陳子軒，張 楠，胡 群，全柯吉，秦 濤，陳素娟*，彭大新*，劉秀梵

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

H9N2亞型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)于1966年首次在美國(guó)威斯康星州被發(fā)現(xiàn)。我國(guó)于1992年在廣東首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)H9N2亞型AIV，并隨之在南方各省迅速傳播。目前是中國(guó)流行最廣泛的低致病性AIV，可和其他病原發(fā)生混合感染造成死亡率上升，引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，它可為新出現(xiàn)的重配病毒如H7N9亞型AIV等提供供體基因[1]，同時(shí)報(bào)道顯示有部分家禽養(yǎng)殖從業(yè)者血清呈H9亞型AIV抗體陽(yáng)性，因此病毒的傳播也存在很大的公共衛(wèi)生隱患[2]。

為防控我國(guó)H9N2亞型禽流感，以A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)為代表的全病毒滅活疫苗在家禽養(yǎng)殖中廣泛使用[3]。目前，主要流行的毒株屬于h9.4.2.5譜系，HA基因的遺傳進(jìn)化分析表明，當(dāng)前流行株與疫苗株的核苷酸遺傳距離較遠(yuǎn)[4-5]?；诮徊嫜种坪徒徊嫖⒘恐泻驮囼?yàn)的抗原圖譜分析研究中，流行株和疫苗株可形成不同的抗原分群，疫苗株的免疫血清難以有效中和抗原差異大的流行株，疫苗株與流行株不匹配，從而導(dǎo)致了免疫失敗[6]。在疫苗的免疫壓力下，AIV更易發(fā)生抗原漂移[7]。因此，探究H9N2亞型 AIV抗原變異的分子基礎(chǔ)是解析當(dāng)前流行株抗原性改變的關(guān)鍵。

目前，雖已報(bào)道了H9N2 AIV抗原位點(diǎn)鑒定的相關(guān)研究，并將HA蛋白頭部的抗原區(qū)域分為兩個(gè)獨(dú)立表位[8]。但前人鑒定的與抗原性相關(guān)的位點(diǎn)在自然流行株中很多都保守，不足以解釋我國(guó)當(dāng)前H9N2亞型AIV流行株抗原性改變的原因[9]。因此，本研究利用研制的單抗對(duì)抗原位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定，并對(duì)本實(shí)驗(yàn)室2017—2019年分離的H9N2亞型AIV進(jìn)行了抗原譜分析，分析相關(guān)抗原位點(diǎn)的變異規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 病毒和單抗

H9N2亞型AIV A/chicken/Shanghai/F/1998(F98)毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存。其相應(yīng)單抗2E4[10]和2D6[11]為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 血凝抑制試驗(yàn)和中和試驗(yàn)

血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutinin inhibition，HI)按照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，OIE)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。微中和試驗(yàn)按照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行操作，利用Reed-Muench法計(jì)算病毒在CEF細(xì)胞上的TCID50，再將2 000 TCID50·mL-1的病毒工作液與等體積的兩倍倍比稀釋的抗體進(jìn)行孵育，其中每種稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37 ℃孵育1.5 h后，按照100 μL·孔-1接種于長(zhǎng)有CEF細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中，37 ℃吸附1 h后，再換液為含有2 μg·mL-1TPCK胰酶的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)，72 h后通過(guò)測(cè)定上清HA效價(jià)判定結(jié)果。HA效價(jià)為陰性的抗體最高稀釋度為該抗體的中和效價(jià)。

1.3 單抗逃逸突變株的篩選和抗原位點(diǎn)的鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]并做適當(dāng)改進(jìn)開(kāi)展逃逸突變株篩選，將0.1 mL 的106TCID50的F98病毒與0.5 mL單克隆抗體進(jìn)行混合，室溫孵育1 h后，將抗原抗體混合物接種于9～11日齡的SPF雞胚(n=3)，72 h后收取具有HA效價(jià)的尿囊液，所收獲病毒尿囊液通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行進(jìn)一步篩選。將稀釋至10-3的陽(yáng)性尿囊液0.1 mL與單抗0.5 mL混合，室溫孵育1 h后，將抗原抗體混合物再稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4稀釋度，200 μL·胚-1接種雞胚(n=3)，72 h后收取最高稀釋度的有HA效價(jià)的尿囊液。再按上述有限稀釋法重復(fù)篩選1次。

提取純化后病毒的RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增HA基因片段，電泳切膠測(cè)序。使用MegAlign軟件比對(duì)逃逸株和母本毒株F98的氨基酸序列差異。

1.4 抗原譜分析

使用MEGAX軟件中的MUSCLE將實(shí)驗(yàn)室2017—2019年度分離的H9N2亞型AIVHA基因進(jìn)行序列比對(duì)，繪制Neighbor-joining遺傳進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap設(shè)置為1 000進(jìn)行檢驗(yàn)。使用iTOL對(duì)遺傳進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化[15]。根據(jù)遺傳進(jìn)化樹(shù)選擇代表性H9N2亞型AIV毒株，通過(guò)HI效價(jià)確定單抗與病毒的反應(yīng)性。

1.5 HA基因序列比對(duì)

在全球流感數(shù)據(jù)共享平臺(tái)(Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID，https://platform.gisaid.org/epi3/frontend#2a8325)中下載從1996—2021年度(截至6月5日)中國(guó)地區(qū)禽類中分離的H9N2 AIVHA基因序列，使用Phylosuite軟件中的MATFF進(jìn)行序列比對(duì)，統(tǒng)計(jì)145和153位點(diǎn)的氨基酸變異情況。

1.6 位點(diǎn)模擬分析

以蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB, https:/www.wwpdb.org/)中的H9N2亞型病毒HA1分子晶體結(jié)構(gòu)(編號(hào):1 JSD.1.A)為模板，在網(wǎng)站SWISS-MODLE(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)將F98 HA1蛋白序列用Alignment Mode方法建模。生成的HA1分子用pymol軟件進(jìn)一步分析和修飾。

2 結(jié) 果

2.1 單抗2E4和2D6的生物學(xué)特性

2E4和2D6針對(duì)母本毒株F98的HI效價(jià)均為213；微量中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，2E4和2D6針對(duì)F98的中和效價(jià)分別為1∶10 240和1∶2 560(表1)。

表1 單抗的生物學(xué)特性

2.2 單抗逃逸突變株的篩選和抗原位點(diǎn)的鑒定

在單抗2E4和2D6作用下收獲的陽(yáng)性尿囊液，再在雞胚中經(jīng)過(guò)兩輪有限稀釋法的純化后獲得了兩株突變株(m2E4-1和m2D6-1)，對(duì)應(yīng)篩選抗體的HI效價(jià)均≤22(表2)。進(jìn)一步對(duì)突變株m2E4-1和m2D6-1的HA基因與母本毒株F98的HA基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)m2E4-1在434位核苷酸位點(diǎn)發(fā)生G→A的突變，導(dǎo)致145位氨基酸位點(diǎn)產(chǎn)生了S→N的替換，由此形成了145—147位NGT模式的潛在糖基化位點(diǎn)。m2D6-1在459位發(fā)生A→T的突變，相應(yīng)的出現(xiàn)了D153E的氨基酸替換(表3)。

表2 逃逸株與單克隆抗體交叉血凝抑制結(jié)果

表3 抗原位點(diǎn)鑒定結(jié)果

2.3 抗原譜分析

2017—2019年度分離的H9N2亞型AIVHA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示分離株均屬于h9.4.2.5譜系(圖1)。

●.參考株；△.抗原譜分析毒株

在遺傳進(jìn)化樹(shù)上，將毒株劃分為兩個(gè)大分支Group 1(32/109)和Group 2(77/109)，兩個(gè)Group 的組間平均遺傳距離為7.22%(圖1)。

從Group 1挑選的5株代表株和Group 2挑選的16株代表株測(cè)定與單抗的反應(yīng)性。Group 1的毒株與單抗2E4的HI效價(jià)均≥27，與單抗2D6的HI效價(jià)均≥210；Group 2中所有毒株與單抗2E4的HI效價(jià)均在20～22，A/chicken/Jiangyin/JY110712/2018和A/chicken/Jiangyin/JY010220/2019毒株與單抗2D6的HI效價(jià)分別為25和24以外，其余14株毒株HI效價(jià)均為20(表4)。

比對(duì)用于抗原譜分析毒株的HA基因的145位和153位氨基酸發(fā)現(xiàn)，Group 1毒株的HA蛋白在145位和153位均分別為S(5/5)和D(5/5)，Group 2毒株HA蛋白145位均突變?yōu)镈(16/16)，153位突變?yōu)镚(15/16)。但A/chicken/Jiangyin/JY110712/2018與單抗2D6的HI效價(jià)為25，但是其153位卻為D(表4)。

表4 單抗2E4、2D6抗原譜分析結(jié)果和145位、153位氨基酸位點(diǎn)的突變情況

2.4 禽源H9N2亞型AIV相應(yīng)位點(diǎn)自然突變率分析

自GISAID中下載的禽源H9N2毒株AIV HA蛋白序列，對(duì)145位分析后發(fā)現(xiàn)，在1996—2009年和2010—2014年分離株中，含145S的分離株都占57%，在2015—2021年分離株中，含145D的分離株占68%。在1996—2009年和2010—2014年分離株中，含145N的分離株分別占6%和10%，2015—2021年無(wú)含145N的分離株。對(duì)153位分析后發(fā)現(xiàn)，含153D的分離株在1996—2009年和2010—2014年中分別占57%和53%，含153G的分離株在2015—2021年占66%。雞源和鴨源毒株變化趨勢(shì)一致(圖2)。

圖2 禽源H9N2 亞型AIV HA蛋白145和153位氨基酸位點(diǎn)的自然突變率

2.5 抗原位點(diǎn)結(jié)構(gòu)模擬分析

從HA1分子的模擬構(gòu)象可以看出，145和153位均位于分子的頭部的受體結(jié)合區(qū)域(receptor binding site，RBS)附近(圖3)。與145S相比，145 N和145D的殘基側(cè)鏈更長(zhǎng)，突出HA1分子表面。與153D相比，153E和153G的殘基側(cè)鏈更長(zhǎng)，突出HA1分子表面。

A.F98 HA1(145S 153D)分子模擬構(gòu)象；B.F98 HA1(145N 153D)分子模擬構(gòu)象；C.F98 HA1(145S 153E)分子模擬構(gòu)象；D.F98 HA1(145D 153G)分子模擬構(gòu)象。黃色：Y109、S148、W161、T163、N191、P194、A198、L202、Q234和G236為RBS區(qū)域

3 討 論

H9亞型AIV是我國(guó)感染最廣泛的低致病性AIV，目前的H9亞型毒株在各種選擇壓力下已經(jīng)發(fā)生了變異，導(dǎo)致抗原性出現(xiàn)了改變。從本實(shí)驗(yàn)室前期制備的H9N2亞型AIV HA蛋白單抗中選取了兩株HI效價(jià)高的單抗，經(jīng)過(guò)鑒定也有很高的微中和效價(jià)。將F98毒株與單抗孵育后在SPF雞胚中傳代，篩選到逃逸突變株m2E4-1和m2D6-1，其HA蛋白分別擁有S145 N和D153E的突變。Kaverin等[16]將鑒定的抗原位點(diǎn)劃分成了Site Ⅰ、Site Ⅱ和Overlapping 3個(gè)區(qū)域，其中145位于Site Ⅰ和Site Ⅱ重疊的Overlapping區(qū)域，153位于Site Ⅱ區(qū)域。單抗2E4對(duì)m2D6-1的HI效價(jià)為29，單抗2D6對(duì)m2E4-1的HI效價(jià)為210，和母本毒株相比略有降低，證明這兩個(gè)抗原位點(diǎn)相互影響較小，與Kaverin等[16]的結(jié)果相一致。

S145N的突變使得HA蛋白在145—147位產(chǎn)生了1個(gè)NGT氨基酸模式的潛在糖基化位點(diǎn)。研究表明，在毒株的HA分子對(duì)唾液酸受體處于高親和力時(shí)，HA分子頭部RBS附近的糖基化位點(diǎn)會(huì)影響病毒對(duì)細(xì)胞的入侵，從而產(chǎn)生對(duì)疫苗免疫的逃逸[17]。朱寅彪等[13]也利用一株HI中和效價(jià)很高(分別為214和104.3)的HA單抗篩選到S145N的單抗逃逸突變體，另外他發(fā)現(xiàn)HA基因?yàn)?45T的毒株也可以發(fā)生逃逸，而我們的抗原譜分析中發(fā)現(xiàn)擁有145D突變的毒株也會(huì)引起單抗逃逸，因此糖基化不是該位點(diǎn)逃逸單抗的唯一機(jī)制。并且145和153兩個(gè)位點(diǎn)均位于HA1分子的頭部RBS附近，推測(cè)單抗的中和效果來(lái)源于識(shí)別了RBS附近的表位，從而屏蔽RBS與唾液酸受體的結(jié)合[18]。并且相對(duì)于F98毒株145S和153D的結(jié)構(gòu)，突變后的氨基酸因?yàn)橄啾扔谠Ｊ桨被醾?cè)鏈更長(zhǎng)，更突出于HA1分子的表面，可能會(huì)直接影響到與抗體的結(jié)合能力[19]。

申松瑋等[20]將2017—2018年度分離的H9N2亞型AIVHA基因劃分為兩個(gè)組，其組間遺傳距離為6.71%。筆者劃分的Group 1和Group 2的組間遺傳距離為7.22%，與其基本一致。申松瑋等[20]對(duì)兩個(gè)組代表株的交叉HI結(jié)果進(jìn)行R值評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)組內(nèi)抗原性相近，但兩組間的抗原性不同，可分為兩個(gè)抗原型。本研究HI抗原譜分析顯示示，Group 1內(nèi)毒株與單抗的反應(yīng)性好，而Group 2內(nèi)毒株與單抗的反應(yīng)性差，單抗2E4反應(yīng)譜與基因分型一致，表明單抗2E4可用于當(dāng)前H9N2亞型AIV的抗原分型。在145位，Group 1代表株均為S，Group 2代表株均為D；在153位，Group 1代表株均為D，Group 2代表株除1株外其余均為G?？梢?jiàn)S145D的替換在兩個(gè)Group 中的符合性更高，145位更適合作為鑒定病毒抗原變異的分子靶標(biāo)。

朱寅彪等[13]發(fā)現(xiàn)含145N的病毒在雞源和鵪鶉源的自然分離率為10%左右(截至2015年)，這與作者分析的2014年之前145N占比相一致。但1996—2021年間禽源H9N2亞型AIV分析顯示近年來(lái)含145D和153G的突變株占比分別為68%和66%，說(shuō)明Group 2抗原型已成為流行的主要抗原型。因此利用單抗2E4對(duì)流行株進(jìn)行抗原分型，加強(qiáng)對(duì)145位氨基酸位點(diǎn)的檢測(cè)尤為重要。

4 結(jié) 論

單抗2E4與2D6分別識(shí)別H9N2亞型禽流感病毒HA頭部的145位和153位抗原位點(diǎn)。我國(guó)流行株中存在兩種抗原群，單抗2E4可以對(duì)兩種抗原群進(jìn)行區(qū)分，抗原位點(diǎn)145位是鑒別Group 1和Group 2抗原群差異的分子靶標(biāo)之一，為H9N2亞型禽流感的防控提供了疫苗選擇依據(jù)。