崔松奇，張文芳，張丹丹，余海濤，劉 洋，孔 敏，田春利

(豪威生物科技有限公司，天津 武清 301700)

0 引言

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病，臨床癥狀表現(xiàn)為恐水、恐光、狂躁不安等[1]?？袢〔《究筛腥救?、貓、狐貍等溫血?jiǎng)游?，人一旦感染，致死率幾?00%[2]。據(jù)估計(jì)，狂犬病流行于全球150多個(gè)國(guó)家，每年造成約59 000人死亡，其中95%的病例發(fā)生在非洲和亞洲[3]，其中亞洲占56%，非洲占44%。大多數(shù)死亡(84%)都發(fā)生在農(nóng)村地區(qū)，其主要原因是對(duì)于犬狂犬病監(jiān)管力度不足[4]。我國(guó)狂犬病全年都有流行，但相對(duì)集中于夏秋季節(jié)，主要是農(nóng)民、學(xué)生、散居兒童發(fā)病較多。世界衛(wèi)生組織( World Health Organization，WHO) 建議將犬類(lèi)狂犬病疫苗接種率提高至 70%，以有效阻止狂犬病毒的傳播[5]。大規(guī)模犬類(lèi)免疫接種也是消除人類(lèi)狂犬病的根本措施[6]。因此探索狂犬病病毒獸用疫苗制備工藝，研制安全高效價(jià)的獸用疫苗，從源頭控制，以切斷動(dòng)物散毒途徑，對(duì)控制人感染狂犬病病毒事件的發(fā)生具有重大意義。

1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明系小鼠，11～13 g，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

檢驗(yàn)用強(qiáng)毒狂犬病固定毒巴黎株:代號(hào)AV2011，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。

狂犬病參考疫苗標(biāo)準(zhǔn)品: 由豪威生物科技公司制備。

狂犬病疫苗效力檢測(cè)試劑盒:購(gòu)自武漢生物制品研究所。

β-丙內(nèi)酯(BPL):Alfa-Aesar公司產(chǎn)品，純度97%，批號(hào):33672。

層析柱(Index Column 140/950)及配件:購(gòu)自GE 公司。

柱材(Sepharose 4Fast Flow ):購(gòu)自GE 公司。

UV檢測(cè)器:購(gòu)自GE公司。

經(jīng)超濾濃縮50倍的抗原:由本公司生產(chǎn)車(chē)間提供。

0.2 m2冷凍真空干燥機(jī):型號(hào)GZLY-0.2，購(gòu)自?shī)W特佳美科技有限公司。

15 m2冷凍真空干燥機(jī):購(gòu)自上海遠(yuǎn)東制造總廠。

2 方法

2.1 純化試驗(yàn)

1)上樣量?jī)?yōu)化試驗(yàn):將滅活檢驗(yàn)合格的50倍濃縮抗原分別以600 mL、960 mL和1 200 mL上樣，固定洗脫流速102 mL/min不變，經(jīng)Sepharose 4 Fast Flow (4FF)柱層析系統(tǒng)純化，用紫外蛋白檢測(cè)儀在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)分離液，分步收集各洗脫峰。

2)洗脫流速優(yōu)化試驗(yàn):以試驗(yàn)中確定的最佳上樣量進(jìn)行上樣，改變洗脫流速，分別以77 mL/min、102 mL/min和128 mL/min進(jìn)行洗脫，用紫外蛋白檢測(cè)儀在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)分離液，分步收集各洗脫峰。

3)使用狂犬病病毒糖蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)不同上樣量和不同洗脫流速下的各洗脫峰進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 凍干曲線(xiàn)優(yōu)化試驗(yàn)

1)為達(dá)到理想的冷凍干燥效果，將無(wú)菌的狂犬病純化抗原與耐熱保護(hù)劑混合，測(cè)定混合液的共晶點(diǎn)與塌陷溫度。本研究采用電阻法確定制品的共晶點(diǎn)，采用低溫凍干顯微鏡測(cè)定塌陷溫度，以控制冷凍干燥中預(yù)凍溫度及升華過(guò)程主干燥溫度。

2)疫苗凍干程序的設(shè)計(jì)。根據(jù)測(cè)定的共晶點(diǎn)溫度和塌陷溫度設(shè)計(jì)4條凍干程序如表1所示。

3)使用NIH(National Institutes of Health)法對(duì)凍干前后產(chǎn)品開(kāi)展效力檢測(cè)。

4)對(duì)凍干后產(chǎn)品進(jìn)行物理性狀檢測(cè)、剩余水分檢測(cè)、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。

表1 凍干程序

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 純化試驗(yàn)結(jié)果

1)不同上樣量純化效果比較，如表2所示。由表2可以看出，3個(gè)不同上樣量純化抗原的回收體積差別不顯著。當(dāng)上樣量為600 mL時(shí)，A峰(ELISA檢測(cè)為狂犬病毒峰)基本可降至基線(xiàn)，B峰ELISA檢測(cè)狂犬病毒陰性，雜蛋白去除率在95%以上；上樣量增加至960 mL時(shí)，A、B峰間的連線(xiàn)縮短，但基本可分開(kāi)，雜蛋白去除率較5%柱床體積上樣量降低了2%；而當(dāng)上樣量增至1 200 mL時(shí)，A峰中蛋白含量增高，B峰的前幾管收集液經(jīng)ELISA檢測(cè)為病毒抗原陽(yáng)性，雜蛋白去除率較5%和8%柱床體積上樣量大幅度降低，只有79%左右。

2)不同洗脫流速純化效果比較如表3所示。由表3可以看出，隨著洗脫流速的增加，A、B峰間的連線(xiàn)越來(lái)越短，以128 mL/min洗脫時(shí)，無(wú)論是雜蛋白去除率還是抗原回收率效果均不如77 mL/min和102 mL/min。

表3 不同洗脫流速下純化效果比較

綜上所述，兼顧純化效率及分離效果，確定Index Column 140/950層析柱層析分離濃縮狂犬病毒抗原的最佳上樣量為960 mL(8%柱床體積)、最佳洗脫流速102 mL/min(線(xiàn)性流速40 cm/hr)。

3.2 凍干曲線(xiàn)優(yōu)化試驗(yàn)

1)共晶點(diǎn)與塌陷溫度的測(cè)定。對(duì)狂犬病純化抗原與耐熱保護(hù)劑混合液進(jìn)行共晶點(diǎn)與塌陷溫度的測(cè)定，共晶點(diǎn)溫度為28.6 ℃，塌陷溫度為24.9℃～22.3℃。

2)凍干前后效力檢測(cè)結(jié)果，如表4所示。由表4各凍干程序凍干制品凍干前后效力檢測(cè)結(jié)果可以看出，凍干程序3和凍干程序4的凍干效力損失基本相當(dāng)，優(yōu)于凍干程序2，由于凍干程序1在凍干過(guò)程中融化發(fā)泡，未進(jìn)行效力檢測(cè)。

表4 各凍干程序凍干制品凍干前后效力檢測(cè)結(jié)果 單位：IU

3)凍干產(chǎn)品物理性狀檢測(cè)、真空度檢測(cè)、剩余水分檢測(cè)結(jié)果，如表5所示。由表5凍干制品物理性狀、真空度、剩余水分檢測(cè)結(jié)果可以看出，凍干程序3、凍干程序4的物理性狀、要優(yōu)于凍干程序1和凍干程序2，在剩余水分方面，凍干程序4的剩余水分偏高，整體來(lái)看，凍干程序3在所有凍干程序中是最優(yōu)的。

表5 各凍干程序凍干制品物理性狀、真空度、剩余水分檢測(cè)結(jié)果

4)各凍干程序凍干制品熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，如表6所示。由表6熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可以看出，程序3凍干后制品熱穩(wěn)定性試驗(yàn)效力損失最小，且37℃ 10 d后制品的物理性狀依然合格。程序4凍干后的制品熱穩(wěn)定性試驗(yàn)效力損失最大，且37℃ 10 d后制品的物理性發(fā)生嚴(yán)重萎縮現(xiàn)象，從本次熱穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果可以推測(cè)，凍干制品的剩余水分對(duì)制品的保存影響很大。

表6 各凍干程序凍干制品熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 單位：IU

4 討論

本文研究的是不同上樣量和洗脫流速對(duì)凝膠過(guò)濾純化效果的影響。上樣量過(guò)多，會(huì)造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過(guò)少，提純后各組分量少、濃度較低，生產(chǎn)效率低[7]。洗脫速度也會(huì)影響凝膠過(guò)濾的分離效果，洗脫速度要恒定而且合適。一般來(lái)講，洗脫速度慢一些，樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好，但洗脫速度過(guò)慢又會(huì)造成樣品擴(kuò)散，加劇區(qū)帶變寬，反而會(huì)降低分辨率，而且生產(chǎn)時(shí)間會(huì)大大延長(zhǎng)，所以實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況來(lái)選擇合適的洗脫速度[8]。通過(guò)試驗(yàn)顯示，當(dāng)上樣量為5%～8%柱床體積時(shí)，病毒峰與雜蛋白峰可以完全分開(kāi)，雜蛋白去除率在93%以上。洗脫流速是柱層析獲得良好分離效果的另一重要條件，隨著洗脫流速的增加，A、B峰間的連線(xiàn)越來(lái)越短，以128 mL/min洗脫時(shí)，無(wú)論是雜蛋白去除率還是抗原回收率效果均不如77 mL/min和102 mL/min，這是因?yàn)槟z層析的分離作用主要取決于分子擴(kuò)散進(jìn)入凝膠的機(jī)會(huì)，流速過(guò)快有些分子來(lái)不及在分子篩中分配而流出。

真空冷凍干燥主要分為預(yù)凍、一次干燥和二次干燥。在凍干過(guò)程中要根據(jù)保護(hù)劑特性調(diào)整凍干程序，因此凍干工藝參數(shù)是調(diào)節(jié)凍干程序的重要依據(jù)之一，包括制品的固化溫度和崩解溫度[9]。預(yù)凍階段，保證制品的溫度低于共晶點(diǎn)溫度，使得制品完全凍實(shí)，本次所有凍干曲線(xiàn)的預(yù)凍溫度均設(shè)定為-42℃，保證了制品完全凍結(jié)；一次升華階段，制品的溫度要低于塌陷溫度，防止制品出現(xiàn)局部或者整體塌陷的情況，當(dāng)一次升華溫度設(shè)定為-13℃和-18℃時(shí)，制品溫度始終低于塌陷溫度，制品外觀光滑、疏松，但由于-18℃的設(shè)定溫度偏低，凍干導(dǎo)致制品的殘余水分增加，干燥效率降低，同時(shí)由于殘余水分過(guò)大，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中制品出現(xiàn)了萎縮的現(xiàn)象，使得制品的效力大幅度下降。

5 結(jié)論

狂犬病滅活疫苗下游工藝，純化時(shí)樣品的上樣量為8%柱床體積，洗脫流速為30～40 cm/hr的線(xiàn)性流速，最后純化抗原加入凍干保護(hù)劑冷凍干燥，該生產(chǎn)工藝通過(guò)驗(yàn)證可以滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了狂犬病凍干滅活疫苗下游工藝規(guī)?；a(chǎn)。