劉昆燕，張秋實，張 凱，洪 豐，王全義，彭一晴，趙 影，段亞楠，周潤生，彭存旭*

(1.濟寧醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，山東 濟寧272000;2.廣東省第二人民醫(yī)院 婦科(婦幼健康研究所)；3.吉林大學第二醫(yī)院； 4.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院 a.中美肝病與免疫研究所； b.病理科；c.生殖醫(yī)學科;d.婦科)

宮頸癌(CC)是女性最常見的惡性腫瘤之一，在全球女性惡性腫瘤中其發(fā)病率及死亡率均位居第四[1]。隨著社會發(fā)展以及環(huán)境改變等因素，宮頸癌患者的發(fā)病更趨向于年輕化，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，在我國其發(fā)病率僅次于乳腺癌而位居第二[2]。因此構(gòu)建能夠模擬腫瘤患者特征的宮頸癌動物模型在宮頸癌發(fā)病機制研究和臨床治療方面意義重大。

患者來源的腫瘤組織動物移植模型(PDX)能最大程度保留原發(fā)腫瘤組織的腫瘤異質(zhì)性及原發(fā)腫瘤的腫瘤微環(huán)境[3]，被認為是最接近臨床患者的腫瘤動物模型。但目前國內(nèi)外移植瘤模型多選用免疫缺陷鼠，如裸鼠、SCID鼠等，導致傳統(tǒng)的PDX模型在腫瘤免疫治療、腫瘤發(fā)生的免疫相關(guān)機制研究中具有明顯局限性，嚴重影響疾病的精準治療與預(yù)后判斷，并且移植瘤的成瘤周期一般需要4-6個月。因此，如果本研究能克服傳統(tǒng)PDX模型這一缺陷，在正常免疫小鼠體內(nèi)成功構(gòu)建人宮頸癌PDX模型，對宮頸癌的免疫相關(guān)機制研究及精準治療意義重大。

microcarrier 6是一種新型3D微載體，呈多層孔樣條索狀，并相互交聯(lián)蜷曲，鏡下呈“迷宮”樣且有足夠空間的不規(guī)則結(jié)構(gòu)。該新型微載體由帶正電的有機復(fù)合多聚物構(gòu)成，孔徑大小不一，其顆粒大小和表面正電荷密度均可根據(jù)實驗需要調(diào)節(jié)，該微載體是不含雜質(zhì)、不易污染的有機化合物。更為重要的是該新型微載體同時還具有低免疫原性、生物兼融性和可代謝性的特征，非常有利于細胞生長。與此同時，其不規(guī)則結(jié)構(gòu)在建模早期可以起到屏障作用，在一定程度上緩解了體內(nèi)免疫細胞直接殺傷腫瘤細胞的作用。另外，用CXCL-12α和VEGF對微載體進行修飾后，可誘導血管長入，促進血管形成，為腫瘤的生長提供豐富的營養(yǎng)。

本研究將從手術(shù)切除的宮頸癌標本組織中分離提取的癌細胞，與mocrocarrier 6共同孵育24 h，將(宮頸癌細胞-微載體)復(fù)合體經(jīng)皮下接種到小鼠體內(nèi)，成功建立了新型患者來源的正常免疫小鼠宮頸癌移植瘤模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1腫瘤標本 5例新鮮宮頸癌腫瘤組織均取自濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科，所有標本的獲取均經(jīng)患者本人及家屬同意，簽署知情同意書。詳細信息見表1，人體標本實驗通過了濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

表1 宮頸癌相關(guān)PDX模型的病例信息

1.1.2實驗動物 C57BL/6雌性90只小鼠，6-8周齡， 22-25 g/只，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[許可證號 SCXK(魯) 20140007]，飼養(yǎng)在濟寧醫(yī)學院SPF級實驗動物中心，飼養(yǎng)動物實驗過程均嚴格按照濟寧醫(yī)學院動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定進行。

1.1.3主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、膠原酶II、胎牛血清、紅細胞裂解液、青鏈霉素購于Gibco公司，主要抗體 P16、CK5/6單克隆抗體購于Abcam公司。microcarrier 6為美國ELYON BIOTECHNOLOGIES LLC公司提供。

1.2 方法

1.2.1原代宮頸癌細胞的獲取 將手術(shù)切除下的新鮮腫瘤組織標本立即放入含10%濃度青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置 冰盒內(nèi)轉(zhuǎn)運到實驗室，在超凈工作臺內(nèi)，取出標本，去除壞死組織，用含10%濃度青鏈霉素的生理鹽水反復(fù)沖洗3次直至清潔，再加入50%濃度青鏈霉素完全浸泡10 min直至潔凈無菌，將標本置于培養(yǎng)皿中用眼科剪剪至1 mm3大小，加入以DMEM培養(yǎng)基為溶劑配制的0.05%膠原酶Ⅱ溶液， 37℃消化1 h，加入適量DMEM反復(fù)吹打，70 μm濾網(wǎng)過濾后以1200轉(zhuǎn)/分，離心8 min，棄上清，以紅細胞裂解液重懸細胞，置于37℃ 10 min，即可得到人原代宮頸癌細胞。

1.2.2人原代宮頸癌細胞與microcarrier 6共培養(yǎng) 將微載體microcarrier 6 置于75%酒精浸泡24 h，用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h；用趨化因子-12α(CXCL-12α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對微載體microcarrier 6 進行修飾，濃度均為100 ng/mL，孵育時間為3 h。取指數(shù)生長期原代宮頸癌細胞，用臺盼藍染色實驗計數(shù)活細胞數(shù)>95%，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整宮頸癌細胞濃度為2×107/mL，與修飾好的微載體microcarrier 6懸液按照體積比為1∶1混合后，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育24 h。鏡下觀察，腫瘤細胞在微載體microcarrier 6 內(nèi)達到飽和狀態(tài)。

1.2.3正常免疫小鼠宮頸癌PDX模型的建立 5例標本共用90只C57BL/6雌鼠，每例15只。每次實驗分為3組，細胞對照組、微載體對照組和實驗組，每組5只小鼠。細胞對照組小鼠單純接種含2×107個/mL宮頸癌細胞懸液150 μl/只；空載體對照組小鼠單純接種含30 μg 空微載體懸液150 μl/只；實驗組小鼠接種含2×107個/mL宮頸癌細胞、30 μg微載體的細胞-微載體混合物懸液150 μl/只。異氟烷麻醉小鼠，按分組要求依次對每組小鼠右腋下皮下進行接種移植。

1.2.4小鼠模型的觀察指標及移植瘤生長評估 將皮下接種后的小鼠按分組隔離飼養(yǎng)，每日對各組小鼠分別稱量、記錄體質(zhì)量，觀察每組小鼠食欲及每組小鼠的活動度。記錄小鼠皮下移植瘤的成瘤時間、移植瘤的體積。自移植瘤長出后，每天測量腫瘤的最長瘤徑(a)和最短瘤徑(b)，依照腫瘤體積公式V=1/2×a×b2，計算腫瘤的體積并繪制出腫瘤生長曲線。

1.2.5小鼠模型病理學檢查 建模第16天時，統(tǒng)一異氟烷麻醉后處死宮頸癌移植瘤小鼠，并完整分離移植瘤，將其稱重、測量移植瘤長徑，觀察其質(zhì)地、形態(tài)、局部浸潤程度及壞死程度。固定移植瘤組織(10%中性甲醛)，包埋切片(石蠟)，常規(guī)病理染色(HE)；按試劑盒說明，進行免疫組化染色(EnVision二步法)，檢測P16、CK5/6在各組移植瘤中的表達情況。判定染色結(jié)果：P16陽性的顆粒定位于腫瘤細胞核和(或)細胞漿中，均出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒；CK5/6陽性的顆粒定位于細胞漿中，顯棕黃色。于高倍鏡下隨機選取95個視野，統(tǒng)計陽性百分率=陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)。陽性細胞百分率<10%為陰性(-)，陽性細胞百分率≥10%為陽性(+)。

2 結(jié)果

2.1 基于微載體microcarrier 6構(gòu)建人原代宮頸癌細胞體外三維培養(yǎng)體系

光鏡下觀察剛分離出的原代宮頸癌細胞幾乎全為單個細胞，呈球形，其折光性較強(圖1A)；微載體microcarrier 6在光鏡下觀察為不規(guī)則長梭狀或團狀，質(zhì)地疏松，其內(nèi)部含有大量孔隙(圖1B)；被修飾過的microcarrier 6與患者來源的原代宮頸癌細胞共培養(yǎng)24 h后，光鏡下可見宮頸癌細胞很好的貼附在微載體microcarrier 6上，直至達到飽和狀態(tài)，微載體外周可見不規(guī)則細胞團(圖1C)。

圖1 人原代宮頸癌細胞三維培養(yǎng)體系形態(tài)學特征

2.2 基于microcarrier 6在正常免疫小鼠體內(nèi)建立宮頸癌PDX模型

整個實驗全過程中，各組小鼠體質(zhì)量及毛發(fā)均沒有明顯變化，只有實驗組小鼠在1周后表現(xiàn)出活動度減少與食欲稍減退，各組小鼠均無死亡。細胞對照組：自實驗開始至實驗結(jié)束全過程無小鼠長出腫瘤?？蛰d體對照組：共有4只小鼠在右側(cè)腋下發(fā)現(xiàn)0.2 cm左右的結(jié)節(jié)，質(zhì)地柔軟，剖開后可見豆渣樣載體物質(zhì)流出，未成瘤，其余的空載體對照組小鼠均未長出腫瘤。而在接種移植后8-10天實驗組小鼠即有皮下包塊可觸及，25只實驗組小鼠共有22只有皮下包塊可觸及，得出總的成瘤率為88%(表2)。移植瘤生長迅速，移植瘤的生長高峰期則在移植后11-15天，高峰期移植瘤體積迅速增大，在移植后12天左右，肉眼即可觀察到皮下的隆起包塊，16天腫瘤直徑可達到0.8-1.2 cm(圖2)。腫瘤部分剖開后，發(fā)現(xiàn)移植瘤組織較易與周圍正常組織分離開，移植瘤形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)為橢圓形，可見移植瘤周圍血供較豐富，切開移植瘤組織后可見實質(zhì)部分顏色以灰白色為主。

表2 成瘤時間和成瘤率

圖2 microcarrier 6 宮頸癌建模組

2.3 病理學檢查

2.3.1HE染色 實驗組小鼠形成的移植瘤組織與患者來源的人原代宮頸癌組織非常相似，在光鏡下，見大量大小不一的異型性明顯的雜亂排列的核大且深染的細胞，向毗鄰的肌肉及脂肪組織呈現(xiàn)出浸潤生長；且移植瘤也伴有中央?yún)^(qū)壞死；接種16 天時有少量殘余microcarrier 6被新生細胞包繞并形成肉芽腫；實驗組宮頸癌移植瘤組織其邊緣有新生毛細血管且血管異常豐富(圖3)。

圖3 小鼠人源性宮頸癌細胞移植瘤接種成功腫瘤組織石蠟切片

2.3.2免疫組織化學方法 結(jié)果顯示，P16、CK5/6均為陽性表達(圖4)，因此也證實上述異型細胞為人源性宮頸癌細胞。

圖4 免疫組化示細胞-微載體復(fù)合物小鼠宮頸癌移植瘤為人源性宮頸癌細胞 (×200)

3 討論

宮頸癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，占全球女性惡性腫瘤中發(fā)病率及死亡率的第四位，且宮頸癌的發(fā)病趨向于年輕化，呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，在我國其發(fā)病率僅次于乳腺癌而位居第二，對女性健康構(gòu)成嚴重威脅。目前其發(fā)病機制尚不完全清楚，建立合適的宮頸癌動物模型為研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制、為抗腫瘤藥物的篩選同時為藥物的開發(fā)[4]提供了全新的平臺。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)單純以人原代宮頸癌細胞接種于正常免疫鼠體內(nèi)，即便增加3倍細胞數(shù)量，也無法成瘤，考慮為異種移植排異反應(yīng)所致。3D微載體是一種支持細胞生長的支撐結(jié)構(gòu)，彌補了上述缺陷，由帶正電的多聚有機復(fù)合物構(gòu)成，質(zhì)地疏松，具有多層孔隙樣結(jié)構(gòu)，有助于腫瘤細胞的快速附著及擴增。并且可在較短時間內(nèi)起到屏障與保護作用，阻擋機體的免疫細胞對微載體內(nèi)的癌細胞直接殺傷作用，并且經(jīng)過VEGF和CXCL-12α修飾后，3D微載體能夠誘導移植瘤血管生長，為腫瘤的快速形成及快速增殖提供足夠的營養(yǎng)。以上條件為腫瘤細胞的穩(wěn)定生長提供良好的環(huán)境基礎(chǔ)。3D微載體腫瘤細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠高度模擬腫瘤生長的微環(huán)境，目前已成為研究的熱點[5-8]。

轉(zhuǎn)化醫(yī)學所需的宮頸癌模型需滿足能夠準確地反映宮頸癌生物特性，充分地模擬人類的腫瘤微環(huán)境，且易于操作，重復(fù)性高。移植瘤PDX模型為目前最接近于臨床并且應(yīng)用最廣泛的動物模型，但是，目前腫瘤模型主要利用免疫缺陷鼠例如裸鼠、SCID鼠等。雖然特殊的免疫缺陷鼠成瘤率較正常免疫鼠高，但難以真實反應(yīng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與機體的免疫系統(tǒng)之間內(nèi)在的相互作用關(guān)系，為更準確地還原患者腫瘤組織學、分子生物學特點及腫瘤微環(huán)境，彌補因免疫缺陷小鼠缺乏免疫細胞，而不能準確模擬機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫攻擊等重要缺點，本研究基于microcarrier 6微載體技術(shù)已成功創(chuàng)建了10到15天快速成瘤的正常免疫小鼠宮頸癌PDXs模型[9]。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于microcarrier 6微載體復(fù)合患者來源的原代宮頸癌細胞建立正常免疫鼠宮頸癌移植瘤模型的成瘤率達88%。該模型的特點是腫瘤成瘤較快，重復(fù)性好，操作相對簡便。實驗顯示，移植瘤在8-10天就可長出，11-15天為其生長高峰期。病理學HE染色提示大量異型核細胞的浸潤生長，可侵及脂肪、肌肉、神經(jīng)等組織，腫瘤中央因瘤細胞生長過速，血供不足可見壞死灶。在腫瘤周邊還可見到毛細血管分布。這些均符合人腫瘤生長特點。免疫組化檢測顯示，P16、CK5/6陽性表達[10]，進一步證實異型細胞來源于人宮頸癌細胞。

綜上，本實驗基于microcarrier 6-3D微載體將免疫功能正常的小鼠成功構(gòu)建出人原代移植瘤動物模型，該動物模型保留了小鼠正常的免疫功能及人源性腫瘤的特征，為臨床轉(zhuǎn)化提供了新途徑，為進一步研究宮頸癌形成過程中免疫逃逸及免疫調(diào)節(jié)機制提供了新思路。