張文燕，王亞文，馮亞文，滕召劍，李潭清，董 煒，劉 濤，宋勤葉*，任玉紅*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院&河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，保定 071000；2.河北省獸藥監(jiān)察所，石家莊 050051；3.順平縣動物疫病預(yù)防與控制中心，保定 072250；4.瑞普生物藥業(yè)有限公司，保定 071000)

非洲豬瘟(Africa swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(Africa swine fever virus, ASFV)引起豬和野豬的一種高度接觸傳染性的烈性傳染病，以全身組織器官廣泛出血、脾急性腫大呈黑色為主要特征，病死率高達100%[1-2]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。2018年8月我國遼寧沈陽市首次發(fā)生ASF疫情，隨后在全國范圍內(nèi)迅速傳播，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成極其巨大的經(jīng)濟損失[3]。

ASFV是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的成員，也是目前發(fā)現(xiàn)的可以在軟蜱體內(nèi)復(fù)制的唯一蟲媒DNA病毒[4]。ASFV為雙股DNA病毒，病毒粒子外周直徑約200 nm，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由含病毒基因組DNA的擬核、內(nèi)核芯殼(基質(zhì)層)、內(nèi)囊膜、二十面體對稱的衣殼和外囊膜5部分組成[5]。病毒基因組170～193 kb，有151～167個開放閱讀框(ORFs)，編碼150～200種蛋白，其中p72與p30、p54、p12等蛋白抗原性好，可用于ASF的血清學(xué)診斷[6-7]。p72蛋白(73.2 ku)由B646L基因編碼，在病毒感染晚期表達，是ASFV衣殼的主要組成部分，占病毒粒子總質(zhì)量的33%，并且該蛋白在不同ASFV毒株之間高度保守[6]。因此，p72是ASFV病原學(xué)和血清學(xué)診斷以及流行毒株遺傳進化分析的首選靶標(biāo)。

目前尚無有效的商品化疫苗和藥物用于ASF的預(yù)防與治療，加強檢疫、早期發(fā)現(xiàn)和快速確診是當(dāng)前防控ASF的主要措施[8-11]。本研究體外表達了全長和截短的p72蛋白，分析比較了兩者的免疫原性和反應(yīng)原性，旨在為建立敏感、特異的ASFV抗體檢測方法提供必要實驗材料。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株與實驗動物

pET-28a(+)原核表達質(zhì)粒、E.coliDH5α和Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實驗室保存；SPF級BALB/c小鼠，購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑和血清

T4 DNA連接酶，購自美國Promega公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；HRP標(biāo)記的(HRP-)山羊抗兔IgG(H+L)、抗His標(biāo)簽的兔多克隆抗體及Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；HRP-標(biāo)記的羊抗豬IgG，購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoR Ⅰ，購自寶生物工程(大連)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和IPTG，購自美國Sigma公司；ASFV-ELISA抗體檢測試劑盒為法國愛迪威(ID.Vet)產(chǎn)品；ASFV基因II型毒株抗體陽性、陰性豬血清，由河北驥才中科基因技術(shù)有限公司提供；豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬偽狂犬病病毒(PRV)抗體陽性血清，為IDEXX公司產(chǎn)品；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗體陽性血清，由本實驗室制備并保存。

1.3 基因序列合成與引物設(shè)計

ASFV中國分離株P(guān)ig/HLJ/2018(GenBank ID: MK333180)的p72基因序列及其重組質(zhì)粒(T-p72)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成與構(gòu)建。利用Primer 5.0軟件設(shè)計2對帶有酶切位點EcoR Ⅰ和XhoⅠ的引物，分別用于擴增p72全基因和截短基因(p72s)(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR擴增全長p72和截短p72(p72s)基因用引物

1.4 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定

以T-p72重組質(zhì)粒為模板，分別用引物eU-p72-eL-p72和eU-p72s-eL-p72s，經(jīng)PCR擴增p72基因和截短基因p72s。PCR反應(yīng)體系(50 μL)如下：2×Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，按照瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒說明，回收PCR產(chǎn)物，用于重組表達質(zhì)粒構(gòu)建。

用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切p72、p72s基因及原核表達載體pET-28a(+)2 h；回收目的DNA片段和質(zhì)粒；將目的基因分別插入到pET-28a(+)載體中，得到重組質(zhì)粒pET-28a-p72和pET-28a-p72s，進一步經(jīng)PCR和酶切(EcoR Ⅰ和XhoⅠ)鑒定后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.5 重組蛋白的表達與純化

將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒 pET-28a-p72 和pET-28a-p72s分別轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性單菌落，接種于3 mL Kana+/LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃活化過夜，按照1∶100的比例接種到8 mL Kan+/LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600 nm=0.6～0.8)，加入終濃度為0.1、0.25或0.5 mmol·L-1的IPTG，在18、20、24、26、28、30、32或35 ℃下，誘導(dǎo)表達3、4、5或6 h。離心收集菌體，SDS-PAGE分析，確定蛋白表達的最佳條件。

超聲裂解收集誘導(dǎo)表達的菌體，4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE，檢測重組蛋白的表達形式。隨后，按照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒推薦的步驟純化目的蛋白。純化蛋白經(jīng)濃度遞減(4.5、3.5、2.5、1.5、0.5和0 mol·L-1)的尿素溶液透析復(fù)性(每個濃度的尿素溶液內(nèi)透析8～12 h)。透析結(jié)束后，用PEG20000濃縮蛋白液，4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min，收取上清，通過SDS-PAGE檢測與濃度測定后，分裝，凍存于-80 ℃，備用。

1.6 重組蛋白的鑒定

1.6.1 Western blot 用蛋白半干轉(zhuǎn)印儀將表達的p72或p72s蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，將膜放入封閉液(含5%脫脂奶粉、0.05% Tween-20的Tris-HCl緩沖液，pH 7.4)中于4 ℃下孵育過夜；棄去封閉液，洗膜；加入兔抗His標(biāo)簽多克隆抗體(1∶3 000稀釋)，室溫下反應(yīng)1.5 h；洗膜，加入 HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶4 000倍稀釋)，室溫下反應(yīng)1 h；洗膜，將膜置于DAB顯色液中顯色3 min。

1.6.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定與蛋白抗原表位分析 分別用胰蛋白酶(trypsin)和糜蛋白酶(chymotrypsin)酶解處理純化的重組蛋白(酶與底物質(zhì)量比為1∶40)；取處理好的樣品通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)分析，獲得質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)；用MaxQuant(Version 1.6.2.10)軟件分析，數(shù)據(jù)庫檢索與數(shù)據(jù)匹配，分析蛋白序列。隨后將蛋白的氨基酸序列提交到網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線預(yù)測分析表達蛋白的抗原表位。

1.7 蛋白的免疫原性與反應(yīng)原性檢測

1.7.1 動物接種與特異性抗體檢測 分別取50 μg的重組p72和p72s蛋白與等量弗氏佐劑乳化后，經(jīng)背部皮下注射BALB/c小鼠，首次免疫時重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，第2、3次免疫時與等體積的弗氏不完全佐劑乳化，共免疫3次，每次免疫間隔2周，每次每只小鼠接種50 μg重組蛋白。第3次免疫后10 d，應(yīng)用ELISA檢測并比較兩組小鼠的血清特異性抗體效價。ELISA的主要步驟：分別用0.1 μg的p72和p72s蛋白包被酶標(biāo)板反應(yīng)孔，37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜；洗滌，加入封閉液于37 ℃封閉1 h后，加入倍比稀釋的p72或p72s蛋白免疫小鼠血清，37 ℃孵育1 h，同時設(shè)立未免疫小鼠血清作為陰性對照；洗滌后加入100 μL HRP-標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育45 min；洗滌，加入100 μL TMB底物顯色液，避光反應(yīng)15 min，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定OD450 nm值。當(dāng)樣本OD值≥0.3時，判為p72或p72s特異性抗體陽性。

為了分析基于全長和截短p72蛋白ELISA檢測結(jié)果的一致性，分別用p72-ELISA和p72s-ELISA檢測108份豬血清，同時設(shè)立CSFV、PRRSV、PRV、PCV2等抗體陽性血清對照。應(yīng)用SPSS21.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對p72-ELISA與p72s-ELISA結(jié)果進行kappa一致性檢驗。整個檢測過程嚴(yán)格按照生物安全管理制度執(zhí)行。

1.7.3 p72和p72s蛋白與豬血清特異性抗體反應(yīng)的Western blot檢測 通過Western blot檢測10份ASFV抗體陽性、2份ASFV抗體陰性豬血清，同時設(shè)立CSFV、PRRSV、PRV和PCV2抗體陽性血清對照。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果，分析p72和p72s蛋白與特異性抗體反應(yīng)的敏感性。Western blot檢測時，將豬血清作1∶100倍稀釋，于4 ℃孵育過夜；HRP-羊抗豬IgG作1∶4 000稀釋，于室溫孵育2 h；其他步驟同“1.6.1”所述。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

分別以構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pET-28a-p72和pET-28a-p72s為模板，進行PCR，分別擴增出1 953 bp和1 098 bp的DNA條帶，同時重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切后，分別得到與預(yù)期大小一致的核酸片段(圖1)。測序和序列比對分析發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒中分別克隆有p72和p72s序列，與預(yù)期一致。

A.pET-28a-p72；B.pET-28a-p72s；M.DL10000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組質(zhì)粒的PCR鑒定；2.重組質(zhì)粒的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鑒定；3.pET-28a(+)空質(zhì)粒酶切對照

2.2 重組蛋白的表達及其表達形式

在18～35 ℃下，用0.25 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達4 h，收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE檢測，可見重組質(zhì)粒pET-28a-p72或pET-28a-p72s轉(zhuǎn)化菌比空質(zhì)粒pET-28a轉(zhuǎn)化菌和大腸桿菌(Rosetta)對照的泳道中分別多出了與預(yù)期相符、相對分子質(zhì)量約76或42 ku的蛋白條帶(圖2)。

A.p72；B.p72s；M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Protein Ruler I)；1、2.大腸桿菌；3、4.pET-28a-p72或pET-28a-p72s轉(zhuǎn)化菌；5、6.pET28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌；1、3、5.誘導(dǎo)前；2、4、6.誘導(dǎo)后

通過比較在不同溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間下的蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)溫度分別為28和26 ℃、IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmoL·L-1及誘導(dǎo)時間為5 h時，p72和p72s蛋白的表達量最高。收集誘導(dǎo)表達菌體，超聲波裂解后，在兩個蛋白表達菌體的裂解沉淀中均檢測到預(yù)期大小的蛋白條帶，而在上清液中沒有或僅有少量蛋白，表明p72和p72s蛋白主要以包涵體形式表達(圖略)。SDS-PAGE檢測顯示，純化的p72和p72s蛋白條帶清晰，但在全長p72蛋白泳道有一條細小雜帶，而截短蛋白泳道無肉眼可見雜帶(圖3)。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Protein Ruler I)；1.純化的p72蛋白；2.純化的p72s蛋白

2.3 重組蛋白的Western blot鑒定

重組p72和p72s蛋白與兔抗His標(biāo)簽多克隆抗體反應(yīng)后，在相應(yīng)泳道分別出現(xiàn)一條清晰的與預(yù)期大小相符的特異性反應(yīng)條帶，而相同條件下誘導(dǎo)后的空載體pET-28a轉(zhuǎn)化菌未見相應(yīng)大小的條帶(圖4)，表明篩選的攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌分別表達了重組p72和p72s蛋白。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組p72蛋白；2.重組p72s蛋白；3.pET-28a空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)物；箭頭分別指重組p72蛋白和p72s蛋白的免疫印跡

2.4 重組蛋白氨基酸序列及其表位預(yù)測

重組p72和p72s蛋白經(jīng)胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解處理后，LC-MS/MS技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，表達蛋白的酶解肽段對p72和p72s蛋白推測氨基酸序列的總覆蓋度分別為89.3%和88.39%(圖5)，表明表達蛋白分別為ASFV的全長和截短p72蛋白?？乖砦活A(yù)測顯示，p72蛋白共含有27個抗原表位，p72s覆蓋其中的63%(17/27)的抗原表位(表2)。

表2 p72和p72s蛋白抗原表位的預(yù)測與比較

帶下劃線序列.酶解肽段序列

2.5 重組p72和p72s蛋白免疫小鼠的血清特異性抗體效價

在第3次免疫后9 d，p72蛋白與p72s蛋白免疫小鼠的抗體效價分別為1∶200～1∶25 600和1∶12 800～1∶409 600(圖6)。可見，p72s蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的抗體效價高于p72蛋白。

圖6 重組p72(A)或p72s(B)免疫小鼠的血清特異性抗體效價

2.6 基于全長與截短p72蛋白的ELISA具有很好的一致性

分別用基于p72蛋白和p72s蛋白的ELISA檢測9份經(jīng)倍比稀釋的ASFV抗血清，結(jié)果如圖7所示，其中5份血清的抗體效價相同，分別為1∶800(1份)、1∶400(3份)和1∶1 600(1份)；針對另外4份血清，當(dāng)用p72s蛋白檢測時，抗體效價為1∶400(3份)和1∶200(1份)；p72蛋白檢測時，抗體效價為1∶100(1份)、1∶200(2份)和1∶400(1份)。上述結(jié)果顯示基于截短p72蛋白ELISA的敏感性較高。

圖7 基于p72蛋白與截短p72蛋白的ELISA的敏感性比較

p72蛋白或p72s蛋白分別與CSFV、PRRSV、PRV和PCV2等抗血清沒有交叉反應(yīng)(圖略)。對108份豬血清的檢測結(jié)果顯示，p72蛋白和p72s蛋白的抗體陽性檢出率分別為72.2%(78/108)和78.7%(85/108)，抗體陰性檢出率分別為27.8%和21.3%，總符合率為93.5%(101/108)。Kappa檢驗結(jié)果顯示，基于p72與p72s蛋白ELISA結(jié)果的kappa=0.826(P=0.016)。上述結(jié)果表明，基于截短與全長p72蛋白的ELISA結(jié)果高度一致，但截短p72蛋白的陽性檢出率較高。

2.7 基于重組p72s蛋白的Western blot的敏感性更高

Western blot檢測結(jié)果如圖8所示，10份ASFV抗體陽性血清中有7份與p72蛋白反應(yīng)，全部與p72s蛋白反應(yīng)(5號血清為弱陽性)。兩份陰性血清及CSFV、PRRSV、PRV和PCV2等抗血清與p72和p72s均不發(fā)生反應(yīng)。該結(jié)果表明，Western blot檢測豬血清特異性ASFV抗體時，p72s蛋白的敏感性更高。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(由高到低依次為100、70、50、40、30和25 ku)；1～10.ASFV抗體陽性豬血清；11～12.ASFV抗體陰性豬血清；13～16.p72蛋白分別與CSFV、PRRSV、PRV和PCV2抗血清的反應(yīng)；17～20.截短p72蛋白分別與CSFV、PRRSV、PRV和PCV2抗血清的反應(yīng)

3 討 論

目前，ASFV的檢測技術(shù)主要有針對病毒DNA的分子生物學(xué)檢測方法和針對病毒的抗原或抗體的免疫學(xué)檢測技術(shù)兩大類[11]。ASFV檢測方法主要有ELISA和PCR(熒光定量PCR和普通PCR)。p72蛋白在病毒感染晚期表達，該蛋白的表達是ASFV在宿主或細胞內(nèi)復(fù)制的指示器，并且其免疫原性強且穩(wěn)定，能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生高效價的特異性抗體。此外，p72在不同毒株之間高度保守[6,12]，因此，p72蛋白是目前ASF分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測技術(shù)研究中最受關(guān)注的診斷靶標(biāo)[13-14]，國內(nèi)也有關(guān)于表達全長或截短p72蛋白的研究報道[15-16]，但尚未見到比較分析全長與截短p72蛋白抗原性的報告，而蛋白的抗原性對于制備多克隆抗體和建立抗體檢測方法至關(guān)重要。同時，在試驗過程中，作者發(fā)現(xiàn)p72蛋白相對分子質(zhì)量較大，純化相對困難。故本研究通過比較全長和截短p72蛋白的抗原性，篩選純化方便、抗原性好的檢測抗原，旨在為建立特異性與靈敏度高的抗體檢測方法提供必要實驗材料。

為了獲得容易制備的檢測ASFV-p72特異抗體的蛋白抗原，本研究在初步分析p72蛋白推導(dǎo)氨基酸序列及其抗原表位的基礎(chǔ)上，設(shè)計了擴增全長和截短p72蛋白的引物，用于構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。在設(shè)計蛋白表達引物時考慮到截短蛋白應(yīng)包括p72蛋白的大部分主要抗原表位的基本原則，以保證截短蛋白既方便表達和純化，又具有良好的抗原性。在表達蛋白的提取純化過程中發(fā)現(xiàn)全長p72蛋白的雜蛋白含量高于p72s蛋白，即便是純化后，蛋白電泳檢測時，全長蛋白仍然有少量的雜蛋白存在，而截短蛋白則無可見雜蛋白。這表明，截短p72蛋白更方便制備與純化。

據(jù)預(yù)測，p72蛋白含有27個抗原表位，Heimerman等[17]用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達部分p72蛋白(aa 20—303)作為免疫原制備出6株單克隆抗體，分別識別p72蛋白上的4個線性表位：aa 165—171、aa 265—280、aa 280—294和aa 290—303。本研究表達的截短p72蛋白(aa 141—502)包含全長p72蛋白預(yù)測表位中的17個表位，同時包含上述單抗識別的4個表位，提示截短與全長p72蛋白一樣，具有良好的抗原性。為了比較全長和截短p72蛋白的抗原性，本研究通過動物免疫、ELISA和Western blot等試驗從免疫原性和反應(yīng)原性兩方面檢測了兩者的抗原性。動物免疫試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，截短p72蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高效價的特異性抗體。基于截短和全長p72蛋白ELISA檢測豬血清ASFV特異性抗體時，兩者的檢測結(jié)果高度一致，并且截短p72s蛋白高于全長p72蛋白的抗體陽性檢出率。此結(jié)果與截短p72蛋白抗原的檢測敏感性較高有關(guān)。隨后，當(dāng)用Western blot檢測豬血清特異抗體時，也發(fā)現(xiàn)截短p72蛋白的抗體檢出率明顯高于全長p72蛋白的檢測結(jié)果，尤其當(dāng)血清抗體水平較低時，全長p72蛋白則無法檢測到相應(yīng)抗體，但截短p72則可以檢測到。該結(jié)果表明，進行Western blot時，截短p72蛋白的反應(yīng)敏感性更高。此結(jié)果的出現(xiàn)可能與截短p72蛋白分子量小，單位體積內(nèi)抗原性強的抗原表位摩爾分子數(shù)多于全長p72蛋白的相應(yīng)表位分子數(shù)有關(guān)，對此需要進一步試驗證實。

4 結(jié) 論

通過表達全長和截短非洲豬瘟病毒p72蛋白并比較其抗原性，發(fā)現(xiàn)截短p72蛋白比p72蛋白具有更好的抗原性，可以用截短p72蛋白作為檢測抗原用于研發(fā)ASFV-ELISA抗體檢測方法，當(dāng)進行Western blot時，截短p72蛋白與特異性抗體反應(yīng)的敏感性更高。