王華健,張 寧,楊 威,趙志強,李 茜,陸 安,田 勇,何 欣,趙興華,4*,李杰峰*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，保定 071000；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000；3.石家莊市金元康牧藥業(yè)有限公司，石家莊 051130；4.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，保定 071000)

食源性疾病是食品安全的主要問題之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)統(tǒng)計報告，全球平均每年有上億腹瀉病例，以兒童死亡率最高，其中超70%疾病由致病微生物所致[1]。自2015年我國系統(tǒng)開展食源性疾病監(jiān)測以來，新的食源性細菌感染不斷出現(xiàn)，大腸桿菌O157∶H7和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌感染是近年重要的食源性疾病[2]。大腸桿菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)的代表血清型，1999年、2000年相繼在我國安徽和江蘇兩省暴發(fā)流行，并波及中原及西部地區(qū)，在華北、東北及華東少數(shù)地區(qū)也出現(xiàn)了散發(fā)病例。沙門菌在我國分布廣泛，劉繼開等[3]調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)除西藏外所有省份均有檢出，最常見血清型為鼠傷寒型和腸炎型，除此之外，近年來，非傷寒型沙門菌(NTS)也被認(rèn)為是我國食源性疾病的主要病原菌。WHO將產(chǎn)單核細胞李氏桿菌列為與高住院率和死亡率有關(guān)的主要食源性病原體。2015年，美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)報道了一起由產(chǎn)單核細胞李氏桿菌引起的食源性疾病暴發(fā)事件，至少8人因食用藍鈴(Bule Bell)公司冰淇淋產(chǎn)品患病，導(dǎo)致3人死亡。國外研究發(fā)現(xiàn)生鮮肉中產(chǎn)單核細胞李氏桿菌污染最嚴(yán)重，對四環(huán)素類、氯霉素和青霉素等抗生素耐藥[4-5]，國內(nèi)?；覆实萚6]通過對產(chǎn)單核細胞李氏桿菌流行病學(xué)和耐藥性研究也有相似結(jié)論。綜上，大腸桿菌O157∶H7、沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌在食品中污染嚴(yán)重、危害巨大，針對這3種食源性致病菌建立一種快速檢測方法非常必要。

食源性致病菌檢測方法中，目前最常用的是細菌分離培養(yǎng)結(jié)合生化鑒定，但該傳統(tǒng)方法費時、費力且不能對食源性致病菌進行深入分析。分子生物學(xué)經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測，基于核酸和熒光標(biāo)記的熒光定量PCR(qPCR)方法作為先進的技術(shù)手段，具有特異性強、靈敏度高、耗時短等優(yōu)點[7]。目前，應(yīng)用qPCR方法針對一種或多種食源性致病菌的檢測穩(wěn)定，但未見關(guān)于這3種致病菌的多重qPCR檢測方法的研究和市場專利產(chǎn)品等。rfbE基因是大腸桿菌O157∶H7的特異基因，rfb基因簇編碼多種將低聚糖單元組裝成特異O抗原所必需的酶[8]；沙門菌吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白由invA基因合成，是主要毒力因子且核苷酸序列保守[9]；產(chǎn)單核細胞李氏桿菌溶血素編碼基因hlyA高度保守和特異[10]。本研究基于3種致病菌保守性基因擬建立一種可同時檢測這3種食源性致病菌的多重qPCR方法，用于食品中致病菌污染檢測。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

試驗所用標(biāo)準(zhǔn)菌株共10株，目標(biāo)菌株為大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7，NCTC 12900)、沙門菌(Salmonela)和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌(Listeriamonocytogenes)3種，其余7種供試菌株有大腸桿菌(Escherichiacoli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、克雷伯菌(Klebsiellaspp.)、巴氏桿菌(Pasteurella)、豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，所有菌株均保存于河北省畜牧獸醫(yī)研究所微生物室菌種保藏庫。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

通用型DNA提取試劑盒、M5 GoldStar TaqMan Mixture(北京聚合美生物科技有限公司)；溶菌酶(北京索萊寶科技有限公司)；營養(yǎng)肉湯(nutrient broth, NB)、改良EC肉湯(Modified EC Broth, mEC+n)、改良山梨醇麥康凱瓊脂(Modified Sorbitol MacConkey Agar, CT-SMAC)、緩沖蛋白胨水(buffered peptone water, BPW)、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(chǔ)(tetrathionate broth base, TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(elenite cystine broth, SC)、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(第二代)、李氏菌增菌肉湯基礎(chǔ)(Listeriaenrichment broth base, LB1, LB2)、PALCAM 瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司)；法國科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基(上海欣中生物工程有限公司)。

1.3 主要儀器

Light Cycler?96實時熒光定量PCR儀(德國羅氏診斷有限公司)、K5500超微量分光光度計(北京凱奧科技發(fā)展有限公司)。

1.4 引物和探針

登錄NCBI網(wǎng)站，在GenBank中分別下載大腸桿菌O157∶H7、沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌的保守基因rfbE、invA和hlyA序列。應(yīng)用MegAlign軟件進行序列比對，選擇合適的基因序列，應(yīng)用Primer Express 3.0.1軟件設(shè)計引物和TaqMan探針。引物和探針序列見表1所示，各引物和探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物和探針序列

1.5 菌株培養(yǎng)及細菌基因組DNA提取

將大腸桿菌O157∶H7、沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌分別接種于NB中復(fù)蘇，37 ℃ 培養(yǎng)12 h后進行平板培養(yǎng)基分離[大腸桿菌O157∶H7，改良山梨醇麥康凱瓊脂(CT-SMAC)培養(yǎng)基；沙門菌，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(第二代)；產(chǎn)單核細胞李氏桿菌，PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基]。在各平板上挑取單個菌落于NB中37 ℃ 純培養(yǎng)12 h，取1 mL細菌純培養(yǎng)液，按通用型DNA提取試劑盒提取各細菌基因組DNA。用K5500超微量分光光度計測定各細菌DNA模板的濃度和純度，并計算DNA拷貝數(shù)。DNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 單重qPCR 擴增及特異性試驗

分別以目標(biāo)菌株和供試菌株的基因組DNA為模板進行擴增。反應(yīng)體系：2×M5 GoldStar TaqMan Mixture 10 μL，上下游引物各0.6 μL，探針0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補足至20 μL。引物和探針濃度為10 mmol·μL-1。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火并延伸30 s，40個循環(huán)，在每個循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號。以NB培養(yǎng)液為陰性對照，無菌超純水為空白對照。

1.7 多重qPCR 體系的建立和優(yōu)化

以單重qPCR反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，對3株目標(biāo)菌株引物和探針的使用量進行優(yōu)化，確認(rèn)最優(yōu)多重qPCR反應(yīng)體系。

1.7.1 多重qPCR特異性試驗和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 同步驟“1.5”提取各目標(biāo)菌株的DNA模板并用ddH2O倍比稀釋為濃度107～103copies·μL-1，將3種目標(biāo)菌株的DNA模板按每個稀釋度等量混勻并做3個重復(fù)，按優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)體系，分別對大腸桿菌O157∶H7、沙門菌、產(chǎn)單核細胞李氏桿菌和其他7株供試菌種進行多重qPCR擴增，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2 多重qPCR靈敏性和重復(fù)性試驗 同步驟“1.7.1”，將3種目標(biāo)菌株的DNA模板等量混勻，倍比稀釋濃度為107～100copies·μL-1，按優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行多重qPCR擴增確定其靈敏性，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)。重復(fù)性試驗根據(jù)靈敏性試驗選擇合適的DNA模板濃度，每隔5 d做一組重復(fù)性試驗，共3次。根據(jù)結(jié)果分別計算批內(nèi)變異系數(shù)(CV%)和批間變異系數(shù)。

1.8 臨床樣品檢測

在本地超市、農(nóng)貿(mào)市場和商店中購買120份生鮮肉，包括雞肉41份、豬肉47份、牛肉18份、羊肉14份。以進出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 1870—2016《出口食品中食源性致病菌檢測方法實時熒光PCR法》)為基礎(chǔ)，按優(yōu)化后的多重qPCR反應(yīng)體系進行樣品檢測，同時根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 4789.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157∶H7/NM檢驗》、GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》、GB 4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》)進行檢測結(jié)果對比，驗證多重qPCR方法的準(zhǔn)確性。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應(yīng)用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 DNA模板濃度和純度的測定及單重qPCR特異性

DNA模板濃度和純度(A260nm/A280nm)測定數(shù)值如下：大腸桿菌O157∶H7分別為166.39 ng·μL-1和1.799，沙門菌分別為272.62 ng·μL-1和1.847，產(chǎn)單核細胞李氏桿菌分別為35.905 ng·μL-1和1.967?？截悢?shù)計算公式：DNA拷貝數(shù)=[6.02×1023(copies·mol-1)×DNA濃度(g·μL-1)]/目的基因組的分子量，式中需要的條件有DNA濃度和目的基因組的分子量。沙門菌基因組大小為4.8 Mb，1 bp堿基分子量為652 g·mol-1[11]；大腸桿菌O157∶H7基因組大小約4.2 Mb[12]；產(chǎn)單核細胞李氏桿菌基因組大小約3 Mb[13]。3種目標(biāo)菌株分別進行單重qPCR反應(yīng)，結(jié)果見圖1所示，擴增曲線明顯，其他供試菌株均無擴增曲線，表明試驗設(shè)計的3種目標(biāo)菌株的引物和探針特異性良好。

1.大腸桿菌O157∶H7；2.沙門菌；3.產(chǎn)單核細胞李氏桿菌；4～11.其他供試菌株(E. coli、S. epidermidis、S. aureus、Klebsiella、Pasteurella、S. suis type 2、E. faecalis)和空白對照

2.2 多重qPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

以引物和探針濃度為10 mmol·μL-1為基礎(chǔ)，對多重 qPCR 反應(yīng)體系的各引物、探針和Mixture等用量進行優(yōu)化，選出最優(yōu)反應(yīng)體系為2×M5 GoldStar TaqMan Mixture 30 μL，3種細菌混合上、下游引物1.5 μL，混合探針0.6 μL，混合模板4 μL，ddH2O 補足至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性3 s，60 ℃退火并延伸30 s，40個循環(huán)，在每個循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號。

2.3 多重qPCR特異性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

多重qPCR特異性試驗結(jié)果為3種目標(biāo)細菌均顯示良好的擴增曲線，非目標(biāo)細菌和空白對照均無擴增，表明優(yōu)化后的多重qPCR反應(yīng)對大腸桿菌O157∶H7、沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌具有良好的特異性，且不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。多重qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖2，大腸桿菌O157∶H7的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-3.743x+45.675，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999，擴增效率為85%；沙門菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-3.62x+43.13，R2=0.999，擴增效率為88.9%；產(chǎn)單核細胞李氏桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=-3.926x+44.296，R2=0.995，擴增效率為80%。R2均大于0.99，表明DNA拷貝數(shù)濃度的對數(shù)值(X軸)與Ct值(Y軸)之間具有良好的線性關(guān)系，引物和探針的擴增效率較高，建立的多重 qPCR 反應(yīng)體系穩(wěn)定。

1.大腸桿菌O157∶H7；2.沙門菌；3.產(chǎn)單核細胞李氏桿菌

2.4 多重qPCR靈敏性和重復(fù)性

多重qPCR靈敏性試驗陽性結(jié)果判定為Ct≤35[14-15]，qPCR試驗通常設(shè)定為40個循環(huán)，當(dāng)Ct值>35時，反應(yīng)的隨機性增大，重復(fù)性試驗誤差增加，可能伴隨非特異性產(chǎn)物的影響。大腸桿菌O157∶H7、沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌的靈敏性均為104copies·μL-1。根據(jù)重復(fù)性試驗結(jié)果選擇濃度梯度為107～104copies·μL-1的DNA模板，4個梯度批內(nèi)變異系數(shù)為0.09%～2.97%，批間變異系數(shù)為0.23%～7.82%。變異系數(shù)只在平均值不為零時有意義，反應(yīng)單位均值上的離散程度，當(dāng)批內(nèi)變異系數(shù)小于5%～10%，批間變異系數(shù)小于15%～20%時，表明試驗結(jié)果可重復(fù)性高，建立的多重qPCR檢測方法重復(fù)性好，具體數(shù)據(jù)見表2和表3。

表2 多重qPCR批內(nèi)重復(fù)性試驗

表3 多重qPCR批間重復(fù)性試驗

2.5 臨床樣品檢測

以國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為對照，檢驗已建立的多重 qPCR方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果對比見表4。市場采集的120份生鮮肉樣品中，國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測出2份大腸桿菌O157∶H7、13份沙門菌和21份產(chǎn)單核細胞李氏桿菌；使用建立的多重qPCR法檢出2份大腸桿菌O157∶H7、14份沙門菌和21份產(chǎn)單核細胞李氏桿菌。食品檢測中用傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定的陽性樣本與qPCR方法檢測結(jié)果一致，應(yīng)用qPCR方法檢測食源性致病菌的陽性檢出率較傳統(tǒng)培養(yǎng)法略高，而多重qPCR方法的檢測時間更短。

表4 多重qPCR與國標(biāo)法檢測對比試驗

3 討 論

傳統(tǒng)的細菌鑒定需要增殖培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)和生化鑒定3個步驟，是檢測食源性致病菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，缺點是耗時長，通常需要5～6 d，且檢測靈敏度低、無法進行定量分析[14]。目前，已報道多種食源性致病菌快速檢測方法[16]，除平板檢測法外，常規(guī)檢測方法還有化學(xué)分析法和免疫分析法等，這些方法步驟繁瑣、耗時長、成本高，需要高專業(yè)水平人員操作，因此開發(fā)以分子生物學(xué)、免疫分析、生物傳感器、代謝學(xué)、核酸適配體為基礎(chǔ)，具有操作簡單、靈敏、快速和低成本等優(yōu)點，具備檢測復(fù)雜食品樣品中致病菌的方法是主要研究方向。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)已成為一種強大的研究和診斷工具，簡便、快速、靈敏和特異是qPCR滿足核酸檢測所需的4個關(guān)鍵方面[17]。本研究參考多篇文獻報道的3種致病菌保守基因[11,14,18]，以大腸桿菌O157∶H7rfbE基因、沙門菌invA基因和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌hlyA基因設(shè)計3種致病菌特異性引物和探針,建立多重qPCR方法，進行特異性、靈敏性、重復(fù)性和臨床樣品檢測試驗。結(jié)果表明，建立的多重qPCR方法對3種致病菌均特異性擴增；靈敏性高，均達到104copies·μL-1，目前國內(nèi)多數(shù)多重qPCR方法的研究中[14,19-20]靈敏性檢測限為102～105copies·μL-1，本研究建立的方法靈敏性符合理論預(yù)期；重復(fù)性良好，批內(nèi)變異系數(shù)為0.09%～2.97%，小于5%，批間變異系數(shù)為0.23%～7.82%，小于10%；臨床樣品檢測同國標(biāo)法差異小，國標(biāo)法檢測陽性樣品用本研究方法檢測結(jié)果均為陽性；檢測時間短，僅1 h。

本研究建立的多重qPCR方法在食品檢測結(jié)果中顯示沙門菌檢出率略高于國標(biāo)法，但所有受污染樣品都被檢出，證明建立的方法具有特異性和有效性，可用于實際檢測。微生物在自然環(huán)境中主要有活菌(viable)、活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but non-culturable, VBNC)、具有生物活性的死菌(ghosts)以及細胞膜損傷的死菌(membrane compromised)4種存在狀態(tài)。有研究表明[21]，處于VBNC狀態(tài)時細菌不能在異養(yǎng)平板上生長，但仍具有新陳代謝、致病性和毒性，從而逃避國標(biāo)法的檢測，成為影響食品安全的隱性污染源，qPCR法作為分子生物學(xué)方法根據(jù)致病菌的特異性基因來檢測，不區(qū)分活菌和死菌，多重qPCR法的陽性檢測率略高于國標(biāo)法，多篇文獻報道[14-15,22]也證實了這一點。多重qPCR反應(yīng)在同一體系下進行，大大節(jié)省了試劑和材料，檢測程序更加精準(zhǔn)、快速[22]。綜上所述，研究建立的多重qPCR方法可作為食品中大腸桿菌O157∶H7、沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌3種食源性致病菌一種準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定的檢測手段。

應(yīng)用本研究建立的多重qPCR方法對保定市市售生鮮肉食品中3種致病菌污染進行檢測分析，采集的120份生鮮肉樣品中，受污染樣品34份，總檢出率為28.33%，檢測出2份大腸桿菌O157∶H7、14份沙門菌和21份產(chǎn)單核細胞李氏桿菌，陽性檢出率分別為1.67%、11.67%和17.50%，其中有3份樣品為沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌混合感染。2010—2016年，河北省共報告食源性疾病暴發(fā)事件308起，發(fā)病3 152人，死亡25人，病死率為0.79%，其中微生物性是主要致病因素，占24.7%[23]。近年來，河北省對食源性致病菌污染研究較少，關(guān)于石家莊、滄州和邯鄲等部分地區(qū)流行情況的文獻報道顯示食源性致病菌存在不同程度污染[24-26]，2015年，石家莊市市售食品食源性致病菌總檢出率為25.00%，沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌檢出率分別為4.08%和3.06%；2016—2017年，滄州市食品食源性致病菌總檢出率為22.38%；2014 年邯鄲市食品致病菌監(jiān)測總檢出率為14.4%，產(chǎn)單核細胞李氏桿菌為6.0%，沙門菌為1.3%。綜上所述，不同地區(qū)存在不同程度的食源性致病菌污染，對食品安全造成潛在威脅，必須加強各地食源性致病菌污染監(jiān)測和食品衛(wèi)生管理，保障食品安全。

4 結(jié) 論

建立了能快速、準(zhǔn)確檢測食品中大腸桿菌O157∶H7、沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌3種食源性致病菌的多重qPCR檢測方法。應(yīng)用該方法對120份保定市售生鮮肉樣品進行檢測，總檢出率為28.33%，大腸桿菌O157∶H7、沙門菌和產(chǎn)單核細胞李氏桿菌陽性檢出率分別為1.67%、11.67%和17.50%。