婁冰冰， 趙一博， 辛翠花， 卞曉燕， 郭江波

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.雪川農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司， 河北 張家口 076481)

隨著工礦業(yè)的迅速發(fā)展，化肥、農(nóng)藥的大量使用，土壤重金屬含量不斷增加，土壤重金屬污染日趨嚴重[1]。一些重金屬元素是植物生長所必需的微量元素，常作為酶的重要輔因子，參與植物的生理生化活動以及代謝過程，濃度過高也會對植物產(chǎn)生毒害作用。例如，過量的錳、銅和鋅會影響植物光合作用的正常進行，導(dǎo)致植株黃化，也會造成植物細胞損傷以及干擾植株對其他離子的吸收。另一些是植物生長非必需的元素，即使?jié)舛群艿鸵矔绊戅r(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量品質(zhì)，高濃度時會對植物產(chǎn)生毒害作用，如鉛、鎘、鉻等。這些非必需的重金屬離子會影響植物細胞膜透性、破壞植物抗氧化防御系統(tǒng)以及光合系統(tǒng)，嚴重時會導(dǎo)致整株死亡。植物中的重金屬離子會通過食物鏈富集到各個生物群體，從而危害人體健康[2-5]。因此，許多研究者希望通過研究植物響應(yīng)重金屬脅迫的分子機制來解決上述問題。本實驗室前期通過甲基化敏感多態(tài)性擴增技術(shù)克隆了編碼精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)蛋白的基因，但是對該基因在植物中如何響應(yīng)Cd2+脅迫的研究鮮有報道。精氨酰-tRNA合成酶是一類參與將氨基酸結(jié)合到其對應(yīng)的tRNA上的過程的酶[6]。布氏錐蟲ArgRS基因沉默會引起使細胞快速死亡，表明其對維持基本生命活動的重要性[7]。

在蛋白質(zhì)合成過程中，氨基酸必須與特定的tRNA結(jié)合，在氨酰tRNA合成酶(aaRSs)生成氨酰tRNAs(aatRNAs)，才能夠開始蛋白質(zhì)的合成。氨酰-tRNA合成酶催化的反應(yīng)分兩步進行：首先ATP將同源氨基酸激活以形成氨?；?AMP，并釋放一分子的焦磷酸；之后氨?；糠洲D(zhuǎn)移到tRNA的2′-或3′-羥基上，與tRNA CCA末端的核糖環(huán)形成aa-tRNA[8]。根據(jù)催化活性位點的序列差異，氨酰tRNA合成酶分為兩類：Ⅰ類aaRS在活性位點的Rossmann折疊域中具有兩個同源保守序列HIGH和KMSK；Ⅱ類aaRS的活性中心包含一個7條反平行的β折疊結(jié)構(gòu)和三個同源保守序列[9-10]。其中精氨酰-tRNA合成酶屬于第Ⅰ類氨酰-tRNA合成酶，但是大多數(shù)不同來源的ArgRS不同，該蛋白缺乏保守的KMSK序列，并且它所催化的氨基酰化反應(yīng)是一步完成的[11-12]。目前對精氨酰-tRNA合成酶的研究多在細菌與動物中，其在植物中的生物學(xué)功能知之甚少。

本氏煙草是煙草屬植物，株型較小，易于進行遺傳操作，是實驗室常用模式植物。煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)侵染后能夠誘發(fā)本氏煙草細胞內(nèi)的RNA干擾機制，實現(xiàn)目的基因的定向沉默，是有效的研究植物基因功能的技術(shù)手段。本研究采用了TRV病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，快速分析本氏煙草精氨酰-tRNA合成酶在植物響應(yīng)鎘脅迫反應(yīng)中的功能。

1 材料與方法

1.1 材 料

本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子，大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DB 3.1、Top 10和農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV 3101均由內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實驗室保存提供。TRIzol試劑、2×TaqPCR Master Mix、pGM-T載體、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；SYBR?Premix ExTaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)和限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1材料種植及Cd2+脅迫處理

煙草材料種植于有機土與蛭石等體積混合的花盆中，溫室培養(yǎng)(光照16 h，22 ℃)，待長出4片真葉時(約4周齡)，分別用0(ck)、250 mg/L和500 mg/L氯化鎘(CdCl2)溶液澆灌煙草，每周2次，每次150 mL，2周后分別采集各處理植株葉片0.2 g，用于后續(xù)試驗。

1.2.2NbRS基因克隆與生物信息學(xué)分析

本實驗室利用甲基化敏感性擴增多態(tài)性(Methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP)技術(shù)鑒定響應(yīng)Cd2+脅迫相關(guān)基因，獲得編號為MSAP 61-1的DNA差異片段，經(jīng)在茄科植物數(shù)據(jù)庫SNG(the Solanaceae Genomics Network) (http://solgenomics.net/)比對得到序列全長(基因序列編號：Niben 101 Scf 03307 g 00020.1)，設(shè)計引物(見表1)擴增全長。目的條帶純化回收后連接植物表達載體，經(jīng)過測序及序列比對正確，得到本氏煙草NbRS基因全長。

進一步利用NbRS基因序列在SNG數(shù)據(jù)庫中檢索得到其基因組序列：Niben 101 Scf 00551 Ctg 004，并獲得內(nèi)含子和外顯子數(shù)據(jù)。利用GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org)繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

將NbRS蛋白序列輸入SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)，對該蛋白的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測分析。

利用NbRS蛋白序列在NCBI中檢索，獲得擬南芥(Arabidopsisthaliana)以及茄科(Solanaceae)同源蛋白序列，然后通過MEGA X，采用最大似然分析法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(1 000次自動重復(fù)運算)。

1.2.3NbRS受鎘脅迫表達量分析

用Trizol法提取不同濃度Cd2+處理一周的本氏煙草的總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。利用實時熒光定量PCR儀(ABI 7500)，以EF1a為內(nèi)參基因，分析重金屬脅迫前后，候選基因表達水平的變化(引物見表1)。每個處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，以0處理時表達量1.0為ck，低于1.0表示基因表達下調(diào)，高于1.0表示基因表達上調(diào)。采用Origin Pro 2018軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖。

表1 NbRS基因相關(guān)引物Tlabe 1 List of NbRS-related primers

1.2.4鎘脅迫對NbRSDNA甲基化水平影響

用SDS法提取不同濃度Cd2+處理完畢本氏煙草的基因組DNA，利用DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(DP 215，天根生化科技(北京)有限公司)進行處理。以上述DNA為模板，對MSAP 61-1區(qū)域進行擴增(引物見表1)，將PCR產(chǎn)物連接pEASY?-T 1 Cloning Vector(CT 101-01，北京全式金)，測序。

1.2.5NbRS病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)分析、載體構(gòu)建及表型分析

VIGS載體構(gòu)建。首先利用SGN VIGS Tool(https://vigs.solgenomics.net)選取NbRS基因最佳基因沉默區(qū)域設(shè)計引物(見表1)，然后利用pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(CU 101-01，北京全式金)將目的片段連接載體pYY 13[13]。

VIGS植物表型、重金屬耐受力分析。將構(gòu)建的VIGS載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV 3101，注射不大于60日齡的本氏煙草，2周后開始觀察植物發(fā)育表型的變化。提取NbRSVIGS植物總RNA，以NbEF1a為內(nèi)參，進行半定量RT-PCR驗證候選基因沉默效果。用250 mg/L Cd2+處理VIGS植物，觀察植物對Cd2+脅迫的響應(yīng)。

VIGS植物光合效率測定。用Handy PEA植物效率分析儀測定植株NbRSVIGS后光合效率，時間設(shè)定為1～300 s，光源強度為3 000 μmol/(m2·s)。葉片暗適應(yīng)時間通常為10～30 min。葉片夾在暗適應(yīng)夾中，拉開暗適應(yīng)夾上金屬遮光片，將探頭放在適應(yīng)夾上相應(yīng)的位置。對葉片進行暗適應(yīng)后測定Fv/Fm值，利用Fv/Fm值進行光和效率曲線作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NbRS基因克隆及生物信息學(xué)分析

以編號為MSAP 61-1的DNA差異片段為模板，PCR擴增后連接到植物表達載體上，鑒定陽性克隆后測序分析。結(jié)果顯示，基因編碼區(qū)片段大小為1 947 bp，編碼649個氨基酸。利用該基因CDS序列在SNG數(shù)據(jù)庫中檢索得到其基因組序列并進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因有16個外顯子，15個內(nèi)含子(圖1 A)。

進一步對該基因編碼蛋白序列分析，發(fā)現(xiàn)含有3個保守結(jié)構(gòu)域：精氨酰tRNA合成酶N端結(jié)構(gòu)域(72到161位氨基酸)、精氨酰tRNA合成酶(169到520位氨基酸)和DALR反密碼子結(jié)合域(534到649位氨基酸)(圖1 B)。精氨酰tRNA合成酶結(jié)構(gòu)域是ArgRS類蛋白家族的特征結(jié)構(gòu)域[14]，因此編碼此蛋白的基因被命名為NbRS。位于NbRS蛋白N端的精氨酰tRNA合成酶N端結(jié)構(gòu)域參與tRNA的識別[15]；精氨酰tRNA合成酶結(jié)構(gòu)域?qū)儆冖耦惏被；鵷RNA合成酶的特征結(jié)構(gòu)域，是負責(zé)激活氨基酸的催化中心結(jié)構(gòu)域[16]；位于NbRS蛋白C端的DALR結(jié)構(gòu)域是一個全α螺旋結(jié)構(gòu)域，是精氨酸t(yī)RNA合成酶的反密碼子結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)[17]。

以NbRS蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast，獲得擬南芥及茄科植物煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、番茄(Solanumlycopersicum)中的同源氨基酸序列，使用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1 C)。結(jié)果表明，來源于本氏煙草的NbRS與煙草和番茄來源的精氨酰tRNA合成酶序列同源性更高(group Ⅰ)，而來源于擬南芥的序列(group Ⅱ)聚于一個類群。說明克隆得到的NbRS是屬于精氨酰tRNA合成酶家族，與前述蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)論一致。

2.2 NbRS基因沉默改變植物發(fā)育表型

目前關(guān)于NbRS基因?qū)χ参锷L發(fā)育影響的研究較少，為了進一步確定該基因是否參與植物發(fā)育，通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)定向下調(diào)了該基因表達(圖2 A、B)。結(jié)果顯示，NbRSVIGS植株中NbRS的表達量低于對照植株，VIGS植株葉片顏色變黃、葉面扭曲不平，出現(xiàn)凸?fàn)顪\綠斑駁，葉尖向下卷曲呈杯狀。結(jié)果表明，NbRS基因是控制植物生長發(fā)育的關(guān)鍵基因。

注：A為NbRS基因組序列示意圖，顯示了外顯子和內(nèi)含子。全長基因組NbRS為1 950 bp，具有 16個外顯子和 15個內(nèi)含子。NbRS的基因結(jié)構(gòu)由GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php) 構(gòu)建。B為NbRS蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖。NbRS的蛋白結(jié)構(gòu)由SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 繪制。C為擬南芥以及茄科植物中NbRS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。通過NCBI網(wǎng)站對NbRS蛋白進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。來源于本氏煙草的NbRS與煙草和番茄來源的精氨酰tRNA合成酶序列同源性更高(group Ⅰ)，而來源于擬南芥的序列(group Ⅱ)聚于一個類群。圖1 NbRS基因及蛋白生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of NbRS gene and encoding protein

注：A為NbRSVIGS植物的表型，為了測試NbRS沉默植物的表型，構(gòu)建了NbRSVIGS載體，通過農(nóng)桿菌侵染到本氏煙草的植株中?？蛰d體作對照。2周后，對對照植物和VIGS植物進行觀察。與對照植物相比，NbRSVIGS植株葉片顏色變黃、葉面扭曲不平，出現(xiàn)凸?fàn)顪\綠斑駁，葉尖向下卷曲呈杯狀。B為NbRS在對照和VIGS植物中的表達水平。通過半定量RT PCR檢測NbRS的表達，NbEF1α用作內(nèi)標(biāo)對照。C為NbRSVIGS和對照植物光合速率的測定。使用Handy PEA植物效率分析儀測定植株的光合效率，NbRSVIGS后植株的光合效率低于對照組。圖2 NbRS參與植物的生長發(fā)育Fig.2 Plant growth and development mediated by NbRS gene

使用Handy PEA植物效率分析儀測定NbRSVIGS植株的光合效率(圖2 C)，結(jié)果顯示，NbRSVIGS后植株的光合效率低于對照，說明NbRS基因沉默后，影響植株的光合效率，但具體機制需進一步研究。

2.3 Cd2+脅迫對NbRS基因組序列DNA甲基化水平影響

DNA經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理后，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)保持不變[18]。由圖3可以看出，候選基因NbRS有1處堿基位點發(fā)生變化：由原來的胞嘧啶C脫氨轉(zhuǎn)變?yōu)閁(DNA中為T)，表明在不同濃度Cd2+處理后，NbRS基因組序列發(fā)生去甲基化反應(yīng)，甲基化水平下降。

2.4 NbRS基因參與植物響應(yīng)鎘脅迫反應(yīng)

本研究結(jié)果表明，Cd2+處理改變NbRS基因的甲基化，而且NbRS基因沉默后導(dǎo)致植物的生長發(fā)育異常，但是該基因缺失對植物耐受Cd2+脅迫的影響尚不明確。為了深入確定NbRS基因是否參與植物響應(yīng)Cd2+脅迫的反應(yīng)，利用實時熒光定量PCR分析了不同濃度Cd2+處理的條件下，NbRS基因表達水平的變化(圖2)。在250 mg/L Cd2+脅迫一周后，本氏煙草植物中NbRS基因的表達量降低，在濃度500 mg/L Cd2+脅迫一周后，NbRS基因的相對表達量升高1.7倍。結(jié)果表明，Cd2+對NbRS基因的表達有影響。

NbRS基因沉默后，植物對重金屬響應(yīng)Cd2+脅迫反應(yīng)變化的結(jié)果(圖4)顯示，用250 mg/L Cd2+處理本氏煙草植株約10 d后，與對照植物對比，NbRSVIGS植株葉片明顯變黃、枯萎甚至死亡，說明NbRS沉默后，植物對Cd2+脅迫的敏感性增加。

注：用星號加框標(biāo)記的胞嘧啶是甲基化狀態(tài)在暴露于Cd2+后發(fā)生變化的胞嘧啶。Original表示不含Cd且未經(jīng)過重亞硫酸鹽處理的樣品。Original-BST表示不含Cd且含有重亞硫酸鹽的樣品。250 mM-Cd-BST表示用250 mg/L Cd2+和重亞硫酸鹽處理的樣品。500 mM-Cd-BST表示用500 mg/L Cd2+和重亞硫酸鹽處理的樣品。字母上的數(shù)字表示核苷酸的位置。從基因組序列中基因的起始密碼子開始計數(shù)。NbRS只有一個CG位點(85)的甲基化狀態(tài)發(fā)生了變化。該CG位點在Cd2+處理下被去甲基化。圖3 NbRS在Cd2+處理前后甲基化變化情況Fig.3 Comparison of methylation changes of NbRS before and after Cd2+ treatment

注：A為不同濃度Cd2+處理下NbRS表達的定量PCR分析。誤差線表示3個獨立生物學(xué)重復(fù)測量值平均值的標(biāo)準差?！?”表示在p<0.05水平上的顯著差異，“**”表示在p<0.01水平上的顯著差異。B為NbRSVIGS植物對鎘脅迫的響應(yīng)。使用濃度為250 mg/L Cd2+處理植株。10 d后，通過與空載體對照植物進行比較，觀察NbRSVIGS植物對Cd2+的響應(yīng)。圖4 NbRS基因參與植物響應(yīng)Cd2+脅迫反應(yīng)Fig.4 Plant response to Cd2+ stress mediated by NbRS gene

3 討 論

精氨酰tRNA合成酶(ArgRS)參與tRNA?；?，是蛋白質(zhì)生物合成過程中具有重要功能作用的酶，屬于第一類氨酰tRNA合成酶[19]。ArgRS催化的tRNA-Arg的氨基?；磻?yīng)與其他氨基酰-tRNA合成酶不同，即在tRNA Arg的存在下，才能催化ATP-PPi的交換反應(yīng)。大腸桿菌ArgRS屬于第一類aaRS，是由577個氨基酸殘基組成的單鏈酶，分子量約為6.7萬，目前對其研究較多的還是其結(jié)構(gòu)和序列[20]；哺乳動物的精氨酰tRNA合成酶是由RaRs基因編碼的，在哺乳動物細胞內(nèi)有兩種形式的ArgRS，一種與aaRS復(fù)合物的形成有關(guān)，命名為cArgRS，另外一種是以游離形式存在于細胞中，命名為ΔNArgRS。劉楊[21]研究表明，沉默ArgRS基因引起的抗氧化應(yīng)激、線粒體功能和糖代謝改善可能是治療缺血性卒中的潛在靶點；在植物中，除了其催化精氨酰-tRNA合成的功能外，其他方面的研究很少。

本研究證實，NbRS基因是控制植物生長發(fā)育的關(guān)鍵基因，參與植物響應(yīng)Cd2+脅迫。Cd2+脅迫能夠改變NbRS基因組中基因編碼區(qū)序列的甲基化修飾水平，但是具有的生物學(xué)機制和意義尚不明了。為深入研究NbRS基因功能及鎘脅迫機理奠定了一定基礎(chǔ)，為培育植物耐受或低積累鎘提供了新的候選基因。