高 昕，羅園園，楊慧明，2，張國(guó)中，2，趙 燁*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷研究中心，北京 100193)

傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)屬于皰疹病毒科，傳染性喉氣管炎病毒屬，可引起雞的急性、接觸性上呼吸道癥狀。不同ILTV毒株毒力強(qiáng)弱有所差別。急性感染時(shí)，發(fā)病率和死亡率分別可高達(dá)100%和40%，溫和型ILT發(fā)病率接近5%～10%，死亡率低于2%。病雞主要表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、結(jié)膜炎及咳出血樣滲出物，剖檢時(shí)可見喉部、氣管黏膜腫脹、出血、糜爛和壞死[1]。ILTV于20世紀(jì)50年代末期首次在我國(guó)報(bào)道發(fā)生，90年代后,在我國(guó)一些地區(qū)呈地方性流行，極大地?fù)p害了我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展[2-5]。

ILTV為線性雙股DNA病毒，其基因組長(zhǎng)度為155 kb，分為長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)(UL)和短獨(dú)特區(qū)(US)，US左側(cè)為反向重復(fù)序列(IRS)，US右側(cè)為末端重復(fù)序列(TRS)，IRS與TRS區(qū)序列相同但方向相反[6]。UL23(TK)、UL27(gB)和UL32基因位于UL區(qū)，TK基因是ILTV的主要毒力基因，也是構(gòu)建基因缺失疫苗的主要靶標(biāo)[7-8]。UL27(gB)和UL32編碼病毒粒子表面糖蛋白，其中，gB是病毒感染所必需的主要糖蛋白和保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)體液免疫[9]。二者保守性高，作者前期研究表明，表達(dá)gB和UL32基因的重組雞痘病毒疫苗具有良好安全性和穩(wěn)定性[10]。ICP4基因位于IRS區(qū)域，參與激活病毒早/晚期基因的表達(dá)[11]，ICP4基因與病毒毒力存在關(guān)聯(lián)。

由于ILTV具有急性暴發(fā)和長(zhǎng)期潛伏感染的特性，需要對(duì)ILTV進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，了解當(dāng)前流行毒株的基因特征及致病性對(duì)于控制ILT的流行具有重要意義。本試驗(yàn)對(duì)1株ILTV分離株的關(guān)鍵毒力基因序列TK、ICP4及免疫糖蛋白序列g(shù)B、UL32進(jìn)行分析，了解其分子進(jìn)化特征及在進(jìn)化樹中與流行毒株的親緣關(guān)系，并開展SPF雞的致病性研究，研究結(jié)果豐富了我國(guó)ILTV分子流行病學(xué)調(diào)查內(nèi)容，為進(jìn)一步開展ILTV的防控提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒的繁殖與復(fù)壯

取本實(shí)驗(yàn)室分離保存的傳染性喉氣管炎病毒BT株(ILTV-BT)病毒液經(jīng)絨毛尿囊膜途徑(CAM)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)5 d，無(wú)菌收集有明顯病變的絨毛尿囊膜，無(wú)菌研磨后，用滅菌生理鹽水4倍稀釋，經(jīng)CAM途徑連續(xù)傳至10代，按照Reed-Muench法計(jì)算雞胚半數(shù)感染量(EID50)。無(wú)菌分裝后,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 病毒基因擴(kuò)增及測(cè)序

提取第10代出現(xiàn)明顯痘斑的雞胚絨毛尿囊膜DNA，參考GenBank中公布的ILTV目的基因片段核苷酸序列，針對(duì)ILTV基因組TK、gB、UL32、ICP4基因設(shè)計(jì)鑒定及測(cè)序引物(請(qǐng)參見OSID相關(guān)資料)。以提取所得的DNA為模板對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 病毒的遺傳進(jìn)化與分子特征分析

使用DNAStar軟件和Geneious等生物學(xué)軟件進(jìn)行序列拼接和分析；采用MEGA v.6軟件中的Clastal W算法對(duì)所有核苷酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)；基于鄰接法(Neighbor Joining method)構(gòu)建TK、gB、UL32和ICP4串聯(lián)基因序列進(jìn)化樹；采用NetNGlyc在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)分析預(yù)測(cè)gB及UL32基因的糖基化位點(diǎn)。

1.4 動(dòng)物回歸致病性試驗(yàn)

將繁殖復(fù)壯后的ILTV-BT株以將104.0EID50·0.2 mL-1的劑量進(jìn)行喉氣管內(nèi)回歸接種10只2周齡SPF雞，在14 d的觀察期內(nèi)，每天觀察雞的臨床癥狀，試驗(yàn)期結(jié)束后，隨機(jī)選取3只雞進(jìn)行剖檢，觀察喉頭及氣管的剖檢變化。同時(shí)，另5只SPF雞接種0.2 mL生理鹽水作為空白對(duì)照組。

2 結(jié) 果

2.1 ILTV-BT株的分離鑒定與相似性分析

經(jīng)CAM途徑接種SPF雞胚，連續(xù)傳代出現(xiàn)穩(wěn)定胚變，雞胚絨毛尿囊膜增厚，有大小不等不透明白色病斑(圖1A)。使用ILTVgB基因鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了約1 360 bp大小的片段，與預(yù)期相符(圖1B)。測(cè)序結(jié)果(未展示)顯示，在4個(gè)基因中，ICP4基因的變異最大(98.68%～99.96%)，其次為gB基因(99.43%～100.00%)，TK基因(99.63%～100.00%)及UL32基因最為保守(99.89%～100.00%)。BT株與我國(guó)經(jīng)典強(qiáng)毒株WG株的相似性最低(99.43%)，與疫苗株Serva的相似性最高(100.00%)。

M.Trans 5K DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P.陽(yáng)性對(duì)照；C.陰性對(duì)照；BT.傳代毒P10代

2.2 遺傳進(jìn)化分析與關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)

基于串聯(lián)基因組的進(jìn)化樹分析顯示，ILTV毒株具有明顯的地理隔離特征，可分為澳大利亞、歐洲和中國(guó)3個(gè)主要進(jìn)化分支，ILTV-BT株與其余國(guó)內(nèi)流行分離株處于同一分支(圖2)。氨基酸比對(duì)結(jié)果(未展示)顯示，BT株與強(qiáng)毒株WG和1874C5的氨基酸差異主要集中于gB基因和ICP4基因。TK基因與WG株僅有一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異(252T)，gB基因與WG株共有5個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，分別為44R、116V、551M、644I和707F，與1874C5株共有4個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，分別為116V、644I、799P和805K。有6個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(102、121、211、262、360和649位)。UL32基因的441位存在1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。其與WG株在142和227位存在差異。與澳大利亞和美國(guó)分離株相比，BT株在ICP4基因87—90位存在4個(gè)氨基酸的缺失(AAQD)。其862—868位存在6個(gè)氨基酸的缺失(QPQEPQ)。此外，其在1 171位的氨基酸由甘氨酸G突變?yōu)楣劝彼酔，該突變僅存在于LJS09序列中。

圖2 ILTV-BT株串聯(lián)基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3 ILTV-BT株動(dòng)物回歸致病性

在感染組接種后14 d觀察期內(nèi)未觀察到呼吸道癥狀及死亡，僅觀察到少量雞出現(xiàn)精神沉郁及眼結(jié)膜分泌物，2～3 d后逐漸恢復(fù)(圖3A、B)。剖檢結(jié)果顯示喉頭氣管正常(圖3C、D)。空白對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)觀察期內(nèi)未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，剖檢顯示喉頭氣管正常。

圖3 ILTV-BT株感染雞臨床觀察及氣管剖檢

3 討 論

本研究中，BT株核苷酸序列與國(guó)內(nèi)其他流行毒株相似性在97%以上，屬于同一進(jìn)化分支，未出現(xiàn)較大變異。但其與美國(guó)強(qiáng)毒株1874C5和國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株WG株等毒株差異較大，主要集中于gB和ICP4基因。gB基因與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株WG株的相似性最低，包含5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異(44R、116V、551M、644I和707F)，而與弱毒疫苗株的相似性更高；WG株與國(guó)外強(qiáng)毒株如美國(guó)632強(qiáng)毒株、英國(guó)Throne強(qiáng)毒株的基因序列相似性為100%[12]，因此上述位點(diǎn)的差異可能為強(qiáng)毒株與弱毒株之間的毒力差異位點(diǎn)，并值得進(jìn)一步研究；ILTV-BT株ICP4基因與美國(guó)強(qiáng)毒株1874C5和WG株等毒株差異也較大，有文獻(xiàn)表明ICP4基因發(fā)生突變可能影響病毒毒力水平[9]。與國(guó)外分離株相比，BT株在87—90位和862—868位存在氨基酸缺失，文獻(xiàn)報(bào)道這兩個(gè)關(guān)鍵的氨基酸序列缺失可以減弱ICP4基因激活基因的表達(dá)，因此能夠抑制潛伏感染的病毒重新活化[13]。ILTV-BT株的核苷酸序列與美國(guó)疫苗株Serva的同源性最高，而與澳大利亞疫苗株SA2和A20親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。不同地區(qū)之間分離株的差異也可能與所使用疫苗株來(lái)源的不同有關(guān)。

為了評(píng)估分離株對(duì)SPF雞的致病性，筆者將ILTV-BT株感染2周齡SPF雞，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株可引起少量雞出現(xiàn)精神沉郁及眼結(jié)膜癥狀，但沒(méi)有出現(xiàn)雞死亡。說(shuō)明分離株對(duì)SPF雞有一定的致病性，但致病力較溫和。這也可能是造成類似低毒力毒株在雞群中廣泛傳播和流行的原因。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)1株ILTV國(guó)內(nèi)分離株進(jìn)行部分基因序列測(cè)定分析及2周齡SPF雞致病性研究，作者發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)ILTV流行株以較溫和的形式在雞群中流行，并呈現(xiàn)出與近年來(lái)國(guó)外分離株不同的獨(dú)特基因序列特征。