魯 瑤 彭蔚蔚 吉 特 朱化春 王 杰 趙紅衛(wèi)廖澤坤 薛艷玲 陳 敏

1（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800）

2（中國科學(xué)院上海高等研究院上海光源 上海 201204）

3（中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

頭發(fā)對哺乳動物來說最重要的是提供隔熱，還包括保護(hù)皮膚免受有害的紫外線輻射，并通過排汗促進(jìn)降溫等好處。人類頭發(fā)橫截面由三個(gè)主要區(qū)域組成：髓質(zhì)層、皮質(zhì)層和表皮層，其中面積最大的區(qū)域就是皮質(zhì)層。皮質(zhì)層中有一種獨(dú)特細(xì)胞器稱為黑素體，黑素體的作用是生成黑色素［1］，黑色素是一種生物多聚體［2］。在人體形成頭發(fā)時(shí)，如果黑素體細(xì)胞制造了數(shù)以千計(jì)的黑色素，頭發(fā)就會染成黑色［3］，可以說黑素體賦予了表皮、頭發(fā)和虹膜等結(jié)構(gòu)顏色，同時(shí)具有許多復(fù)雜的生物學(xué)功能，與阿爾茨海默病、白化病和皮膚癌等不同疾病相關(guān)［4］。

近年來，人類頭發(fā)中的黑素體一直受到廣泛研究關(guān)注。1993年，Hach等［5］用氫氧化鈉從人的頭發(fā)中分離出黑素體，并檢測了各種動物的黑素體的形態(tài)參數(shù)；2000年，Novellino等［6］開發(fā)了一種酶相關(guān)的方法，可以在溫和的條件下從頭發(fā)中分離出黑素體；2002年，賈虹等［7］主要對皮膚中黑素細(xì)胞和黑素作用以及黑素生成的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究；2003年，Liu等［8］同樣使用酶相關(guān)的方法將黑素體分從頭發(fā)中分離出來，并觀察到完整的頭發(fā)黑素體形態(tài)，呈橢球狀，長軸約為1μm，長寬比約為2.5；2012年，Como等［9］研究了不同種族和不同年齡頭發(fā)的黑色素含量和成分，并發(fā)現(xiàn)真黑素的含量隨著年齡的增長而增加；2017年，Takashi等［10］分析了不同年齡段的日本女性的頭發(fā)黑色素，探討了年齡、頭發(fā)顏色、黑素體形態(tài)和黑色素組成之間的關(guān)系。這些工作利用化學(xué)處理后提取出的黑素體進(jìn)行研究，但這種對頭發(fā)的化學(xué)處理有可能會改變黑素體的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，需要一種對頭發(fā)破壞性更小的方法對頭發(fā)中的黑素體的尺寸以及含量進(jìn)行研究。

光熱誘導(dǎo)共振技術(shù)（Photothermal induced resonance，PTIR，也 稱Atomic Force Microscopy Infrared，AFM-IR）是近年來的熱門技術(shù)［11］，在國內(nèi)二維材料的研究中有很多應(yīng)用［12］，但還未應(yīng)用于頭發(fā)中黑素體的研究。它集成了原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy，AFM）和可調(diào)諧紅外激光器，使用AFM尖端來檢測表面分子振動躍遷引起的紅外吸收后的局部熱膨脹，可以突破衍射極限來獲得納米分辨的紅外光譜和化學(xué)成像，具體空間分辨率由探針尖端半徑?jīng)Q定。2014年，Curtis等［13］用AFM-IR研究了白種人男性頭發(fā)脂質(zhì)的分布，在皮質(zhì)層的邊界上清楚地觀察到結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的積累。2018年，Stanic等［14］利用紅外納米光譜技術(shù)對黑白羊毛進(jìn)行了化學(xué)和結(jié)構(gòu)表征，測量分析了羊毛中角蛋白指紋譜以及黑羊毛中黑素體的化學(xué)特性。2020年，F(xiàn)ellows等［15］利用AFM-IR在兩個(gè)光譜區(qū)研究了人頭發(fā)角質(zhì)層的納米形貌和化學(xué)結(jié)構(gòu)。同樣在2020年，在法國SOLEIL光源，Bildstein等［16］在25 nm厚的細(xì)胞間隙直接檢測游離和結(jié)合脂質(zhì)，研究了人頭發(fā)中脂質(zhì)的亞細(xì)胞分布。上述工作充分證實(shí)了AFM-IR研究復(fù)雜生物材料的潛力，可應(yīng)用于頭發(fā)中黑素體的分布和尺寸的原位研究。

本文利用紅外納米光譜技術(shù)對人類頭發(fā)中的黑素體進(jìn)行了研究，在納米尺度下獲得了黑素體的化學(xué)成像以及形貌尺寸和分布等信息，為研究頭發(fā)中的黑素體及其他黑色素相關(guān)的器官提供一個(gè)新視角。

1 實(shí)驗(yàn)方法及樣品制備

1.1 樣品選取及制備

通過光學(xué)顯微鏡以及同步輻射紅外譜學(xué)顯微技術(shù)對若干志愿者的頭發(fā)進(jìn)行篩選，志愿者人種均為蒙古利亞黃種人，挑選出的頭發(fā)具有典型的分布特征，以及確保頭發(fā)的結(jié)構(gòu)是完整的，有髓質(zhì)且無拉伸和破損，具有代表性，選取出進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)的頭發(fā)均出自同一個(gè)人，用去離子水對頭發(fā)清洗備用。

制備同步輻射紅外譜學(xué)顯微技術(shù)所需的樣品時(shí)，用超純水包埋頭發(fā)，用冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片，制備3μm的切片，放置在氟化鋇襯底上。為了在納米AFM-IR測量中獲得較好的成像質(zhì)量，制備AFM-IR樣品時(shí)，將頭發(fā)包埋入樹脂中，制備成80 nm厚的切片，并放置在鍍金襯底上，以此得到黑頭發(fā)和白頭發(fā)橫截面切片樣品。

1.2 同步輻射紅外譜學(xué)顯微

首先在上海光源BL06B線站［17］上進(jìn)行了同步輻射紅外譜學(xué)顯微測量，以確保頭發(fā)樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)完整。紅外顯微鏡光闌設(shè)置為6 mm×6 mm。以2 cm-1的分辨率的同步輻射光源記錄光譜，并使用OPUS軟件對光譜和圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，測得黑頭發(fā)中皮質(zhì)層和髓質(zhì)層的紅外光譜以及化學(xué)成像，可以看到完整的三層結(jié)構(gòu)，清晰地區(qū)分表皮層、皮質(zhì)層和髓質(zhì)層。同步輻射紅外譜學(xué)顯微技術(shù)受到衍射限制，空間分辨率限制在微米量級，無法觀察到黑素體，需要進(jìn)一步利用AFM-IR技術(shù)對黑素體的形貌分布和化學(xué)成分進(jìn)行表征。

圖1 人類黑頭發(fā)切片的化學(xué)成像和紅外光譜(a)黑頭發(fā)在3 280 cm-1的化學(xué)成像，(b)黑頭發(fā)髓質(zhì)層和皮質(zhì)層的紅外光譜Fig.1 Chemical imaging and infrared spectroscopy of human black hair(a)Chemical image of black hair at 3 280 cm-1,(b)IR spectra of medulla and cortex in black hair

1.3 紅外納米光譜和化學(xué)成像

AFM-IR測量使用了Bruker公司的NanoIR3儀器。該儀器配備了QCL激光器組，可采集的光譜范圍為916~1 666 cm-1。在接觸模式下獲取AFM形貌，掃描速率為0.3 Hz，掃描范圍為5~10μm的正方形，圖像分辨率設(shè)為256×256像素。用激光器發(fā)射的紅外光照射掃描尖端和樣品，可以得到樣品上每個(gè)待研究點(diǎn)的紅外光譜，以及特定范圍內(nèi)的化學(xué)成像，光譜分辨率設(shè)置為2 cm-1。形貌圖和紅外譜圖以及化學(xué)成像使用Analysis 3.7軟件處理。

2 分析與討論

2.1 黑素體納米紅外光譜和化學(xué)成像

首先采集了頭發(fā)橫截面的AFM形貌圖（圖2），清晰地觀察到髓質(zhì)層、皮質(zhì)層和表皮層納米尺度下的形貌圖，可以明顯地看出，頭發(fā)三層區(qū)域之間的結(jié)構(gòu)差別。其中，髓質(zhì)層多孔，表皮層由6層結(jié)構(gòu)緊密排列組成，皮質(zhì)層的區(qū)域最大，結(jié)構(gòu)致密，中間夾雜著橢圓形顆粒。

圖2 人類頭發(fā)橫截面不同位置的AFM形貌圖 (a)表皮層，(b)皮質(zhì)層，(c)髓質(zhì)層Fig.2 AFMtopography of human hair cross-section at different locations (a)Cuticle,(b)Cortex,(c)Medulla

進(jìn)一步對黑頭發(fā)和白頭發(fā)的皮質(zhì)層結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。AFM形貌圖（圖3）顯示，皮質(zhì)層均有緊密的蛋白質(zhì)排列，黑頭發(fā)與白頭發(fā)之間存在明顯的形態(tài)差異，黑頭發(fā)形貌圖出現(xiàn)區(qū)別于周圍皮質(zhì)層結(jié)構(gòu)的橢圓形凸起部分，如圖3（a）中箭頭所示，而白頭發(fā)的橫截面形貌圖沒有觀察到這種橢圓狀結(jié)構(gòu)，推測橢圓形結(jié)構(gòu)為黑素體。

圖3 黑頭發(fā)和白頭發(fā)皮質(zhì)層的AFM形貌圖 (a)黑頭發(fā)，(b)白頭發(fā)Fig.3 AFMtopography of cortex in both black hair and white hair (a)Black hair,(b)White hair

利用納米紅外光譜技術(shù)對疑似黑素體的橢圓形結(jié)構(gòu)進(jìn)行了光譜分析，并比較了皮質(zhì)層其他區(qū)域的紅外光譜，如圖4所示。圖4（b）顯示了橢圓形結(jié)構(gòu)的紅外光譜，主要有4個(gè)特征紅外波段：1 122 cm-1處的S=O伸縮振動、1 200~1 300 cm-1范圍的酰胺III帶、1 400~1 600 cm-1范圍的酰胺II帶以及1 600~1 700 cm-1的酰胺I帶。圖4（c）顯示了橢圓型結(jié)構(gòu)之外皮質(zhì)部分的紅外光譜，在1 640 cm-1左右出現(xiàn)明顯的酰胺I帶的峰，在1 530 cm-1出現(xiàn)明顯的酰胺Ⅱ帶的峰，主要成分為蛋白質(zhì)。而橢圓形部分在酰胺I帶II帶和III帶的部分紅外光譜吸收強(qiáng)度較小，蛋白質(zhì)的吸收強(qiáng)度相對皮質(zhì)其他區(qū)域較弱，在1 586 cm-1處出現(xiàn)了皮質(zhì)其他區(qū)域所沒有的明顯的特征峰，該特征峰為C=O伸縮振動，可以判斷該橢圓形結(jié)構(gòu)為黑素體［10］。

圖4 黑頭發(fā)皮質(zhì)層中的黑素體區(qū)域和其他區(qū)域的紅外光譜(a)皮質(zhì)層的AFM形貌圖，(b)黑素體的紅外光譜，(c)皮質(zhì)層非黑素體區(qū)域的紅外光譜Fig.4 Infrared spectra of melanosome and the other region in black hair cortex(a)AFM topography of cortex,(b)Infrared spectrum of melanosome,(c)Infrared spectrum of cortex

利用1 586 cm-1的黑素體特征峰和1 640 cm-1的酰胺I帶蛋白質(zhì)峰對皮質(zhì)層進(jìn)行化學(xué)成像，如圖5（a）所示，可以明確地對黑頭發(fā)皮質(zhì)層中的黑素體進(jìn)行定位。結(jié)合特征光譜分析，在1 586 cm-1成像時(shí)，紅外吸收較強(qiáng)的區(qū)域?yàn)楹谒伢w，在1 640 cm-1成像時(shí)，吸收較強(qiáng)的部分為蛋白質(zhì)。為了更清晰獲得黑素體的形貌和分布信息，對1 586 cm-1和1 640 cm-1處的化學(xué)成像圖的結(jié)果作比，得到圖5（b）的圖像，這樣可以忽略樣品的縱向起伏帶來的誤差，更清晰直觀地定位到黑素體的位置，方便進(jìn)一步分析頭發(fā)中黑素體的形貌尺寸和分布。

圖5 黑頭發(fā)皮質(zhì)層的形貌圖、化學(xué)成像以及處理后的化學(xué)成像(a)黑頭發(fā)皮質(zhì)層的AFM形貌圖和在1 586 cm-1及1 640 cm-1的化學(xué)成像圖，(b)黑頭發(fā)皮質(zhì)層黑素體區(qū)域的1 586 cm-1/1 640 cm-1的3D圖Fig.5 AFMtopography,chemical image and ratio image of black hair cortex(a)AFM topography and the chemical image of black hair cortex at 1 586 cm-1 and 1 640 cm-1,(b)3D view of 1 586 cm-1/1 640 cm-1 ratio in the area of melanosome in black hair cortex

2.2 黑素體形貌和分布

結(jié)合黑素體的形貌圖以及化學(xué)成像圖可以知道，黑頭發(fā)皮質(zhì)區(qū)域中的黑素體直徑大小為200~600 nm，大多數(shù)呈橢球形，有些形狀呈較為細(xì)長的橢球形，有些呈較圓的橢球形。與白種人相比［12］，亞洲人頭發(fā)中的黑素體形狀與其較為相似，但大小與之相比較大，并且緊緊地包裹在皮質(zhì)層蛋白質(zhì)中。

為更準(zhǔn)確分析黑素體的分布情況，把頭發(fā)橫截面中的皮質(zhì)層部分按軸向由中心向外層分成了4個(gè)區(qū)域，由內(nèi)到外按照半徑平分，每個(gè)區(qū)域厚度約為10μm，各區(qū)域內(nèi)1 586 cm-1的化學(xué)成像如圖6（a）所示。選取了4個(gè)樣本，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的4個(gè)區(qū)域內(nèi)的黑素體個(gè)數(shù)，除以每個(gè)區(qū)域的總面積，得到該區(qū)域內(nèi)平均面積中的黑素體個(gè)數(shù)如圖6（b）所示。將平均面積內(nèi)黑素體數(shù)量的散點(diǎn)圖擬合成曲線后，可以清楚地看到，區(qū)域1到4的黑素體數(shù)量是遞增的，區(qū)域1的黑素體數(shù)量最少，區(qū)域4的黑素體數(shù)量最多，表明越靠近表皮層的皮質(zhì)部分黑素體含量越高。頭發(fā)皮質(zhì)層中黑素體是由內(nèi)向外遞增的分布趨勢。

對4個(gè)黑頭發(fā)橫截面切片的皮質(zhì)層在1 586 cm-1進(jìn)行了化學(xué)成像，統(tǒng)計(jì)了黑素體的尺寸信息。利用AFM形貌圖和化學(xué)成像圖，對4個(gè)黑頭發(fā)橫截面切片的4個(gè)區(qū)域內(nèi)共106個(gè)黑素體的長短軸進(jìn)行測量。統(tǒng)計(jì)了長軸和短軸的長度，計(jì)算了長短軸比，假設(shè)黑素體為橢球體［18］，用橢球的體積公式來計(jì)算橢球體的長寬比和體積。

黑素體中長軸和短軸的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖7所示，按圖6（a）中劃分的4個(gè)區(qū)域繪制了形態(tài)參數(shù)統(tǒng)計(jì)圖，縱軸分別代表橢球體的平均長軸、平均短軸、平均長短軸比和平均體積V。為了統(tǒng)一比較，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了平均值計(jì)算。數(shù)據(jù)處理的結(jié)果可知，黑素體長軸的平均值為423 nm，短軸的平均值為337 nm，長軸和短軸比值的平均值為1.26，體積平均值為0.31μm3。結(jié)果顯示：黑素體的長短軸長度和長短軸比例和黑素體的體積在4個(gè)區(qū)域中的差別不大，可見黑素體在頭發(fā)中的分布位置與其尺寸與沒有必然聯(lián)系。

圖6 黑頭發(fā)橫截面中黑素體的化學(xué)成像和分布統(tǒng)計(jì)(a)頭發(fā)橫截面分為4個(gè)區(qū)域的示意圖以及每個(gè)區(qū)域的化學(xué)成像，(b)黑素體在黑頭發(fā)中不同區(qū)域的分布情況Fig.6 (a)Optical microscope image of the hair cross-section divided into four regions,with chemical imaging of each region,(b)Distribution of melanosomes in different regions in black hair

圖7 黑頭發(fā)皮質(zhì)層中的黑素體形態(tài)參數(shù)統(tǒng)計(jì) (a)長軸，(b)短軸，(c)長短軸比，(d)體積VFig.7 Statistics of morphological parameters from melanosomes in black hair samples(a)Major axis,(b)Minor axis,(c)Aspect ratio,(d)Volume V

3 結(jié)語

本文利用紅外納米光譜技術(shù)對頭發(fā)皮質(zhì)層黑素體的形貌、分布和紅外特征光譜進(jìn)行了原位表征，獲得了黑素體的形貌尺寸和分布特征等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黑頭發(fā)皮質(zhì)層中存在大量的黑素體，為長短軸比平均為1.26的橢球形，長軸和短軸平均尺寸分別為423 nm和337 nm，其在黑頭發(fā)皮質(zhì)層中的分布由中心到外層逐漸增多。研究表明：紅外納米光譜技術(shù)可以在納米尺度分辨率下對黑素體的化學(xué)信息和結(jié)構(gòu)分布信息進(jìn)行表征，證明了AFM-IR研究生物樣品納米結(jié)構(gòu)的潛力，為生物樣品的納米尺度的研究提供了一種有效的方法。后續(xù)可繼續(xù)利用該方法，對年齡或性別等差異可能導(dǎo)致的黑素體形態(tài)和化學(xué)性質(zhì)變化進(jìn)行進(jìn)一步研究。

致謝感謝Bruker公司魏琳琳博士和劉耀綸博士在納米紅外實(shí)驗(yàn)方面的幫助，感謝浙江大學(xué)袁文濤教授和徐穎老師在樣品制備方面的幫助。

作者貢獻(xiàn)聲明魯瑤：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析、起草論文；吉特、朱化春、王杰、趙紅衛(wèi)、廖澤坤、薛艷玲：參與實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和論文修訂；彭蔚蔚、陳敏：負(fù)責(zé)整體方案設(shè)計(jì)和修訂審核論文。