楊焜婷，葉子樂，楊進(jìn)潔，宋柯穎，蔣 將，劉元法

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

冷凍充氣乳液，包括市面上常見的冰淇淋、冷凍奶油和加工蛋黃醬等食品，是一種復(fù)雜的泡沫體系[1-2]。該體系可由均質(zhì)后的O/W乳液在經(jīng)過冷凍老化及攪打后，連續(xù)相包裹空氣增稠，形成充氣結(jié)構(gòu)。小分子乳化劑和蛋白質(zhì)通過競爭性吸附作用吸附在脂肪球表面，形成具有黏彈性的界面膜，從而促進(jìn)在后續(xù)過程中脂肪部分聚結(jié)行為的發(fā)生[3-4]。低溫條件下對乳液進(jìn)行攪打時，油滴中的脂肪晶體會刺破界面膜，并與相鄰的脂肪球內(nèi)脂肪部分聚結(jié)形成脂肪晶體的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[5]。在之后的儲存和硬化過程中，充氣乳液內(nèi)部冰晶的形成也對最終產(chǎn)品的感官質(zhì)量和穩(wěn)定性起到至關(guān)重要的作用[6]。

咖啡與茶、可可并稱為世界三大飲料，隨著我國人民生活水平的提高，咖啡這一傳統(tǒng)的西方飲食也逐漸受到關(guān)注，在經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮姹禾幚砗螅Х榷怪械某煞謺l(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，形成較好的咖啡特征風(fēng)味。Heimovi等[7]發(fā)現(xiàn)在輕度和中度烘焙條件下，咖啡中的多酚含量較高。咖啡中的多酚主要有綠原酸、咖啡酸和阿魏酸等，具有很高的抗氧化能力，可預(yù)防多種疾病，如心腦血管疾病、癌癥，并且可以延緩衰老。通過在冷凍充氣乳液的生產(chǎn)過程中添加適量咖啡，不但可以增加乳液的功能性，豐富品種，也可以改善咖啡的單一飲用方式。

目前，牛奶蛋白由于其良好的界面性能和持水性被廣泛應(yīng)用于冷凍充氣乳液體系中[8-9]。但牛奶蛋白熱量較高，并含有乳糖，對過敏人群不夠友好。豌豆蛋白必需氨基酸含量豐富，具有良好的營養(yǎng)價值和較低的致敏性，是一種重要的植物蛋白源。但是由于豌豆蛋白結(jié)構(gòu)致密，導(dǎo)致其乳化性、起泡性等功能性質(zhì)較差，從而限制了豌豆蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用[10]。

改性修飾常用來改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。pH偏移是一種溫和簡便的化學(xué)改性方法，其原理為將蛋白質(zhì)暴露在遠(yuǎn)離等電點的極端pH條件下，蛋白質(zhì)分子表面的電荷分布發(fā)生變化，其產(chǎn)生的排斥力促使蛋白質(zhì)分子展開，而當(dāng)pH調(diào)回中性時，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度折疊，二、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，處于熔球態(tài)，此時的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露，表面疏水性增強(qiáng)，乳化性、起泡性等功能性質(zhì)得到改善[11]。超聲技術(shù)是一種物理改性方法，其利用超聲的空化效應(yīng)以機(jī)械性斷鍵來改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)的聚集程度降低，亞基發(fā)生解離，從而改善蛋白質(zhì)的功能特性[12]。pH偏移結(jié)合超聲處理可以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的功能特性，如Li等[13]通過超聲輔助pH偏移處理對菜籽分離蛋白進(jìn)行改性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲輔助pH偏移處理可以顯著提升菜籽分離蛋白溶解度，并且蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，證明超聲輔助pH偏移處理是一種有效的蛋白質(zhì)修飾方式。

目前，植物蛋白在冷凍充氣乳液體系中的應(yīng)用較少，為制備植物基冷凍充氣乳液，本研究使用豌豆蛋白替代牛奶蛋白作為蛋白源，通過pH偏移處理、超聲處理和二者結(jié)合對豌豆蛋白進(jìn)行改性，并將其應(yīng)用于含有咖啡的冷凍充氣乳液體系中，測定攪打前后乳液的品質(zhì)特性，為豌豆蛋白在食品體系中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

豌豆，購于無錫雪浪菜市場；椰子油，購于無錫歐尚超市；蔗糖酯(S370，HLB值為3)，日本三菱公司；食品級瓜爾膠，淄博中軒生化有限公司；氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、蔗糖等均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中度烘烤咖啡豆、紙質(zhì)濾膜，購于無錫星巴克咖啡店。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Turbiscan Lab Expert多重光散射儀，法國Formulaction公司；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；DHR3流變儀，美國TA儀器公司；Ultra-Turrax T18高速分散器，德國IKA公司；AH-2010 高壓均質(zhì)機(jī)，加拿大ATS公司；Zetasizer nano ZS納米粒度與Zeta電位儀，英國馬爾文公司；DM2700P偏光顯微鏡(PLM)，德國Leica公司；5804R冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf公司；ICM-150冰淇淋機(jī)，香港德國寶公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市精達(dá)儀器廠；pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆分離蛋白的制備

將豌豆利用粉碎機(jī)粉碎，稱取一定量的豌豆粉，按料水比1∶10分散至去離子水中，用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，室溫攪拌2 h后在10 000×g、4℃的條件下離心30 min，上清液采用2 mol/L的HCl調(diào)至pH 4.5，靜置30 min，在4℃、3 000×g的條件下離心20 min。沉淀水洗3次，至水洗液pH為7.0，冷凍干燥，得豌豆分離蛋白(NPP)。

1.2.2 豌豆分離蛋白的改性

將NPP粉末均勻分散于去離子水中，制成NPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，在室溫下攪拌1.5 h后置于4℃冰箱中過夜保存，使得蛋白質(zhì)分子充分水化，待處理。

pH偏移處理：取一定量NPP溶液，用2 mol/L NaOH溶液將其pH調(diào)至12，攪拌60 min后，利用2 mol/L HCl將溶液的pH調(diào)至中性并穩(wěn)定1 h，得pH偏移處理蛋白(BPP)。

超聲處理：利用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)對豌豆分離蛋白溶液進(jìn)行超聲處理。將NPP溶液置于50 mL燒杯中，將超聲探頭置于液面下1.0 cm進(jìn)行處理。超聲處理條件為超聲功率475 W、超聲頻率20 kHz、超聲脈沖間歇比5 s/5 s、處理時間5 min，得超聲處理蛋白(UNPP)。

pH偏移結(jié)合超聲處理：將BPP溶液進(jìn)行超聲處理。兩種改性條件均與單獨處理一致，得pH偏移結(jié)合超聲處理蛋白(UBPP)。

1.2.3 咖啡與豌豆蛋白溶液的混合

將中度烘焙咖啡豆粉碎后，于100℃的去離子水中浸提10 min，并將浸提液通過紙質(zhì)濾膜進(jìn)行過濾，將濾液進(jìn)行噴霧干燥，得到咖啡粉。相同質(zhì)量咖啡粉與經(jīng)過不同改性處理的豌豆蛋白溶液室溫攪拌混合 2.5 h以上，得到含有咖啡的豌豆蛋白溶液(咖啡粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.375%)。

1.2.4 攪打前乳液的制備

將0.3%蔗糖酯(S370)、0.2%瓜爾膠、15%蔗糖和4%(豌豆蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)計)含有咖啡的豌豆蛋白溶液混合，再加入10%的椰子油混合，補(bǔ)充去離子水使最終體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%。在60℃下攪拌至完全分散，之后使用高速分散器在13 800 r/min條件下將混合物混合2 min獲得粗乳液，將其置于80℃水浴鍋中保溫10 min進(jìn)行巴氏殺菌，隨后使用高壓均質(zhì)機(jī)對粗乳液進(jìn)行兩段式高壓均質(zhì)(15 MPa/3 MPa)得到細(xì)乳液，立即置于4℃下冷卻并保存6 h進(jìn)行老化。

1.2.5 攪打前乳液的穩(wěn)定性表征

利用Turbiscan Lab Expert多重光散射儀對攪打前乳液穩(wěn)定性進(jìn)行測定。取一定量細(xì)乳液至儀器專用玻璃瓶中，并輕放至儀器測試槽中，設(shè)置測試溫度30℃，測試時長60 min。通過脈沖近紅外(波長880 nm)光源對樣品進(jìn)行掃描，儀器的同步檢測器可接收不能通過樣品的背散射光 (BS)。基于接收到的樣品的背散射光強(qiáng)度變化，使用TurbiSoft Ver 2.1.0.52分析數(shù)據(jù)。Turbiscan穩(wěn)定性指數(shù)(TSI)根據(jù)式(1)計算。

(1)

式中：ITS為穩(wěn)定性指數(shù)；xi為每次掃描過程的背散射光強(qiáng)度；xBS為平均背散射光強(qiáng)度；n為掃描次數(shù)。

1.2.6 攪打前乳液的流變特性分析

取一定量在4℃老化6 h的細(xì)乳液，使用流變儀在4℃恒溫下測試攪打前乳液的流變性質(zhì)。樣品在測量之前的平衡時間均為120 s。

靜態(tài)流變：采用直徑40 mm的4°錐板在0.1～100 s-1的剪切速率下進(jìn)行剪切黏度測試。

動態(tài)流變：采用直徑40 mm的平板測試乳液樣品的黏彈性。在線性黏彈區(qū)選擇合適的應(yīng)變(0.1%)條件，設(shè)置頻率范圍為0.1～10 Hz，測試攪打前乳液的黏性模量(G″)。

1.2.7 攪打前乳液的油脂結(jié)晶行為觀察

將一定量按1.2.4方法制備的細(xì)乳液加熱至80℃以消除乳液油相的結(jié)晶記憶，使用點樣棒取1滴乳液置于預(yù)熱的載玻片上并覆蓋蓋玻片，輕輕按壓后置于4℃恒溫箱中保存12 h以便油脂結(jié)晶的生長。之后用配備有Canon數(shù)碼相機(jī)的偏光顯微鏡在目鏡10×、物鏡20×的條件下觀察乳液油相部分的結(jié)晶形態(tài)。

1.2.8 攪打前乳液粒徑的測定

使用納米粒度與Zeta電位儀測量乳液粒徑的分布。取一定量在4℃老化6 h的細(xì)乳液，用去離子水稀釋1 000倍，取3 mL稀釋液置于專用比色皿中測定平均粒徑(Z-Ave)。測定條件為：測試溫度25℃，平衡時間120 s。

1.2.9 冷凍充氣乳液的制備

將300 g老化的細(xì)乳液在刮面式冰淇淋機(jī)中連續(xù)攪打15 min(冰淇淋機(jī)內(nèi)壁溫度-20℃，機(jī)器中心溫度-5～-6℃)后，快速置于-18℃下硬化48 h，得冷凍充氣乳液。

1.2.10 冷凍充氣乳液膨脹率的測定

先后取相同體積老化的細(xì)乳液(m1)和攪打15 min的細(xì)乳液(m2)于質(zhì)量相同的鋁盒中稱重，并根據(jù)下式計算膨脹率(x)。

x=(m1-m2)/m2×100%

(2)

1.2.11 冷凍充氣乳液融化特性的分析

取60 g冷凍充氣乳液置于96孔板上，并在室溫(20℃)條件下自然融化60 min，記錄第一滴樣品滴下的時間(Ts)。在融化結(jié)束后測量樣品在60 min內(nèi)的滴漏量，并將融化速率表示為第60 min時的滴漏質(zhì)量相對于初始樣品質(zhì)量的比例。測試期間每隔30 min記錄樣品形狀的變化，評估樣品在融化過程中保持其初始形狀的能力。

1.2.12 冷凍充氣乳液中冰晶形態(tài)的觀察

為觀察冰晶分布，在溫度程序下模擬冷凍充氣乳液制備過程中的溫度變化，利用顯微鏡觀察冰晶的最終形態(tài)。溫度程序為：將攪打前的乳液在4℃下保持10 min，然后以24℃/min的速度冷卻至-20℃，然后以1.5℃/min升溫至-6℃，并保持4 min，最后將樣品冷卻至-18℃保持10 min后進(jìn)行拍照記錄。將每個樣品的冰晶圖片選取3張，利用Image-Pro Plus 6.0對其結(jié)冰情況進(jìn)行分析。

1.2.13 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)通過數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。多組樣品間的差異顯著性分析通過Duncan模型檢驗獲得，圖形的繪制使用Origin 9.4軟件。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 攪打前乳液的穩(wěn)定性

在攪打前，乳狀液體系需要保持穩(wěn)定均一，這也是形成冷凍充氣乳液體系的前提。按1.2.5方法測定攪打前乳液的TSI，結(jié)果見圖1。

圖1 攪打前乳液的穩(wěn)定性指數(shù)

Turbican Lab Expert多重光散射儀可以通過分析單位時間內(nèi)背散射光強(qiáng)度的變化對樣品中分子的運動情況進(jìn)行分析，并通過比較不同時刻樣品背散射光強(qiáng)度的變化來檢測樣品的穩(wěn)定性動力學(xué)，直觀地反映樣品的穩(wěn)定性[14-15]。由圖1可看出，經(jīng)過pH偏移處理后，乳液的TSI下降，但是在經(jīng)過超聲處理后，乳液的TSI有所增大。TSI越大說明乳液越不穩(wěn)定。Ertugay等[16]研究發(fā)現(xiàn)，pH偏移處理可以使蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)展開從而改善其界面性質(zhì)，乳化性和起泡性得到改善，可以形成更具黏彈性的界面膜。超聲處理可有效地解離蛋白質(zhì)分子中的亞基，通過超聲空化作用破壞蛋白質(zhì)分子中的疏水鍵和氫鍵，從而使乳液穩(wěn)定性下降，TSI增大，但通過實驗觀察，經(jīng)超聲處理的乳液在攪打前仍然保持穩(wěn)定。攪打前乳液穩(wěn)定性一定程度的下降有利于攪打時乳液的失穩(wěn)，從而使乳液在攪打時更容易形成充氣結(jié)構(gòu)。

2.2 攪打前乳液的流變性質(zhì)(見圖2)

圖2 攪打前乳液的流變特性

乳液的黏度也與其攪打過程密切相關(guān)。乳液黏度過高時，在攪打過程中不易包裹氣泡，很難獲得較好的膨脹率，而乳液黏度較低時，也不利于體系對于氣泡的截留。由圖2a可看出，隨著剪切速率(0.1～100 s-1)的不斷增加，4種乳液樣品的黏度均下降并表現(xiàn)出剪切變稀的趨勢，且經(jīng)pH偏移處理和超聲處理后，乳液的黏度增大，4種攪打前乳液的初始黏度大小順序為UBPP>BPP>UNPP>NPP。攪打前乳液黏度的提高有利于降低乳液的水分活度和結(jié)冰溫度，進(jìn)而使得冷凍充氣乳液口感提升，冰晶減小，同時增加一定的抗融性能[17]。由圖2b可看出，經(jīng)過pH偏移處理后乳液的G″增大，進(jìn)一步通過超聲處理，乳液的G″進(jìn)一步增大，這是因為蛋白質(zhì)在水相中展開程度增加所致[12]。

2.3 攪打前乳液的油脂結(jié)晶分布

攪打前乳液在老化的過程中，乳液中的油脂部分會發(fā)生結(jié)晶行為，這會影響后續(xù)攪打過程中油脂骨架的形成和乳液充氣結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。乳液中油脂結(jié)晶的形態(tài)是影響最終冰淇淋體系物化性質(zhì)的關(guān)鍵因素。圖3為NPP、BPP、UNPP和UBPP攪打前乳液的油脂結(jié)晶分布情況及粒徑。

由圖3可看出，NPP乳液中的油脂結(jié)晶數(shù)量較少，且結(jié)晶分布較為分散，BPP、UNPP、UBPP乳液具有較NPP乳液中更多的油脂結(jié)晶分布，UNPP和UBPP乳液中脂肪晶體增加，同時出現(xiàn)了晶體的聚結(jié)行為。同時，根據(jù)乳液的平均粒徑分布發(fā)現(xiàn)，pH偏移處理后，乳液的平均粒徑減小，這說明pH偏移可以促進(jìn)乳液形成更小的液滴，再經(jīng)超聲處理后，粒徑分布進(jìn)一步降低，這與Ertugay等[16]報道的結(jié)果類似，超聲處理可促進(jìn)乳液體系中的液滴更加均一細(xì)小。 而僅超聲處理，乳液粒徑相比未經(jīng)處理略有減小。

圖3 攪打前乳液的油脂結(jié)晶分布情況及粒徑

2.4 冷凍充氣乳液的膨脹率

冷凍充氣乳液的膨脹率可以表征乳液在攪打過程中截留氣泡的能力，同樣，膨脹率的增長也代表著油脂部分聚結(jié)水平的增加[18]。冷凍充氣乳液的膨脹率如圖4所示。

由圖4可知，NPP冷凍充氣乳液的膨脹率僅有32.49%，而在pH偏移處理及超聲處理后膨脹率分別提高至55.04%和45.07%。BPP冷凍充氣乳液經(jīng)過超聲處理后，膨脹率進(jìn)一步提高，達(dá)到了63.97%。攪打過程中，油脂的部分聚結(jié)行為使得油滴中的脂肪晶體形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種脂肪晶體的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以固定流動的氣泡，使得氣泡不容易破裂流出，乳液由油-水界面穩(wěn)定轉(zhuǎn)化為空氣-水、空氣-油界面穩(wěn)定，形成最終的充氣結(jié)構(gòu)。BPP的熔球結(jié)構(gòu)在攪打過程中有利于脂肪晶體穿透形成油脂部分聚結(jié)結(jié)構(gòu)，從而固定氣泡，膨脹率增大。超聲處理后，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且乳液中由于含有較多的脂肪晶體，穩(wěn)定性有一定的下降，液滴的界面膜變薄，脂肪晶體更容易刺穿界面膜，從而促進(jìn)脂肪晶體的部分聚結(jié)行為，形成更穩(wěn)定的油脂骨架，固定住更多的氣泡，最終乳液的膨脹率提高。適當(dāng)?shù)呐蛎浡士梢允沟米罱K的冷凍充氣乳液口感柔軟細(xì)膩，這同樣與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔韌性和乳液的穩(wěn)定性有關(guān)。

圖4 冷凍充氣乳液的膨脹率

2.5 冷凍充氣乳液的融化特性

冷凍充氣乳液的融化特性是評價其產(chǎn)品性能的重要指標(biāo)，其受到多種因素的影響，如乳液的膨脹率、黏度等。冷凍充氣乳液的融化特性如圖5和表1所示。

圖5 冷凍充氣乳液在融化0、30、60 min時的外形形態(tài)

由圖5可看出，室溫放置30 min時，不同處理的冷凍充氣乳液均已出現(xiàn)不同程度的融化行為，且pH偏移處理和超聲處理具有協(xié)同減緩冷凍充氣乳液融化速率的作用。脂肪晶體的部分聚結(jié)行為會影響冷凍充氣乳液的融化速率，融化速率越慢，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，保形性越好。Soukoulis等[19]研究發(fā)現(xiàn)，充氣乳液膨脹率的增加會導(dǎo)致乳液內(nèi)部具有較低的傳熱速率，這是因為結(jié)構(gòu)中的氣泡會導(dǎo)致傳熱速率減慢。BPP和UBPP冷凍充氣乳液由于其較高的膨脹率，融化過程中表面出現(xiàn)氣泡，并且融化速率顯著降低(P<0.05)(見表1)。在融化60 min后樣品周圍出現(xiàn)了融化部分的堆積行為，這與乳液的黏度適當(dāng)增加有利于氣泡的截留有關(guān)。Pereira等[20]研究發(fā)現(xiàn)，攪打前乳液黏度的增加使形成的充氣乳液具有更高的抗融性。

表1 冷凍充氣乳液融化開始時間(Ts)及測量60 min時的融化速率

2.6 冷凍充氣乳液中的冰晶觀察

理想的冷凍充氣乳液應(yīng)具有光滑、無明顯冰晶感的質(zhì)地，并且期望的冰晶尺寸應(yīng)小于55 μm[21]。冰晶的大小會影響乳液的功能特性，其平均尺寸會影響攪打充氣乳液的質(zhì)地和外觀[22]。圖6為冷凍充氣乳液中的冰晶形態(tài)。表2為冷凍充氣乳液的結(jié)冰面積。

圖6 冷凍充氣乳液中的冰晶形態(tài)

表2 冷凍充氣乳液的結(jié)冰面積

由圖6和表2可看出，BPP冷凍充氣乳液中的冰晶尺寸小于NPP冷凍充氣乳液，并且結(jié)冰面積有所下降。UNPP和UBPP冷凍充氣乳液中的冰晶尺寸比未超聲處理的冷凍充氣乳液有所下降。冰晶的形成與水相中的自由水含量有關(guān)，結(jié)冰面積越大，自由水含量越多，說明pH偏移處理和超聲處理均可以改善蛋白質(zhì)的持水能力，從而減少乳液中的自由水含量，限制冰晶的生長。同時可以看出，pH偏移處理結(jié)合超聲處理形成的冰晶更加細(xì)小、致密，UBPP乳液中的結(jié)冰面積比NPP乳液相比下降了15.7%。pH偏移處理后，再經(jīng)超聲處理，可以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的持水性，有利于冷凍充氣乳液形成更小的冰晶，減少乳液中的結(jié)冰面積。

3 結(jié) 論

pH偏移處理和超聲處理均可以改善豌豆蛋白界面性質(zhì)，以二者及二者結(jié)合用于豌豆蛋白的改性中，并將改性豌豆蛋白用于咖啡冷凍充氣乳液的制備，考察改性方法對咖啡冷凍充氣乳液品質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH偏移結(jié)合超聲處理的豌豆蛋白應(yīng)用在咖啡冷凍充氣乳液中時，攪打前的乳液具有最高的黏度和較多的脂肪簇聚集行為，攪打后形成的冷凍充氣乳液的膨脹率最高，并具有良好的保形性，形成了較好的油脂三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，融化速率降低，并且乳液中的冰晶尺寸最小。pH偏移、超聲處理豌豆蛋白可為拓寬冷凍充氣乳液的種類和實際加工過程提供指導(dǎo)。