燕 鑫 蔡小青 湯喬偉 周 峰 諸 穎 王麗華 胡 鈞,3,4

1（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所中國科學(xué)院微觀界面物理與探測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201800）

2（上海科技大學(xué) 上海 201210）

3（中國科學(xué)院上海高等研究院基礎(chǔ)交叉研究中心張江實(shí)驗(yàn)室 上海 201210）

4（中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

人類大腦是一個(gè)龐大的復(fù)雜體系，有近千億神經(jīng)元，神經(jīng)元之間如何連接以及錯(cuò)誤連接如何導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病，人類迄今仍未探明其中奧秘。阿爾茨海默綜合征、帕金森綜合征以及亨廷頓綜合征等神經(jīng)退行性疾病已嚴(yán)重危害人類健康，因此探索大腦運(yùn)行機(jī)制、尋找相應(yīng)的治療方法迫在眉睫［1］。國際上美國腦科學(xué)計(jì)劃（BRAIN Initiative）、歐洲腦計(jì)劃（The Human Brain Project）以及日本腦計(jì)劃（Brain/Minds Project）均致力于此［2］。中國的腦計(jì)劃（China Brain Project）研究也已啟動(dòng)，該計(jì)劃有望幫助我們理解大腦不同區(qū)域的細(xì)胞類型和神經(jīng)元細(xì)胞之間的連接方式，同時(shí)對腦功能的神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ)也將有一個(gè)全方位的認(rèn)識［3］。目前人腦的結(jié)構(gòu)及其功能主要依賴于光學(xué)、核磁等商業(yè)化技術(shù)來解析。然而，受限于成像技術(shù)的視場、分辨率、速度等，目前仍難以在單細(xì)胞水平上對人腦組織進(jìn)行快速高分辨成像來獲得人腦的精細(xì)結(jié)構(gòu)圖像，從而無法進(jìn)一步了解腦相關(guān)疾病與神經(jīng)細(xì)胞變化之間的相互關(guān)系［4］。近年來，基于大科學(xué)裝置的先進(jìn)成像方法——同步輻射X射線成像技術(shù)或?qū)⒊蔀槔L制人腦介觀尺度連接組圖譜的重要手段。相較于光學(xué)成像來說，同步輻射X射線成像擁有各向同性分辨率，成像分辨率不受Z軸限制；穿透深度高，可滿足mm3體積大小的組織塊成像；成像速度快（1 mm3·min-1）等特點(diǎn)。上述優(yōu)點(diǎn)使其大大降低了多組數(shù)據(jù)配準(zhǔn)的工作量和難度，針對于人腦成像，可大大節(jié)省數(shù)據(jù)獲取的時(shí)間，這也是目前成像速度最快的三維成像手段［5］。

對人腦來說，一些常規(guī)的熒光標(biāo)記技術(shù)，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，基于腺病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）、狂犬病毒（Rabies Virus，RV）等病毒標(biāo)記技術(shù)無法用于活體人腦組織標(biāo)記，這極大地限制了熒光成像技術(shù)在人腦連接圖譜研究上的應(yīng)用。高爾基染色法是基于重金屬Cr、Hg和Ag的腦組織神經(jīng)細(xì)胞的染色標(biāo)記方法，適用于同步輻射X射線腦組織成像。但捐贈的人腦組織存在死亡延遲時(shí)間（Postmortem Delay，PMD），大部分捐贈的人腦PMD在6~8 h，有些甚至在數(shù)天之久［6］。腦組織的死后變化是不可避免的，導(dǎo)致難以辨別大腦中精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化是死前的生理性改變還是PMD造成的改變［6］。因此，PMD是影響人腦組織高爾基染色的一個(gè)關(guān)鍵因素，但PMD如何影響人腦組織神經(jīng)元的高爾基染色尚不明確。此外，對比未經(jīng)灌注與0.9%NaCl溶液灌注過的大腦染色情況，未經(jīng)灌注的大腦染色后血管會影響神經(jīng)元染色后成像的信噪比，同時(shí)，經(jīng)過福爾馬林或4%多聚甲醛溶液固定過的腦組織也會導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞染色，影響高爾基染色的效果［7］。

本工作采用離體后不同放置時(shí)間的小鼠腦組織來模擬人死亡后腦神經(jīng)細(xì)胞的變化，設(shè)置不同的時(shí)間間隔，采用高爾基染色、尼氏染色對取腦后不同放置時(shí)間的小鼠大腦皮層區(qū)域進(jìn)行染色和光學(xué)顯微鏡成像，利用上海光源BL13HB成像線站的同步輻射X射線微米CT成像技術(shù)對小鼠大腦皮層區(qū)域的錐體神經(jīng)元進(jìn)行高分辨率的X射線成像，獲得取腦后不同放置時(shí)間小鼠大腦皮層區(qū)域的同步輻射X射線三維成像圖，探究小鼠大腦皮層區(qū)域錐體神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化規(guī)律［8］。該工作有望對人腦組織高爾基染色方法的建立和同步輻射X射線人腦成像奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

HITO Golgi-cox Optimstain Kit（高爾基試劑盒），Hito Dual-safe Gelatin-coated Slide購自上海南科生物科技有限公司；二甲苯，無水乙醇，多聚甲醛，蔗糖購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；尼氏染液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

直立式顯微鏡Axio Imager 2，德國ZEISS公司；石蠟包埋機(jī)EG 1150，德國徠卡公司；冷凍切片機(jī)Leica CM1950，德國徠卡公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡C57小鼠，雌性，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，SPF級，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：ACSHU-2014-200，2014年7月15日批準(zhǔn)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

8周齡的成年C57雄性小鼠飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室恒溫層流架中，合籠飼養(yǎng)，每籠隨機(jī)分配5~6只，給予足夠的水和飼料供它們自由攝取。所有小鼠隨機(jī)分為7組，用于不同需求的染色。腹腔注射過量的1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，使其失去知覺，仰臥位置于解剖臺上。由腹部開口直至打開胸腔，剝離心包膜暴露出心臟，將針頭插入心尖處，固定好灌注所需針頭，剪斷左心室，持續(xù)勻速緩慢灌注40 mL生理鹽水，確保小鼠體內(nèi)血液得到充分置換，直至肝臟由棕褐色變?yōu)榈咨?，停止灌注。小鼠灌注后，立即手術(shù)剝離小鼠的整個(gè)腦組織并保持其完整性，用生理鹽水洗滌后，浸入其中，置于室溫中保存。

2.2 Golgi-Cox染色

全腦組織室溫下放置0 h、12 h、60 h后取出，置于新配制的Golgi-Cox染色液中，鋁箔紙遮光，在25℃培養(yǎng)箱中染色96 h。染色完成后將其沉入30%蔗糖溶液中，4℃低溫脫水3 d，每24 h換液一次。用于光鏡觀察的樣品用冷凍包埋劑包埋，使用冷凍切片機(jī)獲得100μm腦組織薄切片置于載玻片上，依次浸入超純水，還原顯色劑，50%、70%、100%乙醇中脫水，然后在二甲苯中透明，最后封片低溫保存。該實(shí)驗(yàn)主要采用蔡司光學(xué)顯微鏡，獲取腦組織樣本切片的皮層區(qū)5×、10×、20×、40×和100×（油鏡）的圖像。實(shí)驗(yàn)中得到的原始圖像經(jīng)過ImageJ處理，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的Sholl analysis和神經(jīng)元樹突棘的密度統(tǒng)計(jì)，并對神經(jīng)元樹突棘的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行Ordinary單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2.3 尼氏染色

冷凍切片機(jī)將冷凍包埋的腦組織切成50μm的薄片，置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行浮片染色。超純水洗滌3~5 s后，加入尼氏染液進(jìn)行染色，放置在37°C培養(yǎng)箱中恒溫染色15~20 min，使其染色更均勻。染色完成后用超純水洗滌兩次，再分別用50%、75%、100%乙醇脫水，將浮片轉(zhuǎn)移至載玻片，浸泡在充滿二甲苯的染色缸中透明后封片，采用蔡司光學(xué)顯微鏡拍攝40×圖像以觀察染色情況，使用ImageJ對原始圖像進(jìn)行二值化以獲得染色細(xì)胞所占面積比，對其結(jié)果進(jìn)行Ordinary單因素方差分析。

2.4 同步輻射X射線微米CT成像

本實(shí)驗(yàn)在上海同步輻射光源（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF）的X射線生物醫(yī)學(xué)成像光束線BL13HB完成，主要通過局部CT、相襯成像等實(shí)現(xiàn)在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)和古生物學(xué)的應(yīng)用研究，可以實(shí)現(xiàn)0.8μm的空間分辨率和1 ms的時(shí)間分辨率［9］。通過X射線微米CT成像實(shí)現(xiàn)低劑量、無損、高分辨率、動(dòng)態(tài)和三維的X射線成像，以了解軟組織的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)［10-11］。

用于同步輻射X射線成像的腦組織樣品采用Golgi-Cox染色，染色后將全腦依次浸入超純水，還原顯色劑，30%、50%、75%、90%、95%、100%酒精、無水乙醇-二甲苯（1:1）、二甲苯和石蠟中依次脫水后，將全腦包埋在石蠟中并在室溫下儲存，成像之前將其切成1 mm的厚切片。

在實(shí)驗(yàn)過程中，對皮層區(qū)腦組織的局部區(qū)域進(jìn)行了斷層顯微成像，將樣品固定在樣品臺的中央，并保證其與光路垂直。為了獲得最佳的神經(jīng)元相位對比圖像，采用單色光X射線進(jìn)行成像，最佳能量為20.0 keV。進(jìn)行局部CT掃描時(shí)，樣品到探測器的距離為5 cm，旋轉(zhuǎn)臺每隔0.1°旋轉(zhuǎn)180°，曝光時(shí)間為200 ms，獲取1 800張圖像。在拍攝過程中需要同時(shí)采集光路中無樣品時(shí)的白場圖像和無光照射時(shí)的暗場圖片。

所有二維原始投射圖像使用ImageJ和ImageJ Plus圖像處理軟件進(jìn)行處理，考慮到腦組織中不同的結(jié)構(gòu)特征和灰度分布，通過調(diào)整對比度、設(shè)置適當(dāng)?shù)臑V波參數(shù)等方法，降低圖像背景噪聲獲取最佳的投影圖像，利用Octopus實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的重構(gòu)，結(jié)合可視化軟件Amira可視化小鼠腦中神經(jīng)元的分布［12］，顯示小鼠腦矢狀面中不同層次的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的渲染。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 Golgi-cox染色光學(xué)成像

1873年，卡米洛·高爾基發(fā)明了高爾基染色法，可以觀察完整神經(jīng)組織的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)，高爾基也因此在1906年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。高爾基染色至今仍是神經(jīng)元染色的金標(biāo)準(zhǔn)，為神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。目前普遍認(rèn)為，高爾基染色法作為經(jīng)典的神經(jīng)元染色方法，能夠隨機(jī)標(biāo)記3%~5%的神經(jīng)元，但可以顯示出神經(jīng)元的完整形態(tài)結(jié)構(gòu)［13-14］。高爾基染色法經(jīng)過自誕生以來一百多年的改進(jìn)和發(fā)展，主要發(fā)展為三大類：快速高爾基染色、Golgi-Kopsch染色和Golgi-Cox染色［15］。Golgi-Cox染色神經(jīng)元的基本原理尚不完全清楚［16］，改善染色方法的因素也不確定，如灌注方式、溫度和時(shí)間等均會影響染色效果，因此優(yōu)化條件以改進(jìn)Golgi-Cox染色。Golgi-Cox染色［17］的效果會受到未灌注腦組織中血管的影響，染色的血管與神經(jīng)元交織在一起，增加了圖像的背景噪聲。通過改良Golgi-Cox染色法的時(shí)間，大大降低血管被標(biāo)記的概率，提高光鏡下圖像的信噪比。該實(shí)驗(yàn)采用HITO染色試劑盒，改進(jìn)后的Golgi-Cox染色方便、高效。

對取腦后間隔不同時(shí)間的腦組織進(jìn)行Golgi-Cox染色（圖1（a））切片后，用光鏡對腦組織切片中的皮層區(qū)進(jìn)行光學(xué)顯微成像，獲得小鼠大腦皮層區(qū)域錐體神經(jīng)元成像圖（圖1（b）），并對其神經(jīng)元形態(tài)的變化畫出了示意圖，以便更加清晰直觀地觀察神經(jīng)元的形態(tài)變化。由此可見，取腦后間隔不同時(shí)間對其進(jìn)行神經(jīng)元染色，在12 h后被浸染的神經(jīng)元明顯減少、形態(tài)逐漸不完整，60 h后神經(jīng)元浸染多為胞體，神經(jīng)元形態(tài)不完整。神經(jīng)元隨著腦組織離體時(shí)間增加逐漸凋亡和消失，且神經(jīng)元的消失是從末端開始的，胞體最后消失。

圖1 小鼠死亡延遲后的大腦Golgi-Cox染色及光學(xué)成像(a)小鼠死亡延遲后的大腦進(jìn)行Golgi-Cox染色的示意圖，(b)高爾基染色后的腦組織光學(xué)顯微成像圖及對應(yīng)神經(jīng)元簡圖Fig.1 Golgi-Cox staining and light microscopy of postmortem mouse brain(a)Schematic diagram of Golgi-Cox staining of post-mortem mouse brain,(b)Light micrographs of brain tissue after Golgi staining and sketch of corresponding neurons

3.2 小鼠大腦皮層錐體神經(jīng)元形態(tài)分布

樹突和軸突的形態(tài)決定了神經(jīng)元如何處理和傳遞信息。多年來，Sholl analysis［18］一直被用來分析神經(jīng)元的形態(tài)、樹突分支和復(fù)雜性。Sholl analysis是一種通過研究神經(jīng)元的軸突和樹突形態(tài)來定量分析神經(jīng)元復(fù)雜度的方法，以神經(jīng)元胞體為圓心（不包括胞體）間隔相同距離作同心圓，獲得與神經(jīng)元分支交點(diǎn)的個(gè)數(shù)，以此來反映神經(jīng)元的復(fù)雜程度。為了驗(yàn)證離體時(shí)間對神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性的影響，對Golgi-Cox染色的腦組織切片中神經(jīng)元的光學(xué)顯微圖像進(jìn)行了Sholl analysis定量分析大腦神經(jīng)元的復(fù)雜性變化（圖2（a））。通過對神經(jīng)元進(jìn)行Sholl analysis，量化了神經(jīng)元離體后形態(tài)復(fù)雜性的變化程度，更直觀地觀察神經(jīng)元形態(tài)的變化趨勢，神經(jīng)元的復(fù)雜性隨著時(shí)間的增長而降低，完整性也隨之降低。

近幾十年來，老年人口不斷增加，隨之而來的是神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ?、帕金森病等）患者增多。突觸可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)，在突觸重塑過程中，樹突棘的數(shù)量和形狀經(jīng)歷了動(dòng)態(tài)重組［19］。突觸的形成和消除對于建立神經(jīng)元回路和執(zhí)行大腦功能至關(guān)重要。樹突棘大多位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性神經(jīng)傳遞的突觸后膜，通常被認(rèn)為是突觸形成的標(biāo)志［20］。樹突棘是位于神經(jīng)元樹突上的一個(gè)突觸部位，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。高爾基染色利用了神經(jīng)元的嗜銀特性展現(xiàn)神經(jīng)元和樹突棘的形態(tài)。雖然樹突棘的數(shù)量與突觸活動(dòng)量并不直接相關(guān)，但樹突棘密度統(tǒng)計(jì)可用于評估突觸連接和突觸可塑性變化的過程［21］。因此，樹突棘密度統(tǒng)計(jì)在神經(jīng)科學(xué)研究中被廣泛使用，人工統(tǒng)計(jì)樹突棘是很耗時(shí)的，但很準(zhǔn)確。

通過使用蔡司光學(xué)顯微鏡對Golgi-Cox染色的腦組織切片中的樹突棘進(jìn)行100×油鏡景深拍攝，獲取皮層區(qū)域的樹突棘成像。樹突棘的染色數(shù)量隨著時(shí)間的增加而減少（圖2（b）），這一趨勢與Sholl analysis一致。同時(shí)對樹突棘密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行Ordinary單因素方差分析（One-way ANOVA），p＜0.000 1，證明組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 室溫下皮層區(qū)神經(jīng)元Golgi-Cox染色的Sholl analysis和樹突棘密度統(tǒng)計(jì)(a)室溫下Golgi-Cox染色后的死亡延遲大腦的皮層區(qū)神經(jīng)元Sholl analysis，(b)樹突棘密度統(tǒng)計(jì)（****p＜0.000 1）Fig.2 Sholl analysis and dendritic spine density statistics of Golgi-Cox staining of cortical neurons at room temperature(a)Sholl analysis of cortical neurons of post-mortem mouse brain after Golgi-Cox staining at room temperature,(b)Dendritic spine density statistics(****p＜0.000 1)

3.3 同步輻射X射線成像

圖像采集和處理時(shí)間長導(dǎo)致繪制大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接圖譜成為一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作，但是利用同步輻射X射線成像可以克服以上挑戰(zhàn)。同步輻射X射線成像具有各向同性的空間分辨率，能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高通量的神經(jīng)元成像，加速了全腦神經(jīng)元的三維可視化，通過對小鼠大腦中的神經(jīng)元進(jìn)行成像驗(yàn)證了這一點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)全腦圖譜的構(gòu)建不僅需要提高分辨率，還需要減少數(shù)據(jù)采集和處理的時(shí)間，包括兩個(gè)方面：快速圖像采集和快速圖像處理，使圖像處理的時(shí)間與原始圖像采集的時(shí)間相當(dāng)。

同步輻射X射線成像利用物質(zhì)密度不同產(chǎn)生不同的X射線吸收對比度來產(chǎn)生圖像襯度。未被染色的腦組織對X射線的吸收程度相似，不能產(chǎn)生有效的吸收對比度來實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元成像。Golgi-Cox染色液含有重金屬元素汞，被用來特異性的稀疏標(biāo)記神經(jīng)元以及樹突棘等精細(xì)結(jié)構(gòu)且不會干擾背景，確保了適當(dāng)?shù)腦射線吸收成像對比度來成像神經(jīng)元及其精細(xì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)也緩解了神經(jīng)元高密度染色造成的成像信噪比降低的問題，以此獲得具有高對比度和高時(shí)空分辨率的圖像。但是，每個(gè)腦組織樣品只能獲得部分神經(jīng)元及其連接的圖像，因此獲取完整的神經(jīng)元成像需要更多的樣品。

大腦皮層是高級神經(jīng)活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是錐體神經(jīng)元密集分布的地方。在本實(shí)驗(yàn)中對小鼠大腦皮層區(qū)域進(jìn)行了同步輻射X射線微米CT成像，用Amira軟件進(jìn)行三維可視化并獲得了小鼠大腦皮層區(qū)域錐體神經(jīng)元三維成像圖（圖3）。同步輻射X射線成像所獲得的結(jié)果與光鏡下所得結(jié)果相同，隨著腦組織死亡延遲時(shí)間的增長，神經(jīng)元細(xì)胞隨之發(fā)生溶解，神經(jīng)纖維逐漸變短直至消失。

圖3 大腦皮層區(qū)矢狀面不同時(shí)間的三維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成像Fig.3 Three-dimensional neural network imaging at different time nodes in the sagittal plane of brain cortical

3.4 尼氏染色

尼氏體作為神經(jīng)元的特征結(jié)構(gòu)廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞中，可以被堿性染料染色，在光學(xué)顯微鏡下呈小顆?；驂K狀，電鏡下可觀察到粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體。尼氏體主要負(fù)責(zé)合成神經(jīng)元正常生理活動(dòng)所需的蛋白質(zhì)，尼氏體的存在與消失可以判斷神經(jīng)細(xì)胞是否受損。當(dāng)神經(jīng)元受損時(shí)，尼氏體會溶解甚至消失，數(shù)量也會明顯減少［22］。當(dāng)對小鼠腦組織進(jìn)行尼氏染色，尼氏染色液中的有效成分甲酚紫與RNA或DNA結(jié)合，將尼氏小體染成藍(lán)紫色。光鏡得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，隨著取腦間隔時(shí)間的增加，尼氏小體的數(shù)量減少并消失（圖4）。同時(shí)對其結(jié)果進(jìn)行Ordinary單因素方差分析（One-way ANOVA），p＜0.000 1，證明組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著時(shí)間的增加，神經(jīng)細(xì)胞受到破壞和溶解，與Golgi-cox染色和同步輻射X射線成像的結(jié)果相吻合。同時(shí)驗(yàn)證了神經(jīng)元細(xì)胞特別是神經(jīng)纖維隨著死亡延遲時(shí)間的增加逐漸減少甚至消失，但Golgi-Cox染色液對神經(jīng)元的染色效率不會隨著細(xì)胞凋亡而降低。

圖4 死亡延遲的腦皮層區(qū)尼氏染色的光學(xué)成像及統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(****p＜0.000 1)Fig.4 Light microscopic imaging and statistical data of Nissl staining in cortical of post-mortem mouse brain(****p＜0.000 1)

4 結(jié)語

本工作用放置不同時(shí)間的鼠腦樣品來模擬死亡的人腦，探討死亡延遲時(shí)間對鼠腦高爾基染色的影響。采用光學(xué)顯微成像與同步輻射成像相結(jié)合的方法，同時(shí)獲取二維與三維的神經(jīng)元形態(tài)信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并對比分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：放置不同時(shí)間后的鼠腦樣品，隨著時(shí)間的增長，神經(jīng)元逐漸降解消失，其復(fù)雜性和完整性逐漸降低，但對Golgi-Cox染色液的吸收程度不會降低。該工作對探究人腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的超微結(jié)構(gòu)染色分析提供了新的思路，有助于更好地了解神經(jīng)元的連接方式，對神經(jīng)性疾病的研究也是至關(guān)重要。

作者貢獻(xiàn)說明燕鑫負(fù)責(zé)完成實(shí)驗(yàn)的主體部分，包括Golgi-Cox染色、尼氏染色的光鏡成像和同步輻射X射線微米CT成像實(shí)驗(yàn)；周峰負(fù)責(zé)小鼠隨機(jī)實(shí)驗(yàn)分組和小鼠腦組織冷凍切片；湯喬偉和燕鑫負(fù)責(zé)成像數(shù)據(jù)處理和三維重構(gòu)；燕鑫和蔡小青撰寫文稿；蔡小青設(shè)計(jì)和指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；諸穎、王麗華、胡鈞構(gòu)思文稿主體思路并全程指導(dǎo)文稿修改。所有作者都參與了文稿的多次討論和修改。