周 濤， 彭 輝， 喻望晨， 劉寧芳， 胡龍興， 徐 倩

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系， 湖南 長(zhǎng)沙 410128)

籽粒莧是莧科莧屬一年生草本粒用植物的統(tǒng)稱，包括千穗谷(Amaranthushypochondriacus)、老鴉谷(A.cruentus)、尾穗莧(A.caudatus)、綠穗莧(A.hybridus)等。千穗谷為籽粒莧的一種，起源于美洲，目前主要分布于溫帶和熱帶地區(qū)，在平原和高海拔地區(qū)均有分布。千穗谷具有根系發(fā)達(dá)、吸肥力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，是一種糧飼兼用型作物,其莖葉可作蔬菜，種子可食用或釀酒，也可栽培觀賞[1-3]。千穗谷耐酸、耐鹽堿，具有較強(qiáng)的抗旱性和耐受重金屬的能力，可作為土壤修復(fù)和生態(tài)恢復(fù)類型植被[4-6]。

TCP(Teosinte branched1/cycloidea/proliferating cell factor)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與植物多種器官的生長(zhǎng)發(fā)育與形態(tài)建成。目前已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、番茄(Solanumlycopersicum)、胡楊(Populuseuphratica)和白菜(Brassicarapa)中分別鑒定到24,30,21,30,36和39個(gè)TCP成員[7-11]。TCP的命名來自于三個(gè)蛋白的首字母縮寫——玉米(Zeamays)中參與頂端優(yōu)勢(shì)調(diào)節(jié)的TEOSINTE BRANCHED1(TB1)、金魚草(Antirrhinummajus)中控制花不對(duì)稱性的CYCLOIDEA(CYC)以及水稻中參與分生組織表達(dá)的PROLIFERATING CELL FACTOR1(PCF1)和PCF2[12-14]。TCP蛋白的N端均包含一個(gè)高度保守的TCP結(jié)構(gòu)域，由59個(gè)氨基酸構(gòu)成，屬于非典型的bHLH結(jié)構(gòu)[13]。根據(jù)該結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的差異，該家族可分為兩類：ClassⅠ(PCF)和ClassⅡ[15]，其中，ClassⅡ可以進(jìn)一步分為CIN和CYC/TB1兩個(gè)分支[16]。與ClassⅡ亞家族相比，ClassⅠ在bHLH結(jié)構(gòu)的Basic區(qū)域有一個(gè)四氨基酸的缺失[17]。

TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段均有重要作用[18-19]，包括葉片形態(tài)建成[20]、花器官發(fā)育[21]、根的生長(zhǎng)和分蘗形成[22]等。白菜中的BrTCP7通過促進(jìn)茉莉酸生物合成基因BrOPR3和葉綠素分解代謝基因BrRCCR的表達(dá)，從而促進(jìn)葉片衰老[23]。毛竹(Phyllostachysedulis)中PeTCP10基因可通過MeJA途徑負(fù)調(diào)控側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育[24]。在擬南芥花中，AtTCP15通過調(diào)控IAA合成基因YUC1和YUC4影響IAA的合成[25]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，TCP轉(zhuǎn)錄因子可以提高植物對(duì)多種生物脅迫和非生物脅迫的抗性。比如，香蕉(Musanana)TCP基因家族大部分基因響應(yīng)低氮脅迫的誘導(dǎo)，并且調(diào)節(jié)香蕉缺氮時(shí)的逆境響應(yīng)[26]。馬鈴薯(Solanumtuberosum)TCP轉(zhuǎn)錄因子StTCP13能提高大腸桿菌對(duì)高鹽脅迫的耐受性[27]。擬南芥CYC分支成員AtTCP18蛋白能和植原體效應(yīng)因子SWP1互作，參與植物防御進(jìn)程[28]。水稻中過表達(dá)OsTCP21基因可增強(qiáng)水稻對(duì)RRSV病毒的抵抗力[29]。

microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA[30]，在基因表達(dá)過程中起負(fù)調(diào)控作用[31]。前人研究發(fā)現(xiàn)miR319的主要靶基因?yàn)門CP基因，且以ClassⅡ亞家族中的CIN分支基因成員為主，通過抑制它們的表達(dá)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)逆境的響應(yīng)[32]。比如，水稻中miR319通過調(diào)控OsTCP21和OsGAmyb基因的表達(dá)使水稻分蘗減少、籽粒產(chǎn)量降低[33]；梅(Prunusmume)中發(fā)現(xiàn)的Pm-miR319a可以通過調(diào)控靶基因PmTCP4的表達(dá)間接調(diào)控梅花雌蕊的發(fā)育[34]。

千穗谷最新基因組于2017年發(fā)布[35]，但關(guān)于千穗谷TCP基因家族的系統(tǒng)研究未見報(bào)道。本研究擬采用生物信息學(xué)手段，對(duì)千穗谷TCP基因家族進(jìn)行鑒定和特征分析，包括基因序列特征、結(jié)構(gòu)域比較、蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)、近源物種系統(tǒng)進(jìn)化分析、染色體定位、啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)、組織特異性表達(dá)等多個(gè)方面，為千穗谷TCP基因的功能研究和千穗谷分子育種提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 千穗谷TCP基因家族成員的鑒定

從Plant TFDB v5.0(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載千穗谷TCP蛋白序列，并在Phytozome v13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast搜索，得到基因序列全長(zhǎng)。通過在線工具HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)分析所有蛋白的結(jié)構(gòu)域，保留所有含有典型TCP結(jié)構(gòu)域的基因。

1.2 千穗谷TCP 基因及蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用ExPASy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)千穗谷TCP蛋白的分子量(Molecular weight，MWs)、等電點(diǎn)(Isoelectric point，pIs)、平均親水性(Grand average of hydropathicity)等信息。利用GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/index.php)在線網(wǎng)站繪制千穗谷TCP的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。利用軟件MEME[36]預(yù)測(cè)蛋白保守Motif，使用TBtools[37]軟件繪制千穗谷TCP基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)圖。

1.3 多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用Clustal W[38]軟件對(duì)千穗谷、擬南芥、水稻的蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。千穗谷多重序列比對(duì)結(jié)果使用GeneDoc軟件進(jìn)行展示，分析不同家族的特征結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega7[39]軟件構(gòu)建，算法采用鄰近法，使用Evolview(https://www.evolgenius.info/evolview/)展示構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。擬南芥以及水稻TCP基因家族數(shù)據(jù)下載于Plant TFDB v5.0(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)。

1.4 基因染色體定位和蛋白亞細(xì)胞定位

通過BioEdit軟件對(duì)千穗谷每一個(gè)TCP家族成員進(jìn)行本地BLAST搜索比對(duì)，以確定其在染色體中的定位，通過MG2C v2.1(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)在線網(wǎng)站對(duì)TCP家族成員染色體定位結(jié)果進(jìn)行圖形化處理。千穗谷全基因組數(shù)據(jù)下載于Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(Amaranthushypochondriacusv2.1，DOE-JGI，http://phytozome.jgi.doe.gov/)。通過在線分析工具WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)對(duì)千穗谷TCP蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 千穗谷TCP基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線網(wǎng)站對(duì)千穗谷TCP基因的啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，使用TBtools軟件展示預(yù)測(cè)結(jié)果[37]。

1.6 千穗谷TCP基因組織特異性表達(dá)分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)獲取千穗谷TCP基因在不同發(fā)育時(shí)期不同組織器官的表達(dá)情況[40]，通過Heml軟件對(duì)不同基因的表達(dá)量進(jìn)行分層聚類分析并繪制熱圖。

1.7 調(diào)控千穗谷TCP基因的miRNA預(yù)測(cè)

利用psRNATarget(https://www.zhaolab.org/psRNATarget/home)在線網(wǎng)站對(duì)可能調(diào)控千穗谷TCP基因編碼區(qū)的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。由于目前并沒有已報(bào)道的千穗谷miRNA，因此選擇雙子葉模式植物擬南芥miRNA數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 千穗谷TCP基因家族的鑒定及特性分析

從Plant TFDB v5.0數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索得到16個(gè)千穗谷TCP基因，分別命名為AhTCP1～AhTCP16(表1)。AhTCP基因長(zhǎng)度介于270～1 410 bp之間，氨基酸序列長(zhǎng)度在90～470之間，最長(zhǎng)為AhTCP12，最短為AhTCP10。蛋白分子量介于9 790.9～50 986.9kD之間；理論等電點(diǎn)介于6.26～10之間，且僅有AhTCP2，AhTCP4，AhTCP8，AhTCP9，AhTCP11的理論等電點(diǎn)小于7，其他蛋白等電點(diǎn)均在堿性范圍內(nèi)；平均親水性指標(biāo)均為負(fù)值，表明AhTCP成員均是親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，所有千穗谷TCP蛋白在細(xì)胞核中定位的概率最高，這與其轉(zhuǎn)錄因子的功能相符合。

表1 千穗谷TCP 家族成員基本信息

2.2 千穗谷TCP蛋白多重序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

對(duì)千穗谷TCP蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)(圖1)，發(fā)現(xiàn)16個(gè)成員的TCP結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)。典型的TCP結(jié)構(gòu)域?qū)儆诼菪?環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)，其中AhTCP10在helixII區(qū)域有部分缺失，與擬南芥的AtTCP6相似。千穗谷TCP家族中有9個(gè)成員在Basic區(qū)域缺失了4個(gè)氨基酸，與其他物種TCP家族中的PCF亞家族類似，根據(jù)這一特征可以將千穗谷16個(gè)TCP基因分為兩個(gè)亞家族：ClassⅠ和ClassⅡ。根據(jù)Helix和Loop區(qū)域的序列差異(圖2)，可以進(jìn)一步將ClassⅡ分為CYC/TB1和CIN兩個(gè)亞類。在千穗谷中，CYC/TB1亞類特有的保守氨基酸包括Basic區(qū)域和HelixI區(qū)域之間的亮氨酸，HelixI區(qū)域的異亮氨酸和精氨酸，以及Loop區(qū)域的苯丙氨酸、賴氨酸和丙氨酸等；而CIN亞類中特有的保守氨基酸包括Basic區(qū)域的賴氨酸，HelixⅠ區(qū)域的蘇氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺和精氨酸，以及Loop區(qū)域的脯氨酸等。不同的亞類在HelixII區(qū)域的序列差異較大，多態(tài)性較高。

圖1 千穗谷TCP蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列對(duì)比

對(duì)千穗谷、擬南芥、水稻三個(gè)物種的TCP轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)TCP家族成員可分為三大類。根據(jù)序列特征，將三大類分別命名為PCF，CYC/TB1和CIN，如圖2所示。其中，PCF亞類包含了16個(gè)擬南芥基因、10個(gè)水稻基因和9個(gè)千穗谷基因；CYC/TB1亞類包含了5個(gè)擬南芥基因、3個(gè)水稻基因和2個(gè)千穗谷基因；CIN亞類包含了12個(gè)擬南芥基因、10個(gè)水稻基因和5個(gè)千穗谷基因。千穗谷的TCP家族中一半以上成員為PCF亞類，而擬南芥和水稻中ClassⅠ和ClassⅡ兩個(gè)亞類的成員數(shù)目幾乎相同。

圖2 千穗谷、擬南芥和水稻的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 千穗谷TCP基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

千穗谷TCP家族成員的基因結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，大部分AhTCP基因不含內(nèi)含子，只有4個(gè)成員(AhTCP4，AhTCP9，AhTCP12，AhTCP15)含有1個(gè)內(nèi)含子，占總數(shù)的25%。不同基因的內(nèi)含子序列長(zhǎng)度差異很大，AhTCP15的內(nèi)含子長(zhǎng)度僅為80 bp，而AhTCP9內(nèi)含子序列長(zhǎng)達(dá)791 bp。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果可以看出，千穗谷TCP基因的內(nèi)含子數(shù)目在不同亞家族之間具有一定的特異性：ClassⅠ亞家族中，除AhTCP15外的其他成員均不含內(nèi)含子，而ClassⅡ亞家族中將近一半的成員含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子(圖3)。

圖3 千穗谷TCP家族成員基因結(jié)構(gòu)分析圖

千穗谷TCP蛋白的保守基序分析顯示，在進(jìn)化樹中同一分支的AhTCP蛋白通常具有相似的基序組成。除了TCP結(jié)構(gòu)域所在的motif1外，TCP家族不同成員之間還存在多個(gè)保守的DNA區(qū)段。比如，除AhTCP7外，Class Ⅱ的CIN亞類中都存在Motif3，Class Ⅰ的PCF分支中的AhTCP蛋白都具有Motif2和Motif5；有的Motif只在個(gè)別成員中存在，比如Motif6和Motif10僅存在于AhTCP3和AhTCP8中。

2.4 染色體定位分析

如圖4所示，千穗谷的16個(gè)TCP基因僅分布在Chr1，Chr2，Chr3，Chr4，Chr6和Chr11等6條染色體上，其他10條染色體無TCP基因分布。其中，Chr2染色體上共分布有5個(gè)TCP基因，且包含三個(gè)不同亞類；而Chr4和Chr6染色體上僅分布有1個(gè)TCP基因，均位于染色體端粒的位置。部分TCP基因在染色體上的分布呈現(xiàn)出成簇的現(xiàn)象，比如Chr1染色體上的AhTCP15，AhTCP16，相距僅0.17Mb；AhTCP1和AhTCP2兩個(gè)基因，均分布在Chr2染色體端粒部分34.27～34.54 Mb的區(qū)域內(nèi)。

圖4 千穗谷TCP家族成員染色體定位信息

2.5 順式作用元件預(yù)測(cè)

對(duì)千穗谷TCP基因上游1 000 bp序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)千穗谷TCP基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件(圖6)。比如，G-Box，Box 4，GT1-motif，MRE等光響應(yīng)元件，在所有AhTCPs啟動(dòng)子區(qū)域均有發(fā)現(xiàn)；而響應(yīng)無氧環(huán)境的ARE也存在于大部分的AhTCPs中。此外，部分AhTCP基因上游區(qū)域含有響應(yīng)低溫的元件LTR，比如AhTCP7，AhTCP13和AhTCP14等；部分基因包含響應(yīng)干旱脅迫的順式作用元件MBS，比如AhTCP5，AhTCP6和AhTCP10等。很多AhTCPs啟動(dòng)子含有響應(yīng)激素的順式作用元件，比如AhTCP5，AhTCP7，AhTCP15，AhTCP16中包含響應(yīng)生長(zhǎng)素的AuxRR-core或TGA-element元件，AhTCP4，AhTCP5，AhTCP6，AhTCP7中包含響應(yīng)赤霉素的P-box或GARE-motif等元件。部分順式作用元件僅在少數(shù)AhTCP基因中存在，例如響應(yīng)晝夜節(jié)律的Circadian僅在AhTCP5中存在，參與胚乳特異性表達(dá)的GCN4-motif僅在AhTCP10和AhTCP15中存在。

圖5 千穗谷TCP基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

2.6 組織特異性表達(dá)

基因的組織特異性表達(dá)通常與其功能密切相關(guān)。根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息可知，16個(gè)千穗谷TCP基因分別在根、莖、子葉、葉、花、未成熟種子、成熟種子和混合組織中檢測(cè)到不同水平的表達(dá)量(圖6)。不同亞家族的千穗谷TCP基因表達(dá)模式相似，比如PCF亞家族中的AhTCP2，AhTCP3，AhTCP5，AhTCP8，AhTCP14，AhTCP15，AhTCP16的表達(dá)模式被聚為一類；CIN亞家族中的AhTCP10和AhTCP12的表達(dá)模式被聚為一類且在大部分組織中未表達(dá)。其中，AhTCP4僅在花中表達(dá)；AhTCP13僅在根和莖中表達(dá)。AhTCPs在不同組織和器官中的表達(dá)模式不同，暗示不同成員在千穗谷的生長(zhǎng)發(fā)育不同階段具有不同的功能。

圖6 不同組織千穗谷TCP基因表達(dá)量分析

2.7 千穗谷TCP基因的miRNA預(yù)測(cè)

以AhTCP基因的編碼區(qū)為靶序列預(yù)測(cè)能夠與其互作的miRNA，發(fā)現(xiàn)多達(dá)47個(gè)類型的miRNA與AhTCP基因存在結(jié)合位點(diǎn)。其中，AhTCP12編碼區(qū)存在的結(jié)合位點(diǎn)最多，高達(dá)16個(gè)，AhTCP2存在的結(jié)合位點(diǎn)最少，只有1個(gè)(圖7A)。大部分的miRNA只跟1個(gè)AhTCP基因互作，但部分miRNA可以同時(shí)靶向不同的AhTCPs。比如，miR159，miR5658和miR834在千穗谷TCP基因中存在4個(gè)靶基因，miR472，miR838和miR319存在3個(gè)靶基因，另有11個(gè)miRNA存在2個(gè)靶基因(圖7B)。

圖7 AhTCP基因的互作miRNA預(yù)測(cè)

3 討論

千穗谷TCP基因家族不同成員的基因長(zhǎng)度、氨基酸大小、分子量和理論等電點(diǎn)差異較大，均編碼堿性氨基酸且定位于細(xì)胞核；根據(jù)氨基酸序列的差異，TCP基因家族可分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩大類，其中Class Ⅱ又分為CYC/TB1和CIN兩個(gè)分支[16]。千穗谷TCP基因家族也同樣包含三個(gè)亞類。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，AhTCPs兩個(gè)螺旋區(qū)的保守氨基酸殘基中非極性氨基酸含量更多，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)；環(huán)狀區(qū)域則包含許多親水性氨基酸殘基，例如賴氨酸(K)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)、天冬氨酸(D)等，這與前人的報(bào)道相似[41]。氨基酸序列對(duì)比和保守基序分析均顯示不同的亞家族具有一定的保守性，例如在PCF，CYC/TB1，CIN亞類中均含有特定的保守的氨基酸(圖1)、Class Ⅰ亞家族中均含有Motif2和Motif5。基因結(jié)構(gòu)分析顯示千穗谷TCP基因結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，僅AhTCP4，AhTCP9，AhTCP12和AhTCP15含有一個(gè)內(nèi)含子，大多數(shù)成員均沒有內(nèi)含子。這與其他物種中的研究結(jié)果一致[41-42]，表明TCP基因家族序列具有較強(qiáng)的保守性。染色體定位分析表明AhTCP基因僅定位在千穗谷的6條染色體上，基因在染色體上隨機(jī)分布且存在成簇的現(xiàn)象，這可能和基因的復(fù)制有關(guān)。

生物信息學(xué)分析可以為預(yù)測(cè)家族成員功能提供多方面依據(jù)。很多研究表明，直系同源基因通常具有相似的功能[43]。Danisman研究發(fā)現(xiàn)，AtTCP9通過改變茉莉酸代謝從而促進(jìn)根的伸長(zhǎng)[44]，本研究顯示，千穗谷的AhTCP13基因和AtTCP9在系統(tǒng)進(jìn)化樹中聚在同一個(gè)分支，且AhTCP13主要在根和莖中表達(dá)，因此AhTCP13很可能也具有與AtTCP9相似的功能和調(diào)控機(jī)制，在千穗谷的根莖發(fā)育中起重要作用。Sun等人發(fā)現(xiàn)擬南芥CIN亞類的AtTCP4具有激活次級(jí)細(xì)胞壁生物合成和細(xì)胞凋亡的功能，在花器官發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[21]。千穗谷的AhTCP9與AtTCP4聚在同一個(gè)分支，遺傳距離較近且組織特異性表達(dá)顯示其在花中表達(dá)量較高，推測(cè)AhTCP9基因很可能參與了千穗谷花的發(fā)育。前人研究表明，蓮藕(Nelumbonucifera)和豌豆(Pisumsativum)中CYC/TB1分支的TCP蛋白參與調(diào)控花的不對(duì)稱性[45-46]，同樣屬于CYC/TB1分支的AhTCP4僅在花中表達(dá)，推測(cè)其很可能參與了千穗谷花的形態(tài)建成。

轉(zhuǎn)錄因子通過與下游靶基因啟動(dòng)子上順式作用元件的相互作用，在植物發(fā)育過程和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[47]。本研究對(duì)千穗谷TCP啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域含有大量與激素調(diào)控和脅迫反應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，暗示千穗谷的TCP基因可能參與了多種發(fā)育事件和脅迫反應(yīng)。不同的千穗谷TCP基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件類型不同，顯示了家族基因間功能上的分化。比如，擬南芥中PCF分支的TCP14和TCP15通過促進(jìn)幼嫩節(jié)間的細(xì)胞分裂來影響植株高度，還可調(diào)節(jié)葉片發(fā)育和花組織的細(xì)胞增殖[48]，而千穗谷中與該基因同屬PCF分支的AhTCP15和AhTCP16在莖中表達(dá)水平較高，且啟動(dòng)子中包含響應(yīng)生長(zhǎng)素的順式作用元件，推測(cè)AhTCP15和AhTCP16基因可能通過響應(yīng)生長(zhǎng)素進(jìn)而調(diào)控千穗谷莖的生長(zhǎng)(圖6)。此外，ClassⅠ亞家族的AhTCP3，AhTCP11，AhTCP15，AhTCP16在其啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)與防御和應(yīng)激相關(guān)的順式作用元件(TC-rich repeats)，暗示其可能參與了植物的防御機(jī)制，這與擬南芥ClassⅠ亞家族中的AtTCP14，AtTCP15，AtTCP19等基因的功能相似[48]。

對(duì)AhTCP基因的編碼區(qū)進(jìn)行miRNA作用位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示有47個(gè)miRNA在AhTCP基因上存在結(jié)合位點(diǎn)，其中，miR319和miR5658的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度最高。多個(gè)物種中的研究均表明，miR319主要靶向作用于TCP基因，且主要為ClassⅡ亞家族中CIN分支成員[32,49]。比如，水稻中的Osa-miR319bc通過調(diào)控OsPCF6和OsTCP21的表達(dá)調(diào)節(jié)水稻對(duì)冷的應(yīng)激反應(yīng)[50]；雞爪槭(Acerpalmatum)中的miR319通過靶向ApTCP2影響植株開花、葉片形態(tài)和衰老[20]。本研究中，AhTCP6，AhTCP9和AhTCP12基因中均含有miR319的結(jié)合位點(diǎn)，且三者都屬于ClassⅡ亞家族中CIN分支成員，這與其他物種類似[51]。進(jìn)一步分析顯示，AhTCP12與ath-miR319在互補(bǔ)配對(duì)區(qū)有4個(gè)堿基的差異，AhTCP6和AhTCP9與ath-miR319在互補(bǔ)配對(duì)區(qū)僅有2個(gè)堿基的差異(圖8)。

圖8 miR319靶向AhTCP基因的結(jié)合位點(diǎn)

4 結(jié)論

根據(jù)TCP結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，千穗谷的16個(gè)TCP基因分為PCF，CYC/TB1和CIN三個(gè)分支，與其他物種的亞家族分類相似。染色體定位結(jié)果顯示，AhTCPs不均勻的分布在6條染色體上，部分基因呈簇狀分布。順式作用元件預(yù)測(cè)和組織特異性表達(dá)分析均顯示千穗谷TCP基因家族不同成員存在功能上的分化：不同AhTCPs的啟動(dòng)子所包含的順式作用元件存在較大差異，暗示其響應(yīng)不同的植物激素或者環(huán)境信號(hào)；16個(gè)AhTCPs基因在不同組織和器官中的表達(dá)模式不同，系統(tǒng)進(jìn)化樹中同一分支的成員表達(dá)模式相似，不同分支的成員存在較大差異。miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR319在千穗谷TCP家族中的靶基因也主要為CIN亞類成員。