袁真真，孫亞瑋，張 倩，張春陽(yáng)

（山東師范大學(xué) 化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是一種廣泛分布在原核和真核細(xì)胞中的水解酶，它能夠在堿性條件下去除各種磷酸化底物的磷酸基團(tuán)，催化磷酸單酯水解［1－2］。每個(gè)ALP分子由2個(gè)結(jié)構(gòu)相似的單體組成，每個(gè)單體含有2個(gè)鋅離子、1個(gè)鎂離子和5個(gè)半胱氨酸殘基［1，3］。ALP在人體中具有4種同工酶，分別為胎盤堿性磷酸酶、生殖細(xì)胞堿性磷酸酶、腸道堿性磷酸酶和組織非特異性堿性磷酸酶［2］。ALP廣泛存在于人體組織中，參與細(xì)胞周期、生長(zhǎng)、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種過程［4－7］。血清中的ALP主要來源于肝臟、骨骼和腎臟組織，其活性變化與多種疾病如骨質(zhì)疏松［8］、骨軟化［9］、膽道阻塞［10］、肝硬化［11］和敗血癥［12］等密切相關(guān)。同時(shí)，ALP是一些癌癥（例如骨癌［13］、胰腺癌［14］、卵巢癌［15］、乳腺癌［16－17］和前列腺癌［17］）的重要生物標(biāo)志物。此外，ALP還能將一磷酸腺苷水解，生成可作為細(xì)胞信號(hào)分子的腺苷。因此，ALP的超靈敏檢測(cè)對(duì)于臨床疾病診斷和生物醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。

近年來，一系列檢測(cè)ALP活性的方法相繼涌現(xiàn)，主要包括比色法［18－20］、電化學(xué)法［21－23］、表面增強(qiáng)拉曼散射法［24－26］和熒光分析法［27－28］。近紅外熒光探針的發(fā)展突破了ALP體外檢測(cè)的瓶頸，實(shí)現(xiàn)了從體外檢測(cè)到體內(nèi)成像［29－31］的跨越。本文主要綜述了近年來ALP的檢測(cè)和成像研究進(jìn)展，并對(duì)該領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn)及未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 ALP的體外檢測(cè)

1.1 比色法

比色法可通過直接觀察溶液的顏色變化或測(cè)定溶液的吸光度變化對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定性/定量分析。Wu等［32］利用四甲基聯(lián)苯胺（TMB）與氧化型四甲基聯(lián)苯胺（oxTMB）之間的顯色反應(yīng)，合成了一種新型的仿氧化酶（FeCo NPs@PNC），用于檢測(cè)ALP活性（圖1A）。當(dāng)ALP存在時(shí)，其催化L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽（AAP）水解為抗壞血酸（AA），AA進(jìn)一步將藍(lán)色oxTMB還原為無色TMB。該方法的線性范圍為0.6～10 U·L－1，檢出限為0.49 U·L－1。FeCo NPs@PNC有望替代昂貴的天然酶和基于貴金屬的納米酶，在生物分析中顯示出巨大的潛力。Xie等［33］合成了一種具有過氧化物酶樣活性的Fe－N－C單原子納米酶（Fe/NC－SAs），用于檢測(cè)ALP活性。該方法的線性范圍為0.1～1.5 U·L－1，檢出限為0.05 U·L－1。該方法可進(jìn)一步應(yīng)用于人血清樣品中ALP活性的測(cè)定，在臨床疾病診斷中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。Zhou等［34］利用具有過氧化物酶模擬活性的Fe/C NS（Fe-doped carbon nanosheet），建立了一種檢測(cè)ALP活性的比色分析法。ALP能將磷酸苯二鈉水解為苯酚，F(xiàn)e/C NS在H2O2協(xié)助下催化苯酚與4-氨基安替比林的反應(yīng)產(chǎn)生紅醌亞胺。該方法的線性范圍為0.05～6.00 U·L－1，檢出限為0.03 U·L－1。

圖1 FeCo NPs@PNC的合成步驟，F(xiàn)eCo NPs@PNC類氧化酶活性機(jī)制以及AA和ALP的檢測(cè)步驟［32］（A）；ALP的檢測(cè)原理示意圖［35］（B）Fig.1 Synthesis of the FeCo NPs@PNC，the mechanism of oxidase-like activity of the FeCo NPs@PNC，and the procedures for AA and ALP detection［32］（A）；schematic illustration of ALP assay［35］（B）

Mahato等［35］發(fā)展了一種紙基生物傳感器，將ALP抗體固定在功能化紙表面，制備了一種可與ALP免疫結(jié)合的傳感探針，用于檢測(cè)工業(yè)牛奶和原料奶樣品中ALP的活性（圖1B）。ALP催化5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽（BCIP）產(chǎn)生藍(lán)綠色復(fù)合物，利用智能手機(jī)拍攝該復(fù)合物，采用數(shù)字圖像比色法即可對(duì)ALP活性進(jìn)行定量分析。該方法無需復(fù)雜昂貴的分析儀器，檢出限達(dá)0.87 U·mL－1，線性范圍為10～1 000 U·mL－1。

1.2 電化學(xué)法

電化學(xué)法能夠檢測(cè)電極表面的化學(xué)物質(zhì)在電子轉(zhuǎn)移過程中所產(chǎn)生的電信號(hào)變化，具有選擇性好、成本低和攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。二茂鐵具有易于衍生化和良好的電化學(xué)性質(zhì)［36－38］，通常用作電化學(xué)探針的氧化還原活性基團(tuán)。同時(shí)，二茂鐵在水中的穩(wěn)定性較好［39］，促進(jìn)了二茂鐵衍生物在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。Goggins等［40］開發(fā)了一種基于ALP催化二茂鐵苯基磷酸鹽轉(zhuǎn)化成氨基二茂鐵（AFC）反應(yīng)的比率電化學(xué)方法（圖2A）。當(dāng)ALP存在時(shí)，它催化二茂鐵苯基磷酸鹽去磷酸化產(chǎn)生酚類中間體。酚類中間體不穩(wěn)定，釋放出AFC、等量亞甲基苯醌和CO2。二茂鐵苯基磷酸鹽與AFC的電勢(shì)不同，對(duì)兩者在微分脈沖伏安（DPV）信號(hào)中的峰面積積分可計(jì)算出轉(zhuǎn)換率，進(jìn)而對(duì)ALP活性進(jìn)行檢測(cè)。該方法通過電化學(xué)比率法測(cè)定ALP活性，能夠有效避免由采樣和變更電極/儀器所引起的誤差。類似地，Wang等［41］發(fā)展了一種利用氨基二茂鐵檢測(cè)ALP活性的電化學(xué)方法（圖2B）。當(dāng)ALP不存在時(shí)，AFC通過與磷酸基結(jié)合的方式固定在單鏈DNA上，產(chǎn)生電信號(hào)。當(dāng)ALP存在時(shí)，單鏈DNA的5'端被去磷酸化，不能與AFC探針相連，無法產(chǎn)生電信號(hào)。該方法的檢出限可達(dá)1.48 mU·mL－1，線性范圍為20～100 mU·mL－1，具有操作簡(jiǎn)單、快捷和成本低的優(yōu)點(diǎn)。最近，Zhu等［42］發(fā)展了一種基于開環(huán)聚合信號(hào)放大策略檢測(cè)ALP活性的電化學(xué)傳感器。該傳感器的靈敏度高，檢出限達(dá)0.66 mU·mL－1，線性范圍為20～120 mU·mL－1。該傳感器對(duì)人血清樣本具有良好的選擇性和抗干擾性，檢測(cè)結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差小于5%，在臨床診斷中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖2 二茂鐵苯基磷酸鹽的結(jié)構(gòu)和ALP催化氨基二茂鐵的降解機(jī)理［40］（A）；基于酶催化反應(yīng)的電化學(xué)方法檢測(cè)ALP活性的原理圖［41］（B）Fig.2 Structure of ferrocenylphenyl phosphate and the mechanism of ALP-catalysed breakdown with the subsequent release of ferrocenylamin［40］（A）；schematic illustration for electrochemical detection of ALP activity based on enzymecatalyzed reaction［41］（B）

將酶介導(dǎo)的信號(hào)放大反應(yīng)引入電化學(xué)傳感器的構(gòu)建，可顯著提高檢測(cè)靈敏度。Zhang等［43］發(fā)展了一種基于T7外切酶輔助信號(hào)放大的均相電化學(xué)生物傳感器，用于檢測(cè)ALP活性（圖3A）。該研究組設(shè)計(jì)了一個(gè)3'-磷酸化和5'-亞甲基藍(lán)標(biāo)記的發(fā)夾探針，當(dāng)ALP存在時(shí)，發(fā)夾探針中的3'-磷酸基團(tuán)去磷酸變成3'-羥基。隨后，KF DNA聚合酶對(duì)3'-羥基進(jìn)行延伸，啟動(dòng)T7核酸外切酶降解發(fā)夾探針中的雙鏈，釋放亞甲基藍(lán)標(biāo)記的單核苷酸和觸發(fā)DNA探針。觸發(fā)DNA探針能夠與新的發(fā)夾探針雜交，啟動(dòng)循環(huán)切割過程，釋放大量亞甲基藍(lán)標(biāo)記的單核苷酸，產(chǎn)生增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。此方法能在均相溶液中進(jìn)行，無需復(fù)雜的電極修飾過程，檢出限為0.1 U·L－1。Liu等［44］發(fā)展了一種基于末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal transferase，TdT）介導(dǎo)的無模板擴(kuò)增和血紅素/G-四聯(lián)體DNA酶的電化學(xué)傳感器，可靈敏檢測(cè)ALP活性（圖3B）。將巰基功能化的DNA 1和3'-磷酸化的DNA 2形成的雙鏈DNA探針固定在金納米顆粒修飾的玻碳（GC）電極上。當(dāng)ALP存在時(shí)，它催化DNA 2的3'-磷酸基團(tuán)水解，產(chǎn)生3'-羥基端。隨后，TdT催化DNA 2的3'-羥基端延伸出聚T序列。DNA 2的聚T序列能夠與富含堿基G的DNA 3的聚A片段雜交，在血紅素存在時(shí)形成血紅素/G-四聯(lián)體DNA酶。血紅素/G-四聯(lián)體脫氧核酶可將還原型輔酶Ⅰ（NADH）氧化成輔酶Ⅰ（NAD+）并產(chǎn)生H2O2，H2O2會(huì)進(jìn)一步被血紅素/G-四聯(lián)體脫氧核酶催化，在硫堇（Thi）作為電子傳遞介質(zhì)時(shí)產(chǎn)生增強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。該方法的靈敏度高，檢出限可達(dá)0.03 U·L－1，線性范圍為0.1～5 U·L－1。且該生物傳感器具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

圖3 均相電化學(xué)法檢測(cè)ALP活性［43］（A）與基于DNA的電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)ALP［44］（B）的原理示意圖Fig.3 Principles of homogeneously electrochemical detection of ALP activity［43］（A）and DNA-based electrochemical biosensor for ALP activity assay［44］（B）

1.3 表面增強(qiáng)拉曼散射法

表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）是由于拉曼探針與貴金屬納米表面接近而產(chǎn)生，主要來自于金屬粒子表面等離子體共振的光激發(fā)，可以提供分子特異性指紋光譜。Sun等［45］利用表面增強(qiáng)共振拉曼散射（SERRS）結(jié)合液滴微流控技術(shù)，對(duì)單細(xì)胞中ALP活性進(jìn)行靈敏檢測(cè)（圖4A）。當(dāng)BCIP與細(xì)胞共孵育時(shí)，ALP能催化無色的BCIP水解，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物經(jīng)氧化生成藍(lán)色物質(zhì)5，5'-二溴-4，4'-二氯-1H，1H-［2，2'］雙吲哚基-3，3'-二酮（BCI），BCI可以產(chǎn)生拉曼信號(hào)。該方法的檢出限達(dá)1.0×10-15mol/L。

圖4 SERRS結(jié)合液滴微流控法檢測(cè)單細(xì)胞中ALP活性［45］（A）、基于MnO2殼層厚度依賴性的結(jié)晶紫拉曼信號(hào)檢測(cè)ALP活性［46］（B）以及用于ALP活性比率檢測(cè)的AMAM SERS納米探針［47］（C）的原理示意圖Fig.4 Schematic illustrations of the droplet-based microfluidic SERRS method for the detection of ALP activity in single cell［45］（A），ALP activity detection based on the MnO2 shell thickness-dependent SERS signal from crystal violet［46］（B），and the AMAM SERS nanoprobe for ratiometric sensing of the alkaline phosphatase activity［47］（C）

Liu等［46］開發(fā)了一種基于金納米雙錐體@MnO2納米顆粒（Nanobipyramids@MnO2nanoparticles，AMNS）的SERS方法，用于檢測(cè)ALP活性（圖4B）。ALP可將AAP水解為AA，AA能將MnO2還原為Mn2+，進(jìn)而蝕刻AMNS的外殼，增強(qiáng)電磁場(chǎng)，導(dǎo)致吸附在金納米雙錐體表面上的結(jié)晶紫（CV）的拉曼信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)。該方法的檢出限為0.04 mU·mL－1，線性范圍為0.4～20 mU·mL－1，有效克服了傳統(tǒng)SERS方法標(biāo)記效率低和耗時(shí)長(zhǎng)的問題，在生物樣品分析中具有良好的應(yīng)用前景。另外，最新發(fā)展的比率型SERS納米探針能有效減少實(shí)驗(yàn)干擾，提高SERS定量分析的準(zhǔn)確度。Dai等［47］開發(fā)了一種SERS納米探針（Au－Mpy－Au－MnO2，AMAM），用于定量檢測(cè)血清中ALP的活性（圖4C）。MnO2殼層具有較強(qiáng)的拉曼振動(dòng)信號(hào)I（MnO2），可以作為拉曼參考。AMAM探針中4-巰基吡啶（Mpy）的拉曼強(qiáng)度I（Mpy）隨著MnO2殼層的蝕刻而增強(qiáng)。該方法以I（Mpy）/I（MnO2）作為輸出信號(hào)，可同時(shí)進(jìn)行比色和SERS分析，檢出限為0.079 U·L－1，線性范圍為0.1～70 U·L－1。該方法可用于直接檢測(cè)未稀釋的微量人血清中ALP的活性。

1.4 熒光分析法

熒光發(fā)射是指物質(zhì)被一定波長(zhǎng)的光照射后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子通過輻射返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出光量子的過程。熒光分析法可用于待測(cè)物質(zhì)的定性和定量檢測(cè)。ALP的熒光檢測(cè)方法具有靈敏度高、選擇性好和背景干擾小的優(yōu)點(diǎn)［48－51］。Zhang課題組［52］構(gòu)建了一種基于循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的熒光分析方法，可靈敏檢測(cè)ALP活性（圖5A）。首先，T7啟動(dòng)子與模板鏈雜交形成雙鏈DNA。當(dāng)ALP存在時(shí)，T7啟動(dòng)鏈5'端因去磷酸化而不能被λ外切酶（λ-exo）降解。T7啟動(dòng)鏈在T7 RNA聚合酶作用下激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)生大量單鏈RNA（ssRNAs）。生成的單鏈RNA可與兩端分別標(biāo)有熒光基團(tuán)羥基熒光素（FAM）和猝滅基團(tuán)Eclipse的Taqman探針雜交形成RNA/DNA雜交體。雙特異性核酸酶（DSN）能夠降解Taqman探針，導(dǎo)致FAM熒光恢復(fù)，并釋放單鏈RNA。釋放的單鏈RNA可與新Taqman探針雜交，誘導(dǎo)循環(huán)降解Taqman探針，產(chǎn)生增強(qiáng)FAM熒光信號(hào)。該方法的靈敏度高，檢出限達(dá)0.02 U·L－1，線性范圍為0.05～1 U·L－1。Ma等［53］發(fā)展了一種僅需1種連接酶即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的量子點(diǎn)納米傳感器，用于ALP的靈敏檢測(cè)（圖5B）。當(dāng)ALP存在時(shí)，它可以催化檢測(cè)探針3'-磷酸末端去磷酸化，生成3'-羥基末端。3'羥基化的檢測(cè)探針、5'磷酸化的輔助探針和模板可形成檢測(cè)探針－輔助探針－模板的“三明治”結(jié)構(gòu)。在連接酶作用下，檢測(cè)探針與輔助探針連接成一個(gè)二級(jí)模板。二級(jí)模板經(jīng)過變性可與生物素（Biotin）標(biāo)記的探針和5H-吲哚菁（Cy5）標(biāo)記的探針形成biotin－Cy5探針。經(jīng)過無數(shù)個(gè)退火－連接－變性循環(huán)過程，可以產(chǎn)生大量biotin－Cy5雙標(biāo)記信號(hào)探針。該探針能夠自組裝到表面修飾有鏈霉親和素的量子點(diǎn)上，形成605 QD/信號(hào)探針/Cy5“三明治”結(jié)構(gòu)，在605 QD和Cy5之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生Cy5信號(hào)。該方法的檢出限可達(dá)5.63×10－7U·mL－1，線性范圍為1×10－6～1×10－1U·mL－1。方法非常簡(jiǎn)單，只需1種連接酶即可完成信號(hào)擴(kuò)增，有效簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。

Wang等［54］設(shè)計(jì)了一種基于循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的ALP熒光檢測(cè)方法（圖5C）。當(dāng)ALP存在時(shí)，3'磷酸化的引物被去磷酸化，與發(fā)夾探針1（HP 1）的3'凸出端雜交，啟動(dòng)第一次鏈置換擴(kuò)增（SDA），產(chǎn)生觸發(fā)引物1（Trigger 1）和熒光信號(hào)。釋放的觸發(fā)引物1與發(fā)夾探針2（HP 2）的3'凸出端雜交，以啟動(dòng)第二次SDA，產(chǎn)生觸發(fā)引物2（Trigger 2）和熒光信號(hào)。觸發(fā)引物2又可與HP 1的3'凸出端雜交，啟動(dòng)兩個(gè)連續(xù)的SDA，產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光信號(hào)。該方法可在等溫條件下進(jìn)行，靈敏度高，檢出限達(dá)2.0×10-10U·μL-1，線性范圍為1×10－9～1×10－4U·μL－1。

Wang等［55］發(fā)展了一種更為簡(jiǎn)單的熒光方法，可一步定量檢測(cè)人血清中的ALP（圖5D）。該研究組設(shè)計(jì)了一種功能化的寡核苷酸探針－聚腺嘌呤分子信標(biāo)（Poly－A MB），Poly－A MB上標(biāo)記有1個(gè)BHQ1和1個(gè)彼此靠近的熒光團(tuán)FAM，其3'末端修飾了1個(gè)磷酸基團(tuán)，Poly－A被嵌入環(huán)中。當(dāng)ALP存在時(shí)，它催化Poly－A MBs的3'端去磷酸化，誘導(dǎo)TdT介導(dǎo)的無模板擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生長(zhǎng)鏈聚胸腺嘧啶（Poly－T）序列。長(zhǎng)鏈Poly－T可作為模板與多個(gè)Poly－A MBs雜交，導(dǎo)致Poly－A MBs環(huán)結(jié)構(gòu)的展開和FAM/BHQ1的分離。隨后，3'-羥基化的Poly－A MBs在TdT作用下延伸，生成分支長(zhǎng)鏈Poly－T，導(dǎo)致大量FAM/BHQ1分離。經(jīng)過循環(huán)延伸－組裝－激活，Poly－A MBs自組裝形成樹突狀DNA納米結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大量FAM/BHQ1分離，產(chǎn)生指數(shù)放大的熒光信號(hào)。該方法的檢出限為3.2×10－7U·μL－1，線性范圍為5×10－7～1×10－3U·μL－1。該方法僅需1個(gè)DNA探針和1種工具酶，可在等溫條件下一步完成ALP活性檢測(cè)，具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)。

圖5 基于去磷酸化啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)介導(dǎo)的雙信號(hào)擴(kuò)增方法檢測(cè)ALP活性的示意圖［52］（A）；基于連接酶擴(kuò)增反應(yīng)的單量子點(diǎn)納米傳感器檢測(cè)ALP活性的示意圖［53］（B）；基于引物去磷酸化啟動(dòng)的循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增方法檢測(cè)ALP活性的示意圖［54］（C）；3'端修復(fù)驅(qū)動(dòng)的Poly－A分子信標(biāo)自組裝形成樹突狀納米傳感器一步定量檢測(cè)人血清中ALP的示意圖［55］（D）Fig.5 Schematic illustration of ALP assay based on dephosphorylation-initiated transcription reaction-mediated dual signal amplification［52］（A）；schematic illustration of ligase amplification reaction-catalyzed assembly of a single QD-based nanosensor for ALP assay［53］（B）；schematic illustration of ALP assay based on primer dephosphorylation-initiated circular exponential amplification［54］（C）；schematic illustration of the 3'-terminal repair-powered dendritic nanoassembly of Poly-A molecular beacons for one-step quantification of ALP in human serum［55］（D）

2 ALP的體內(nèi)成像

應(yīng)當(dāng)指出的是，上述方法大多不適用于細(xì)胞內(nèi)成像。與傳統(tǒng)的在可見波長(zhǎng)范圍內(nèi)使用的熒光探針相比，近紅外（NIR）熒光探針能夠在NIR光譜區(qū)域成像，對(duì)生物體造成的光損傷小，受內(nèi)源性組織自身熒光的干擾?。?6］。Liu等［57］發(fā)展了一種基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）原理，可用于活體檢測(cè)ALP的近紅外熒光探針NALP（圖6A）。當(dāng)ALP不存在時(shí)，磷酸基團(tuán)保護(hù)NIR熒光團(tuán)的羥基，使其無法發(fā)射熒光；當(dāng)ALP存在時(shí)，磷酸基團(tuán)被催化水解，釋放NIR熒光團(tuán)，產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光信號(hào)。該探針具有良好的細(xì)胞膜通透性和極小的細(xì)胞毒性，線性范圍為1～30 U·L－1，檢出限達(dá)0.28 U·L－1，可用于裸鼠活細(xì)胞和腫瘤組織中內(nèi)源性ALP的活體成像。類似地，Li等［58］發(fā)展了一種基于半水楊酸的近紅外熒光探針CyP，可用于細(xì)胞、組織和動(dòng)物活體內(nèi)ALP的檢測(cè)。

Park等［59］合成了2種NIR探針（NIR－Phos-1和NIR－Phos-2），用于快速靈敏檢測(cè)ALP活性。該NIR探針包含1個(gè)酚類二氫基蒽熒光團(tuán)中心和1個(gè)添加磺酸基的磷酸鹽（以增強(qiáng)其在水中的溶解度）。這兩種NIR探針本身不發(fā)熒光，但經(jīng)ALP催化去磷酸化后可以發(fā)出較強(qiáng)熒光。將NIR探針標(biāo)記的骨樣3D CDHA支架植入裸鼠皮下，可用于檢測(cè)活體內(nèi)的ALP活性。該探針的靈敏度高、選擇性好，可在1.5 min內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)答，對(duì)NIR－Phos-1和NIR－Phos-2的檢出限分別為10－5U·mL－1和10－3U·mL－1，可用于活細(xì)胞和小鼠內(nèi)源性ALP的原位成像。

單波長(zhǎng)發(fā)射探針易受多種因素（例如光漂白、探針的不均勻分布和儀器變化）的影響。比率熒光探針可以有效地克服這些干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度［60－62］。Zhang等［63］設(shè)計(jì)了一種NIR比率熒光探針APT（圖6B），用于實(shí)時(shí)檢測(cè)ALP活性。當(dāng)ALP不存在時(shí)，該探針的末端氨基（TMN）與1個(gè)吸電子酯基團(tuán)相連，導(dǎo)致電子云分散，APT發(fā)出黃色熒光。當(dāng)ALP存在時(shí)，氨基與ALP發(fā)生特異性反應(yīng)，TMN電子云通過一系列的電子轉(zhuǎn)移和自溶過程恢復(fù)，發(fā)出紅色熒光。該探針具有響應(yīng)時(shí)間短（小于10 min）、檢測(cè)線性范圍寬、熒光背景低、適用于組織成像等優(yōu)點(diǎn)，可用于監(jiān)測(cè)斑馬魚器官損傷引起的內(nèi)源性ALP升高，在病理分析中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

基于聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）原理的AIEgens（AIE luminogens）探針能夠有效限制分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)，提高成像分辨率和原位成像能力［64－65］。Li等［66］合成了一種可激活的AIEgens探針DQM－ALP，用于ALP活性成像（圖6C）。利用疏水的喹啉－丙二腈（QM）衍生物作為AIE核心，親水的磷酸基作為ALP識(shí)別單元。DQM－ALP分子在體外具有明顯的熒光猝滅特征。ALP可以激活該探針，誘導(dǎo)DQM－OH原位聚集，從而限制其分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生AIE熒光。該方法的檢出限為0.15 mU·mL－1，線性范圍為0～60 mU·mL－1，可以有效區(qū)分小鼠正常組織和癌變組織。

圖6 NIR熒光探針NALP的結(jié)構(gòu)及其對(duì)ALP的響應(yīng)機(jī)制［57］（A）；利用NIR比率探針對(duì)活體內(nèi)ALP成像的原理示意圖［63］（B）；DQM－ALP的組裝及AIE在體外和細(xì)胞內(nèi)的激活過程示意圖［66］（C）Fig.6 Structure of NIR fluorescent probe NALP and the response mechanism of NALP towards ALP［57］（A）；schematic illustration for i n vivo imaging of ALP activity using the NIR ratiometric probe［63］（B）；schematic illustration of the assembly of DQM－ALP and process of AIE activation i n vi tro and in cell［66］（C）

3 結(jié)論與展望

ALP是一種廣泛分布于生物體內(nèi)的可以催化蛋白質(zhì)、核酸和小分子去磷酸化的水解酶，其活性失調(diào)與多種疾?。ɡ绻琴|(zhì)疏松、骨軟化、膽道阻塞、肝硬化、敗血癥和癌癥）密切相關(guān)，因而ALP活性分析對(duì)疾病診斷具有重要意義。在目前已開發(fā)的ALP活性檢測(cè)方法中，比色法具有結(jié)果直觀且無需復(fù)雜昂貴儀器的優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度偏低，為了獲得更好的比色效果，迫切需要開發(fā)具有更好顯色性能的新探針。電化學(xué)法具有選擇性好、成本低和儀器便攜的優(yōu)點(diǎn)，但存在信號(hào)相對(duì)較弱、靈敏度較低、ALP底物合成復(fù)雜和需使用多種工具酶等缺陷，需要逐一解決和克服。表面增強(qiáng)拉曼散射法具有靈敏度高和能夠提供分子特異性指紋光譜的優(yōu)點(diǎn)，然而操作復(fù)雜和拉曼信號(hào)不穩(wěn)定仍是迫切需要解決的問題。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、原位實(shí)時(shí)、背景干擾小和具備活體成像能力的優(yōu)點(diǎn)，但在檢測(cè)特異性、熒光穿透、成像分辨率方面仍存在一定的局限性?；贜IR探針和AIEgens探針的活體成像實(shí)現(xiàn)了從體外檢測(cè)到體內(nèi)成像的跨越，但很難實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，同時(shí)在區(qū)分堿性磷酸酶的亞型方面還存在不足。通過對(duì)ALP檢測(cè)研究的回顧，不難發(fā)現(xiàn)ALP檢測(cè)方法的持續(xù)快速發(fā)展在很大程度上取決于納米材料和DNAzymes等新型材料的發(fā)現(xiàn)以及這些新型材料與ALP的生物相容性，因此，開發(fā)更多與ALP具有生物相容性的新型材料可能是未來ALP活性檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。值得關(guān)注的是，單分子檢測(cè)作為一種近年來涌現(xiàn)的新技術(shù)具有樣品消耗低和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在ALP活性檢測(cè)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。另外，鏈置換擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等新型高效擴(kuò)增技術(shù)的引進(jìn)，將極大促進(jìn)ALP活性檢測(cè)方法的飛速發(fā)展。