蒙真鋮， 陳林楊， 陳鴻潔， 只佳增， 錢 云， 李國(guó)棟

(1.云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 云南 河口 661300； 2.云南中醫(yī)藥大學(xué)， 昆明 650500)

波葉青牛膽(TinosporacrispaL.)為防己科青牛膽屬藤本植物，又稱苦藤、千里找根、綠包藤，主要分布在亞洲、非洲地區(qū)的雨林及混合落葉林，主要包括印度、馬來西亞、泰國(guó)等[1]，我國(guó)云南亦有分布[2]。波葉青牛膽藤莖富含生物堿類、二萜類、三萜類化合物等[3-5]，具有抗菌、降血壓、抗瘧疾以及強(qiáng)心等藥理作用[6-7]；亦可作為城市景觀及園林綠化的優(yōu)良藤本植物，是一種具有良好開發(fā)前景的藥材及園林綠化植物；相關(guān)學(xué)者對(duì)波葉青牛膽的研究主要在其化學(xué)成分、藥用藥理及臨床應(yīng)用上[8]，而對(duì)其在扦插繁殖方面的研究鮮有報(bào)道，由于橡膠、香蕉等熱帶作物的大面積栽種和推廣，云南山地雨林次生植被破壞嚴(yán)重，加上對(duì)野生波葉青牛膽資源的肆意挖掘，波葉青牛膽的生境逐步喪失。本實(shí)驗(yàn)以波葉青牛膽為研究材料，對(duì)其進(jìn)行扦插繁殖試驗(yàn)研究，旨在為波葉青牛膽的種質(zhì)資源保存和種苗擴(kuò)繁提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南藥種質(zhì)資源圃的波葉青牛膽植株為研究材料。選取植株健壯，無病蟲害的木質(zhì)化枝條為插穗(長(zhǎng)12～15 cm)，保證每條插穗上有3～5個(gè)芽；插穗基部用刀片切成斜口，備用。

1.2 插床與實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置

試驗(yàn)于 2019年8月—11月在云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育苗棚內(nèi)進(jìn)行。插床為地床，鋪設(shè)厚25 cm的扦插基質(zhì)。棚外設(shè)置可移動(dòng)的遮陽網(wǎng)，扦插后每天噴霧保持空氣相對(duì)濕度在85%以上，15 d后減少噴霧次數(shù)，并及時(shí)清除苗床雜草。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1正交試驗(yàn)

以基質(zhì)(A)、ABT濃度(B)、浸泡時(shí)間(C)為試驗(yàn)因素，其中D為空列，每因素3個(gè)水平，按L9(34)正交表(表1)對(duì)波葉青牛膽進(jìn)行扦插試驗(yàn)，共計(jì)9個(gè)處理，每個(gè)扦插數(shù)為30個(gè)，研究各因素水平對(duì)波葉青牛膽扦插生根情況的影響；20 d后，記錄地下部分農(nóng)藝性狀指標(biāo)(包括總根數(shù)、不定根數(shù)、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、生根率、腐爛率)和地上部分農(nóng)藝性狀指標(biāo)(包括出芽數(shù)、葉片數(shù)、最大葉面積、發(fā)芽率)。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design with L9 (34)

1.3.2優(yōu)化試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為參考，研究在相同基質(zhì)和激素濃度條件下，以不同浸泡時(shí)間為梯度，進(jìn)一步做扦插優(yōu)化試驗(yàn)，清水處理作為對(duì)照(ck)；每種處理20個(gè)莖段，3次重復(fù)。20 d后，記錄地下部分農(nóng)藝性狀指標(biāo)(包括總根數(shù)、不定根數(shù)、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、生根率、腐爛率)和地上部分農(nóng)藝性狀指標(biāo)(包括出芽數(shù)、葉片數(shù)、最大葉面積、發(fā)芽率)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 優(yōu)化組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Test design of optimized combination

1.4 扦插后管理

莖段扦插深度約3 cm。扦插后每天噴霧保持空氣相對(duì)濕度在85%以上，15 d后減少噴霧次數(shù)，20 d后統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。

生根率(%)=(生根插穗數(shù)/插穗總數(shù))×100%；

腐爛率(%)=(腐爛插穗數(shù)/插穗總數(shù))×100%；

抽芽率(%)=(抽芽插穗數(shù)/插穗總數(shù))×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

Microsoft Excel 2007軟件整理數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)所有指標(biāo)使用鄧肯法(Duncan)進(jìn)行方差分析，Origin 8.0軟件制圖。方差分析前，參照Bashir等[9]的方法對(duì)所有百分率指標(biāo)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換(sin-1)，而生根數(shù)等數(shù)量指標(biāo)在處理間的變幅較大，作對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換[lg(x+1)]，以滿足正態(tài)分布假設(shè)。

隸屬函數(shù)計(jì)算公式為：

U(Xj) = (Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin)

式中：Xj為某一處理的某一指標(biāo)值，Xmin、Xmax分別為所有處理在該指標(biāo)中的最小值和最大值。腐爛率與生根效果呈負(fù)相關(guān)，其公式為：

U(Xj)=1-(Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin) 。

將各處理不同指標(biāo)的隸屬值進(jìn)行累加求其平均值，平均值越大效果越好[10-11]。

使用杭州萬深檢測(cè)科技有限公司生產(chǎn)的LA-S植物圖像分析儀測(cè)定葉面積。

2 結(jié)果分析

2.1 波葉青牛膽各農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析

由表3可知，腐爛率與所有的農(nóng)藝性狀呈負(fù)相關(guān)，其中與生根率、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、出芽數(shù)、發(fā)芽率呈極顯著負(fù)相關(guān)，與總根數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)；不定根數(shù)與總根數(shù)呈顯著正相關(guān)，與最大葉面積呈負(fù)相關(guān)；總根數(shù)與最長(zhǎng)根長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，與生根率、發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；最長(zhǎng)根長(zhǎng)與生根率呈極顯著正相關(guān)，與出芽數(shù)、發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；生根率與出芽數(shù)、發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；出芽數(shù)與發(fā)芽率呈極顯著正相關(guān)，與葉片數(shù)、最長(zhǎng)葉柄呈顯著正相關(guān)；葉片數(shù)與最長(zhǎng)葉柄、最大葉面積呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)；最長(zhǎng)葉柄與最大葉面積呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)。

表3 波葉青牛膽各農(nóng)藝性狀相關(guān)性Table 3 Correlation analysis of agronomic traits of T. crispa

2.2 不同處理組合對(duì)波葉青牛膽扦插的影響

本試驗(yàn)以5個(gè)地下部分指標(biāo)和5個(gè)地上部分指標(biāo)從不同層面考察了不同試驗(yàn)因素對(duì)波葉青牛膽扦插育苗的影響，由于單一或少數(shù)指標(biāo)難以全面、客觀地反映各組合的育苗效果，為進(jìn)一步全面反映各個(gè)處理因素及水平對(duì)波葉青牛膽扦插育苗情況的綜合效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用隸屬函數(shù)法對(duì)各組合的生根效果、發(fā)芽效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，將各處理不同指標(biāo)的隸屬值進(jìn)行累加求其平均值，平均值越大扦插效果越好。

因素的主次是以極差(R)的大小來衡量。R值大，表明此因素對(duì)試驗(yàn)的產(chǎn)生與結(jié)果影響大，說明該因素比較重要；R值小，則表明其對(duì)試驗(yàn)的影響小，說明該因素相對(duì)比較次要[12]。由R值大小的比較分析可以看出，3種因素對(duì)波葉青牛膽生根效果的影響從大到小依次為A(基質(zhì))、C(浸泡時(shí)間)、B(ABT濃度)，通過直觀分析法，得出波葉青牛膽生根效果的優(yōu)組合為A1B2C1(表4)；對(duì)波葉青牛膽發(fā)芽效果的影響從大到小為C(浸泡時(shí)間)、A(基質(zhì))、B(ABT濃度)，發(fā)芽效果的優(yōu)組合為A2B3C1(表5)；對(duì)波葉青牛膽扦插效果的影響從大到小為A(基質(zhì))、C(浸泡時(shí)間)、B(ABT濃度)，優(yōu)組合為A1B2C1(表6)。

表4 正交試驗(yàn)不同處理組合對(duì)波葉青牛膽扦插地下部分影響的直觀分析Table 4 Visual analysis of the effects of different treatment combinations in orthogonal test on the underground part of the cuttings of T. crispa

表5 不同處理組合對(duì)波葉青牛膽扦插地上部分影響的直觀分析Table 5 Visual analysis of the effects of different treatment combinations in orthogonal test on the aboveground part of the cuttings of T. crispa

表6 不同處理組合對(duì)波葉青牛膽扦插影響的直觀分析Table 6 Visual analysis of the effects of different treatment combinations in orthogonal experiment on the cutting

2.3 不同處理組合對(duì)波葉青牛膽扦插影響的方差分析

進(jìn)一步做方差分析，以判斷各個(gè)因素對(duì)波葉青牛膽扦插育苗的影響程度。 A處理中，A1、A2處理水平的生根效果較好，兩個(gè)水平的生根效果差異不顯著，其中A1的生根效果最好，且與A3差異顯著；A2和A3處理水平的生根效果差異不顯著；A處理的3個(gè)水平對(duì)發(fā)芽效果和扦插效果的影響均不顯著；綜合3個(gè)指標(biāo)，可以看出A1水平處理的效果最好，B處理和C處理的3個(gè)水平對(duì)波葉青牛膽的生根效果、發(fā)芽效果和扦插效果3個(gè)指標(biāo)的影響均不顯著，其中以B2，C1水平處理的較好；由方差分析得出，波葉青牛膽扦插育苗的優(yōu)組合為A1B2C1(表7)。

表7 正交試驗(yàn)不同因素組合對(duì)波葉青牛膽扦插影響的方差分析Table 7 Variance analysis of the effects of different factors combination in orthogonal experiment on the cutting

2.4 優(yōu)化試驗(yàn)不同處理組合對(duì)波葉青牛膽扦插生長(zhǎng)的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)獲得的波葉青牛膽扦插育苗的優(yōu)組合為參考，研究在河沙和ABT濃度為400 mg/L的統(tǒng)一條件下，以不同浸泡時(shí)間為梯度，進(jìn)一步做扦插優(yōu)化試驗(yàn)，分析各優(yōu)化組合對(duì)地下部分(須根數(shù)、不定根數(shù)、最長(zhǎng)根長(zhǎng))、地上部分(出芽數(shù)、葉片數(shù)、最大葉面積)等農(nóng)藝性狀和生根率、腐爛率、發(fā)芽率等指標(biāo)的影響。最后根據(jù)采用隸屬函數(shù)法對(duì)各組合的生根效果(須根數(shù)，不定根數(shù)，最長(zhǎng)根長(zhǎng)，生根率，腐爛率)、發(fā)芽效果(出芽數(shù)，葉片數(shù)，最大葉面積，發(fā)芽率)，扦插效果(所有指標(biāo))進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

在相同基質(zhì)和激素濃度下，不同浸泡時(shí)間對(duì)波葉青牛膽各扦插指標(biāo)的影響也各不相同；隨著浸泡時(shí)間的增加，須根數(shù)、不定根數(shù)、最長(zhǎng)根長(zhǎng)等地下部分農(nóng)藝性狀指標(biāo)數(shù)值呈先增后減的趨勢(shì)；其中須根數(shù)在浸泡2 min和10 min時(shí)，數(shù)量較多，每株平均數(shù)量分別為16條和12.15條，兩處理間差異不顯著，而和ck(清水浸泡2 min)、30 min、1 h、6 h等4個(gè)處理差異顯著；ck和30 min處理的平均每株須根數(shù)較少，分別為2.83條和2.47條，兩者間差異不顯著；浸泡1 h后，平均每株須根數(shù)僅有0.7條，浸泡6 h后須根數(shù)為0條；須根數(shù)由多到少的順序?yàn)? min、10 min、ck、30 min、1 h、6 h(圖1-a，圖2)。

不定根數(shù)在浸泡2 min和10 min時(shí)，平均每株數(shù)量較多，分別為7.07條和7.95條，兩者間差異不顯著，與ck(1.33條)、30 min(2.47條)、1 h(2.15條)、6 h(2.17條)差異顯著；ck與1 h以及6 h處理的不定根數(shù)較少，三者間差異不顯著；30 min次之；不定根數(shù)由多到少的順序?yàn)?0 min、2 min、30 min、6 h、1 h、ck(圖1-a，圖2)；

最長(zhǎng)根長(zhǎng)在浸泡2 min和10 min時(shí)，每株平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)，分別為10.65 cm和7.62 cm，兩者間差異不顯著，與ck(4.86 cm)、30 min(6.51 cm)、1 h(2.79 cm)、6 h(1.09 cm)差異顯著；30 min次之，ck、1 h、6 h較短，其平均長(zhǎng)度由長(zhǎng)到短依次為2 min、10 min、30 min、ck、1 h、6 h(圖1-a，圖2)。

隨著浸泡時(shí)間的增加，出芽數(shù)、葉片數(shù)、最長(zhǎng)葉柄等指標(biāo)的數(shù)值呈先增加后減小的趨勢(shì)，浸泡6 h后，3個(gè)指標(biāo)的數(shù)值均為0。其中出芽數(shù)在ck，2 min和10 min處理時(shí)數(shù)值最大，每株平均出芽數(shù)分別達(dá)到0.72個(gè)，0.92個(gè)和0.95個(gè)，且三者間差異不顯著，與30 min(0.4個(gè)/株)、1 h(0.13個(gè)/株)、6 h(0個(gè)/株)差異顯著；浸泡30 min的處理組合次之；1 h和6 h的平均出芽數(shù)最小，其平均出芽數(shù)由多到少依次為10 min、2 min、ck、30 min、1 h、6 h(圖1-b，圖2)。

葉片數(shù)在浸泡10 min處理時(shí)數(shù)值最大，每株為2.78片，且與其他處理差異顯著；2 min的處理較好，每株為1.88片；ck處理次之，每株為0.77片；浸泡30 min后，每株葉片數(shù)僅為0.2片，其平均葉片數(shù)由多到少依次為10 min、2 min、ck、30 min、1 h、6 h(圖1-b，圖2)。

最大葉面積在2～10 min處理時(shí)數(shù)值最大，分別為16.27 cm2/株和16.80 cm2/株，兩者差異不顯著，而與ck(0.48 cm2/株)、30 min(0.14 cm2/株)、1 h(0.16 cm2/株)、6 h(0 cm2/株)差異顯著；ck和30 min、1 h以及6 h的處理較小，四者間差異不顯著；其平均值由大到小依次為10 min、2 min、ck、1 h、30 min、6 h(圖1-b，圖2)。

圖1 優(yōu)化試驗(yàn)不同處理組合對(duì)波葉青牛膽各農(nóng)藝性狀指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of different treatment combinations on the agronomic traits of T. crispa

生根率在2～30 min處理時(shí)效果較好，分別為88.33%，86.67%和93.33%，三者間差異不顯著；ck次之，為83.33%，與2 min，10 min處理差異不顯著；1 h和6 h處理的生根率較低，僅為45%和35%；其生根率由大到小依次為30 min、2 min、10 min、ck、1 h、6 h(圖1-c)。

腐爛率在ck和2～30 min處理時(shí)，效果較好，分別為11.67%，11.67%，13.33%和6.67%，四者間差異不顯著，而與1 h(53.33%)和6 h(65%)差異顯著；其腐爛率由低到高依次為30 min、ck=2 min、10 min、1 h、6 h(圖1-c)。

發(fā)芽率在ck，2～10 min處理時(shí)，效果較好，分別為71.67%，71.67%和78.33%，三者間差異不顯著；30 min次之，為40%，與ck，2 min，10 min處理差異顯著；1 h和6 h處理的發(fā)芽率較低，僅為13.33%和0；其發(fā)芽率由大到小依次為10 min、2 min=ck、30 min、1 h、6 h(圖1-c)。

2～10 min處理時(shí)，生根效果，發(fā)芽效果及扦插效果都最好；隨著浸泡時(shí)間的增加，這3個(gè)指標(biāo)都呈逐漸下降趨勢(shì)；其中生根效果指數(shù)在2～10 min處理時(shí)分別為0.47和0.42，1 h后的生根效果指數(shù)為0.072，6 h時(shí)更低，僅有0.013，生根效果由高到低依次為2 min、10 min、30 min、ck、1 h、6 h；發(fā)芽效果指數(shù)最高為0.5，發(fā)芽效果由高到低依次為10 min、2 min、ck、30 min、1 h、6 h；扦插效果指數(shù)最高為0.949，扦插效果由高到低依次為2 min、10 min、ck、30 min、1 h、6 h(圖1-d)。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

扦插基質(zhì)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，扦插部位浸泡時(shí)間等外界因素對(duì)插穗生根均有影響[13]，也是扦插育苗實(shí)驗(yàn)中常見的研究因子?；|(zhì)是影響植物扦插生根的重要影響因子，決定了插穗的生根環(huán)境[14]，直接影響生根的難易和生根質(zhì)量。本正交試驗(yàn)中，基質(zhì)對(duì)波葉青牛膽的扦插生根起主導(dǎo)作用，這與在蒜香藤[15]、薔薇[16]、金花茶[17]等的扦插研究也得到了驗(yàn)證；園土為基質(zhì)，波葉青牛膽生根效果最差；河沙，椰糠生根效果較好。究其原因可能為園土質(zhì)地較黏重，吸水性較強(qiáng)，透氣不良，不利于波葉青牛膽根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，而河沙或椰糠則不會(huì)有以上缺點(diǎn)。因此，園土并不適用于波葉青牛膽扦插。

激素的使用有利于誘導(dǎo)根原始體，促進(jìn)不定根的生長(zhǎng)。不同類型的外源激素對(duì)不同植物扦插生根的影響不同；同一激素不同濃度不同的浸泡時(shí)間亦影響著扦插效果。ABT作為生根促進(jìn)劑的相關(guān)研究較多，這已經(jīng)許多物種上得到了驗(yàn)證：郭其強(qiáng)等[18]認(rèn)為，藏柏和巨柏在100 mg/L的ABT 溶液中浸泡插穗3 h時(shí)，插穗愈傷組織和根系發(fā)育狀況最優(yōu)；諶振等[19]采用1 250 mg/L的ABT 1號(hào)處理杏黃龍船花插穗，生根效果最好；10 mg/L ABT可有效提高杜鵑花扦插的成活率[20]；150 mg/L浸泡3 h的ABT 1號(hào)溶液處理，有利于樹頭菜的插穗生根和改善根系質(zhì)量，提高插穗內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，對(duì)其插穗生根有促進(jìn)作用[21]。

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，不同浸泡時(shí)間對(duì)波葉青牛膽的扦插效果差異顯著；基本上隨著浸泡時(shí)間的增加，各生長(zhǎng)指標(biāo)基本上呈先增后減的趨勢(shì)；說明在同一濃度條件下，插穗受在水中浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短而影響扦插效果；浸泡2～10 min時(shí)，插穗的地下部分(須根數(shù)、不定根數(shù)、最長(zhǎng)根長(zhǎng))和地上部分(出芽數(shù)、葉片數(shù)、最大葉面積)等農(nóng)藝性狀都比較好；生根率、發(fā)芽率都比較高，腐爛率較低；隨著浸泡時(shí)間的增加(大于30 min)，插穗腐爛率高，生根率和發(fā)芽率都較低，可能是由于波葉青牛膽短時(shí)間內(nèi)就能完全吸收所需激素，隨著浸泡時(shí)間的增加，激素過度吸收，促進(jìn)作用轉(zhuǎn)為抑制作用，這與潘越等[22]、張沛健等[23]研究結(jié)果基本相同，至于具體原因，還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究探索。

3.2 結(jié) 論

本研究以基質(zhì)、ABT濃度，浸泡時(shí)間為因素，通過三因素三水平的正交試驗(yàn)，得出波葉青牛膽扦插的最優(yōu)組合是以河沙為扦插基質(zhì)，使用400 mg/L的ABT溶液浸泡10 min；以優(yōu)組合為參考，深入研究同一基質(zhì)和濃度下不同浸泡時(shí)間處理，當(dāng)以河沙為扦插基質(zhì)，使用400 mg/L的ABT溶液浸泡2～10 min時(shí)，波葉青牛膽的生根效果，發(fā)芽效果及扦插效果都最好。該結(jié)果將對(duì)藥用植物波葉青牛膽的人工扦插繁殖提供一定的參考。