羅 俊，黨 露，鄭鹿平，劉金玲，柴書軍，趙 東，楊艷艷，滕 蔓

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

室，河南 鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002；3. 廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510095）

異質(zhì)核糖核蛋白（hnRNPs）分屬于一大類RNA結(jié)合蛋白（RBP）家族，目前共鑒定出19個hnRNP 基因，其編碼的蛋白質(zhì)大小介于30～120 ku。hnRNPs蛋白各家族成員間沒有共有結(jié)構(gòu)域，多樣性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了該家族蛋白質(zhì)功能的多樣性。該家族成員除了參與核酸代謝的多個方面，包括選擇性剪接、mRNA 穩(wěn)定、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)功能以外，還參與DNA 修復(fù)和端粒延長、染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄、mRNA 3′端加工、維持mRNA 穩(wěn)定性以及促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1?4]。異質(zhì)核糖核蛋白AB（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB，hnRNPAB）是該蛋白質(zhì)家族中一個特殊的成員，其直系同源物在N 端存在進(jìn)化上保守的獨(dú)特肽結(jié)構(gòu)域[5?7]。除與其他家族成員在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能之外，hnRNPAB還在脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中具有重要作用[8?11]，同時還參與了腫瘤的發(fā)生[12?14]。

雞hnRNPAB 蛋白包含有8 個轉(zhuǎn)錄變體和2 個同型蛋白質(zhì)，其中p37 型含有353 個氨基酸殘基，而p32型含有284個氨基酸殘基[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，作為細(xì)胞癌基因miR-155 的同源物，馬立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）編碼的miR-M4-5p 可特異性靶向識別并下調(diào)雞hnRNPAB 蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）和永生化細(xì)胞系DF-1 的細(xì)胞增殖，同時還抑制細(xì)胞的凋亡，可能與MDV 的致瘤性有關(guān)[13]。目前，市售商品化抗hnRNPAB蛋白的抗體只能識別哺乳動物細(xì)胞，無法識別禽源hnRNPAB 蛋白，制約了開展進(jìn)一步相關(guān)研究。鑒于此，通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備雞hnRNPAB蛋白，免疫小鼠后通過細(xì)胞融合技術(shù)篩選制備hnRNPAB 單克隆抗體，為開展hnRNPAB 蛋白相關(guān)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

pET-30a（+）載體、SP2/0細(xì)胞、HEK293T、BHK-21、Marc-145、MDBK 傳代細(xì)胞系均為本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli克隆菌株DH5α 和表達(dá)菌株BL21、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ、ExTaq酶、DNA Ligation Kit 2.0 和DNA Marker 等均購自TaKaRa 公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自Solarbio 公司；Ni-NTA Fast Start Kit 購自Qiagen 公司；PEG-1500 購自德 國 Roche 公 司 ；NE-PERTMNuclear and Cytoplasmis Extraction Reagents 購自Thermo 公司；NcmECL Ultra（NCM）顯影液和無血清細(xì)胞凍存液購自新賽美公司；FITC-羊抗鼠IgG 和HRP-羊抗鼠IgG 購自美國Abbkine公司；細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）均購自Gibco公司。

1.2 雞hnRNPAB基因表達(dá)載體的構(gòu)建

用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增雞hnRNPAB基因（GenBank 登錄號：NM_205328）的特異 性 PCR 引 物 ， 上 游 引 物 : 5′-GGAATTCGAAGGCGACCAGATCAACG-3′，下游引物: 5′-CCTCGAGTAAAGGCGAAAGGAGCTGC-3′（下劃線標(biāo)示限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)），常規(guī)方法提取CEF 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，PCR 擴(kuò)增雞hnRNPAB基因的部分片段。切膠回收經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析純化的PCR 產(chǎn)物，連接pMDTM19-T 載體并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性質(zhì)粒測序鑒定。用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切測序正確的pMDTM19-T-hnRNPAB質(zhì)粒，膠回收后用DNA Ligation Kit 2.0 連接酶連接獲得pET-30a-hnRNPAB重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21，并涂含氨芐青霉素的LB 平板，過夜培養(yǎng)，將PCR 鑒定為陽性的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)、提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.3 雞hnRNPAB重組蛋白的表達(dá)及純化

用含100 mg/L 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基活化含pET-30a-hnRNPAB重組表達(dá)質(zhì)粒的菌種，置37 ℃搖床，以250 r/min 振搖培養(yǎng)菌液，至其OD600達(dá)到0.6～0.8 時加入IPTG，32 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體，離心并重懸后進(jìn)行超聲破碎，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析裂解后的上清液和沉淀中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況和可溶性。將檢測確定誘導(dǎo)表達(dá)的菌種按上述方法大量誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體按照Qiagen 公司的Ni-NTA Fast Start Kit 試劑盒說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，測定純化的蛋白質(zhì)含量，通過SDS-PAGE電泳檢測純化結(jié)果。

1.4 Balb/c小鼠免疫

將純化的hnRNPAB 蛋白與佐劑乳化后免疫6周齡Balb/c 雌性小鼠5 只（50 μg/只），背部皮下分點(diǎn)注射，其中弗氏完全佐劑用于首免，弗氏不完全佐劑用于此后的加強(qiáng)免疫，每次免疫間隔3周，共免疫4次，4 免后的第21 天斷尾采血。以純化的hnRNPAB 蛋白包被酶標(biāo)板（10 mg/L），分別利用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）和間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）來檢測免疫小鼠血清效價。選擇其中效價最高的小鼠，以2 倍免疫劑量且不加佐劑的抗原腹腔注射小鼠進(jìn)行超免，3～5 d 后無菌取小鼠脾臟用于細(xì)胞融合。

1.5 雜交瘤細(xì)胞制備及篩選

采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，SP2/0 細(xì)胞與超免后Balb/c 小鼠脾細(xì)胞按1?10 的比例混合后，加PEG-1500 融 合 劑1 mL，用RPMI-1640/HAT/10%FBS培養(yǎng)液將融合后的細(xì)胞分散接種于6塊96孔細(xì)胞板中，200 μL/孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后取雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測。按照iELISA方法，以純化的hnRNPAB 蛋白包被酶標(biāo)板（10 mg/L），檢測雜交瘤細(xì)胞上清，將結(jié)果為陽性的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)至24 孔細(xì)胞板擴(kuò)大培養(yǎng)3～4 d，選擇iELISA 復(fù)測強(qiáng)陽性孔進(jìn)行有限稀釋，一般2～3次，最后選出狀態(tài)良好的單克隆雜交瘤細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后離心收集細(xì)胞，用無血清細(xì)胞凍存液重懸后凍存于液氮中。

1.6 單克隆抗體制備

采用體內(nèi)腹水誘生法生產(chǎn)單克隆抗體。將滅菌液體石蠟腹腔注射經(jīng)產(chǎn)的Balb/c母鼠進(jìn)行致敏預(yù)處理，0.5 mL/只。收集3×106～5×106個單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，無菌PBS洗2遍，最后重懸于0.5 mL無菌PBS 中，腹腔接種已致敏至少14 d 的Balb/c 經(jīng)產(chǎn)母鼠。觀察7～14 d，待小鼠腹部明顯膨脹時無菌采集腹水，在5 000 r/min 條件下離心15 min，收集上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 單克隆抗體的Western blot鑒定

收集1×106個CEF，2 000 r/min 離心5 min，棄去上清，按照NE-PERTMNuclear and Cytoplasmis Extraction Reagents 試劑盒說明書提取CEF 核蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將提取的CEF 核蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，然后將凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉通過室溫封閉PVDF膜2 h，PBST 洗滌3 遍；加待檢的抗hnRNPAB 蛋白單克隆抗體，置4 ℃冰箱孵育過夜，PBST 充分振搖洗滌；加1%脫脂奶粉稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1 000），37 ℃孵育1 h，PBST 充分振搖洗滌。將NcmECL Ultra（NCM）顯影液A、B（1∶1）混合后滴在膜上孵育1～3 min，置凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

1.8 單克隆抗體的IFA染色及間接免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)（ICA）鑒定

分別用IFA 和ICA 對篩選的單克隆抗體與不同來源細(xì)胞蛋白質(zhì)的反應(yīng)性進(jìn)行檢測。取8～10 日齡SPF 雞胚，常規(guī)方法制備CEF，同時從液氮中取出凍存的HEK293T、BHK-21、Marc-145、MDBK 和PK-15 傳代細(xì)胞系進(jìn)行復(fù)蘇，分別接種到24 孔細(xì)胞板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去生長液，加預(yù)冷的甲醇/丙酮（1∶1）200 μL/孔，室溫固定15 min；棄 去 固 定 液，PBST 洗3 遍，加 入 待 檢 的hnRNPAB 單克隆抗體，置37 ℃溫箱孵育30 min；PBST 洗3 遍，加入FITC-羊抗鼠IgG 和HRP-羊抗鼠IgG（1∶500），37 ℃溫箱孵育30 min；PBST 洗3 遍后加PBST（200 μL/孔），熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞hnRNPAB蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

PCR 擴(kuò)增雞hnRNPAB部分基因片段，回收純化PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物并連接pMDTM19-T 載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對PCR 鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序分析，將符合預(yù)期的pMDTM19-ThnRNPAB質(zhì) 粒 用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙 酶 切，回 收hnRNPAB基因片段并連接轉(zhuǎn)化E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，可見1 317 bp大小的電泳條帶，符合預(yù)期（圖1）。測序分析結(jié)果也與預(yù)期完全相符，確認(rèn)成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30ahnRNPAB。

2.2 雞hnRNPAB蛋白的表達(dá)與純化

用IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)pET-30a-hnRNPAB轉(zhuǎn)化的E.coliBL21 陽性菌液8 h 后，收集并超聲破碎菌體，通過12% SDS-PAGE 電泳分析超聲上清液和沉淀中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果表明，雞hnRNPAB 蛋白以可溶性形式表達(dá)。上清液中可溶性表達(dá)的目的蛋白質(zhì)用樹脂Ni 進(jìn)行純化，收集洗脫液經(jīng)SDSPAGE 電泳分析，結(jié)果表明，純化后可獲得純度較高的hnRNPAB蛋白（圖2）。

圖2 雞hnRNPAB蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化蛋白的SDSPAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified chicken hnRNPAB protein

2.3 抗雞hnRNPAB蛋白的單克隆抗體制備

用純化后的hnRNPAB 重組表達(dá)蛋白4 次免疫Balb/c 小鼠，最后一次免疫第21 天，iELISA 檢測免疫小鼠血清效價。結(jié)果顯示，5 只小鼠均產(chǎn)生較高效價的抗體，其中2 號小鼠血清iELISA 效價最高，達(dá)到了1∶32 000（表1）。IFA 檢測結(jié)果也顯示，抗體熒光染色主要集中在CEF 細(xì)胞核內(nèi)（圖3）。故選擇2 號小鼠進(jìn)行超免，無菌摘取超免小鼠脾臟，與SP2/0 細(xì)胞（10∶1）混合后進(jìn)行細(xì)胞融合，9 d 后取雜交瘤細(xì)胞上清，利用iELISA 試驗(yàn)篩選效價最高的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行3 輪亞克隆后獲得1 株穩(wěn)定分泌抗雞hnRNPAB 蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，命名為5H5-H1。收集5H5-H1 雜交瘤細(xì)胞接種石蠟致敏的經(jīng)產(chǎn)母鼠，成功制備了抗雞hnRNPAB 蛋白的單克隆抗體腹水。

表1 免疫小鼠血清iELISA效價Tab.1 The iELISA titers of serum from immunized mice

圖3 hnRNPAB免疫小鼠血清與CEF反應(yīng)的IFA染色（100×）Fig.3 IFA staining of CEF cells using serum from hnRNPAB-immunized mice（100×）

2.4 抗雞hnRNPAB單克隆抗體的Western blot鑒定

提取CEF 核蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)膜封閉，然后依次孵育5H5-H1 單克隆抗體腹水（1∶4 000）和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶1 000），進(jìn)行Western blot 鑒定。結(jié)果顯示，單克隆抗體5H5-H1特異性識別雞hnRNPAB 蛋白，出現(xiàn)2條特異性反應(yīng)條帶，分別約為37 ku 和32 ku，與預(yù)期的雞hnRNPAB蛋白大小相符（圖4）。

圖4 Western blot分析5H5-H1單克隆抗體與雞hnRNPAB蛋白的反應(yīng)性Fig.4 Specific reaction of mAb 5H5-H1 to chicken hnRNPAB protein determined by Western blot analysis

2.5 hnRNPAB單克隆抗體與多種細(xì)胞蛋白質(zhì)反應(yīng)的IFA和ICA染色鑒定

待原代CEF 和傳代細(xì)胞HEK293T、BHK-21、Marc-145、MDBK、PK-15 長至稀疏單層，固定細(xì)胞，分別孵育5H5-H1 單克隆抗體腹水（1∶4 000），然后再分別孵育FITC-羊抗鼠IgG 和HRP-羊抗鼠IgG，鑒定5H5-H1 單克隆抗體與不同細(xì)胞的反應(yīng)性。IFA 和ICA 結(jié)果顯示，5H5-H1單克隆抗體與CEF 及5 種哺乳動物細(xì)胞均發(fā)生特異性反應(yīng)，并且這種特異性染色都是集中在細(xì)胞核（圖5）。

圖5 IFA和ICA染色檢測5H5-H1單克隆抗體與6種不同細(xì)胞的反應(yīng)性（100×）Fig.5 Reaction of mAb 5H5-H1 to six cell lines determined by IFA and ICA（100×）

3 結(jié)論與討論

哺乳動物的hnRNPAB 蛋白氨基酸同源性很高，基本都在92%以上，而雞的hnRNPAB 蛋白氨基酸序列與哺乳動物hnRNPAB 蛋白氨基酸序列同源性僅為83.3%～86.2%。但不同物種的hnRNPAB 蛋白仍具有一些共同結(jié)構(gòu)，如RNA 識別基序（RNA recognition motif，RRM）、Gly-Rich 基序和其他輔助區(qū)域[2]。筆者所在課題組長期致力于家禽腫瘤病的相關(guān)研究，前期研究發(fā)現(xiàn)，MDV 編碼的miR-M4-5p可靶向下調(diào)雞hnRNPAB基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖，與MDV 腫瘤發(fā)生有關(guān)[13]。為開展相關(guān)功能研究及信號通路分析，曾先后購買多種進(jìn)口或國產(chǎn)的商業(yè)化抗hnRNPAB 蛋白的抗體。然而，這些抗體與大部分哺乳動物細(xì)胞的hnRNPAB 蛋白反應(yīng)性良好，但均與禽類細(xì)胞hnRNPAB 蛋白不發(fā)生反應(yīng)，這很可能是由于禽類與哺乳動物hnRNPAB 蛋白氨基酸同源性不高所致。

為了制備能夠與禽源細(xì)胞hnRNPAB 蛋白反應(yīng)的單克隆抗體，本研究首先對雞hnRNPAB 蛋白與哺乳類hnRNPAB 蛋白氨基酸進(jìn)行了同源性序列比對，進(jìn)而對雞hnRNPAB 蛋白抗原性和疏水性進(jìn)行分析，去掉雞hnRNPAB蛋白N末端相對疏水且含有較少潛在抗原的區(qū)域，選取雞hnRNPAB 蛋白與哺乳類hnRNPAB 蛋白比較保守的抗原性區(qū)域，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，從CEF 中PCR 擴(kuò)增了雞hnRNPAB基因，成功構(gòu)建了pET-30a-hnRNPAB原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了可溶性表達(dá)的hnRNPAB 蛋白，以純化后的可溶性重組蛋白多次免疫Balb/c 小鼠后進(jìn)行細(xì)胞融合，多種方法篩選最終獲得了能夠穩(wěn)定分泌抗雞hnRNPAB蛋白的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株5H5-H1，并制備了相應(yīng)的單克隆抗體腹水。IFA 和Western blot鑒定結(jié)果表明，5H5-H1單克隆抗體與雞CEF細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的hnRNPAB 蛋白產(chǎn)生了很強(qiáng)的特異性反應(yīng)。進(jìn)一步的IFA 和ICA 分析表明，該單克隆抗體與其他來源于人、鼠、猴、牛和豬的多種哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)的hnRNPAB 蛋白反應(yīng)特異性均良好。綜上，本研究制備的hnRNPAB 單克隆抗體，不僅識別雞源細(xì)胞表達(dá)的相應(yīng)蛋白質(zhì)，而且可以與多種哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的hnRNPAB 蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，可同時滿足禽類和哺乳類hnRNPAB 蛋白相關(guān)的功能研究的需要，具有比較重要的科學(xué)價值。