劉小華，魏繼福

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210000

腎移植被認(rèn)為是終末期腎臟病患者最有效的腎臟替代治療方式之一［1］。與透析相比，腎移植患者的生活質(zhì)量更高［2］。但一些腎移植相關(guān)的并發(fā)癥，如急性排異、慢性移植物功能障礙、免疫抑制劑相關(guān)的腎毒性，增加了慢性腎臟病患者對(duì)移植的擔(dān)憂(yōu)［3-4］。此外，腎移植后發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥如急性排異會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致移植物失功，慢性移植物功能障礙風(fēng)險(xiǎn)增加［5］。因此，了解急性排異的病理生理機(jī)制對(duì)腎移植患者短期及長(zhǎng)期預(yù)后至關(guān)重要。

血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）是定位于細(xì)胞膜上，屬免疫球蛋白超家族的黏附分子，其分子量為110 kDa。它特異地與白細(xì)胞（除中性粒細(xì)胞外）所產(chǎn)生的屬I(mǎi)ntegrin家族的黏附分子VLA-4結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等多種病理過(guò)程中發(fā)揮作用［6］。較多研究顯示，VCAM1與移植排異相關(guān)［7］。本研究旨在探討VCAM1 rs2392221 基因多態(tài)性與腎移植術(shù)后急性排異發(fā)生之間的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

入選2011 年2 月—2015 年12 月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎移植的200 例患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～60歲；②腎移植術(shù)后至少3個(gè)月內(nèi)肌酐穩(wěn)定［肌酐＜120 μmol/L，3 個(gè)月內(nèi)未發(fā)生急性排異、腎功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）或者機(jī)會(huì)性感染］；③腎移植術(shù)后隨訪(fǎng)6 個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①慢性病毒感染如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病患者；②妊娠患者。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2016-SR-029），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

根據(jù)Banff 15標(biāo)準(zhǔn)診斷急性排異的患者。根據(jù)間質(zhì)浸潤(rùn)和動(dòng)脈內(nèi)膜炎的程度對(duì)AR 進(jìn)行評(píng)分［8］。隨訪(fǎng)期間發(fā)生急性排異的患者納入AR 組，未發(fā)生急性排異的患者納入非AR組。收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、身高、急性排異發(fā)生的情況、移植DGF的情況以及腎移植患者的免疫用藥方案。

1.2.1 基因檢測(cè)

檢測(cè)步驟：①收集患者的外周血樣本2 mL。提取DNA 后，利用瓊脂糖凝膠電泳定量分析基因組DNA（gDNA）的濃度和純度，并對(duì)基因完整性進(jìn)行評(píng)估；②gDNA 被添加到含上游和下游特異性的目標(biāo)區(qū)域的寡核苷酸混合物中。應(yīng)用非接觸式超聲波破碎儀（Diagenode，比利時(shí)）裂解gDNA。裂解后進(jìn)行末端修飾，添加接頭，PCR 擴(kuò)增；③擴(kuò)增后按照制造商說(shuō)明書(shū)將DNA 加載到Illumina cBot 儀器中，再基于人類(lèi)參考基因組hg19 數(shù)據(jù)使用Genome Analysis Tool Kit、Picard軟件和dbSNP 132進(jìn)行分析。

1.2.2 免疫抑制治療

所有移植受者的免疫誘導(dǎo)方案為巴利昔單抗。免疫維持方案為3 種或4 種免疫抑制藥物：環(huán)孢素或他克莫司聯(lián)合霉酚酸酯和潑尼松，加或不加西羅莫司。免疫抑制藥物的劑量根據(jù)患者血肌酐水平及血藥濃度調(diào)整。當(dāng)患者出現(xiàn)急性排異時(shí)，糖皮質(zhì)激素方案為甲強(qiáng)龍200 mg/d，沖擊治療3～5 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。計(jì)數(shù)資料用率表示。采用Logistic 回歸分析基因型分布與急性排異的關(guān)聯(lián)性，并計(jì)算各模型相關(guān)的比值比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confident interval，CI）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

研究共納入200 例腎移植患者，男124 例，女76 例。200 例中有69 例（男42 例，女27 例）發(fā)生至少1次急性排異。2組患者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 2組患者的一般資料比較Table 1 Comparison of baseline characteristics between AR and non?AR subjects

2.2 VCAM1 rs2392221基因多態(tài)性與AR的相關(guān)性

對(duì)VCAM1 rs2392221 與AR 發(fā)生之間的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，VCAM1 rs2392221基因多態(tài)性與AR的發(fā)生顯著相關(guān)。共顯性模型CCvs.CT：OR=3.71，95%CI：1.82～7.58；CCvs.TT：OR=5.41，95%CI：1.14～25.75，P＜0.001；顯性模型OR=3.90，95%CI：1.97～7.72，P＜0.001；隱性模型OR=3.57，95%CI：0.77～16.54，P=0.357；超顯性模型OR=3.31，95%CI：1.65～6.65，P=0.002；加性模型OR=3.04，95%CI：1.70～5.43，P=0.034（表2）。

表2 rs2392221基因多態(tài)性與急性排異發(fā)生相關(guān)性分析Table 2 Results of multiple inheritance analysis of rs2392221 with the occurrence of acute rejection in five models

3 討論

細(xì)胞黏附分子與白細(xì)胞向炎癥部位的轉(zhuǎn)運(yùn)和聚集密切相關(guān)，如巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞。近年來(lái)研究顯示，VCAM1 可能與免疫相關(guān)疾病的進(jìn)展顯著相關(guān)，如移植排異。由于器官移植供者或受者不匹配，所以移植后會(huì)發(fā)生移植排斥反應(yīng)。移植排斥反應(yīng)是由白細(xì)胞向炎癥部位浸潤(rùn)引起的。淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在排斥反應(yīng)中起核心作用，并最終導(dǎo)致移植物損傷［9-12］。移植排斥反應(yīng)是受者白細(xì)胞和供者內(nèi)皮細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用。在過(guò)去幾十年里，許多關(guān)于移植排斥的研究顯示VCAM1 在移植器官的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，包括肝、腎、肺和心臟。Lautenschlager 等［13］研究顯示，肝移植患者發(fā)生急性排異時(shí)，VCAM1 在血管內(nèi)皮表達(dá)顯著增加。Hill等［14］研究顯示在腎移植排斥反應(yīng)中，VCAM1 在腎小管周毛細(xì)血管內(nèi)皮表達(dá)上調(diào)，且主要表達(dá)于小管基底外側(cè)表面。心臟移植患者發(fā)生急性排異時(shí)心肌內(nèi)膜活檢也顯示VCAM1表達(dá)增加［15］。此外，Hart等［16］研究顯示VCAM1 在造血干細(xì)胞移植也起到重要作用。因此，VCAM1的表達(dá)可能在移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并可能成為移植排斥反應(yīng)的生物標(biāo)志物。但目前缺乏VCAM1 基因多態(tài)性與移植排異相關(guān)性的研究。

VCAM1 rs2392221突變首次發(fā)現(xiàn)與腎移植急性排異相關(guān)。根據(jù)本研究結(jié)果，常規(guī)開(kāi)展VCAM1 rs2392221 基因檢測(cè)是優(yōu)化腎移植患者維持免疫治療方案的直接方法。通過(guò)基因分析，提前對(duì)潛在腎移植AR 患者進(jìn)行鑒別，可以幫助早期診斷急性排異，及時(shí)調(diào)整腎移植患者免疫抑制方案，改善腎移植患者預(yù)后。當(dāng)然，本研究也存在較多不足，首先本研究未對(duì)VCAM1 基因其他已報(bào)道過(guò)的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和分析［17］，其次本研究未分析腎臟病理與VCAM1 rs2392221的相關(guān)性。未來(lái)需要更大更多的臨床研究以及體外功能試驗(yàn)來(lái)證實(shí)我們的觀點(diǎn)。

綜上，本研究顯示VCAM1 rs2392221 基因多態(tài)性與腎移植患者急性排異的發(fā)生顯著相關(guān)，VCAM1 rs2392221的基因檢測(cè)可能有助于移植排異的早期診斷及治療。