)胞增殖，抑制凋亡。本研究還證實(shí)YAP1是miR-206 的1 個(gè)靶基因，其表達(dá)受到miR-206的調(diào)控，而lncRNA UCA1能夠通過(guò)miR-206間接調(diào)控YAP1 的表達(dá)，從而影響OSCC 細(xì)胞的增殖、凋亡，參與OSCC 的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示了敲除lncRNA UCA1后，YAP1 蛋白表達(dá)水平顯著下降，同時(shí)細(xì)胞活力顯著降低，凋亡細(xì)胞顯著增多。本研究通過(guò)敲除lncRNA UCA1在OSCC中的表達(dá)，證實(shí)了其促癌作用，并生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果和雙熒光素酶驗(yàn)證了miR-206和lncRNA UCA1、YAP1 間的靶向結(jié)合關(guān)系，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了三者在OSCC中的相互作用及對(duì)OSCC進(jìn)展的影響。

綜上所述，本研究闡明了lncRNA UCA1在OCSS中通過(guò)靶向miR-206調(diào)控YAP1的表達(dá)，介導(dǎo)OSCC細(xì)胞增殖和凋亡，這一分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為OSCC的診斷和治療提供了新思路。然而，鑒于lncRNAs的多功能靶向作用，lncRNA UCA1在OSCC 中更詳細(xì)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，對(duì)其在臨床診斷治療中的應(yīng)用還需更多的研究和論證。