王 瑩，鄧 慧，黃大川，曾祥輝，張 欽，賀秋平

(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院， 湖南 邵陽 422000)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)屬唇形科迷迭香屬小灌木，是一種名貴的天然香料植物，原產(chǎn)于歐洲、地中海沿岸[1-2]，目前在我國(guó)海南、云南、廣西、貴州、新疆、浙江等多省份(自治區(qū))都有大面積種植。迷迭香中含有酚類、黃酮類與萜類化合物[3-4]，具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等作用[5-8]。

迷迭香抗氧化物質(zhì)分為脂溶性抗氧化物質(zhì)和水溶性抗氧化物質(zhì)，水溶性抗氧化物質(zhì)主要是迷迭香酸，脂溶性抗氧化物質(zhì)主要為鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸。目前大部分研究?jī)H關(guān)注迷迭香活性成分的提取方法，針對(duì)迷迭香葉干燥方式的研究較少，綜合比較不同干燥方式對(duì)迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)活性影響的研究鮮見報(bào)道。

常用的干燥方式主要有曬干、陰干、凍干、烘干、微波干燥和噴霧干燥等[9-14]。本研究考慮實(shí)際情況，首先篩選出迷迭香的最佳生長(zhǎng)期，在此基礎(chǔ)上對(duì)迷迭香葉進(jìn)行自然陰干、烘干和晾曬3種不同干燥方式處理，通過測(cè)定鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸得率以及迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)的ABTS+自由基、DPPH自由基、羥自由基清除率和鐵還原力，探討不同干燥方式對(duì)迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)得率及抗氧化活性的影響，以期選出最佳生長(zhǎng)期及適宜干燥方法，最大限度地保留脂溶性抗氧化物質(zhì)，旨在為迷迭香綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮迷迭香葉，采摘于湖南省邵東市迷迭香種植基地。乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC級(jí)，純度≥98%)，大連美侖生物技術(shù)有限公司；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；DPPH(純度≥97%)，酷爾化學(xué)科技有限公司；ABTS(純度≥98%)，如吉科技有限公司；TBHQ，阿拉丁試劑有限公司；乙醇、過硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸等，均為分析純。

FW高速萬能粉碎機(jī)；CP114分析天平；TD4臺(tái)式離心機(jī)；U3000高效液相色譜儀，Thermo Fisher公司；SB-700DTY超聲波清洗機(jī)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；H2-16K真空冷凍干燥器；DZKW-4恒溫水浴鍋；UV-1780紫外可見分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理及迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)提取

選取生長(zhǎng)期分別為6、8、10、12、24個(gè)月的鮮迷迭香葉，采用回流法對(duì)不同生長(zhǎng)期迷迭香葉脂溶性抗氧化物質(zhì)進(jìn)行提取[15]；將篩選出的最優(yōu)生長(zhǎng)期的迷迭香葉分別采用陰干、晾曬、45℃低溫烘干3種方式干燥至恒重，粉碎后過篩，采用超聲波輔助法對(duì)不同干燥方式的迷迭香葉脂溶性抗氧化物質(zhì)進(jìn)行提取[16]，備用。

1.2.2 鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸得率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17-18]，采用高效液相色譜法分別測(cè)定1.2.1所得迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)中鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸質(zhì)量濃度，按公式(1)計(jì)算得率(Y)。

(1)

式中：C為提取物的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為試樣質(zhì)量，mg。

1.2.3 迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)的分離

1.2.1所得脂溶性抗氧化物質(zhì)中含有少量水溶性抗氧化物質(zhì)，通過水溶解法將迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)和水溶性抗氧化物質(zhì)分離[19]，將得到的迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)。

1.2.4 迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)抗氧化活性的測(cè)定

1.2.4.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考Tian等[20]的方法測(cè)定DPPH自由基清除率。取2 mL 不同質(zhì)量濃度的迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)樣液，加入2 mL DPPH無水乙醇溶液，避光靜置30 min，在波長(zhǎng)517 mm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率(R1)。

R1=[1-(Ai-A0)/Aj]×100%

(2)

式中：A0為陰性對(duì)照吸光度；Ai為樣液吸光度；Aj為空白對(duì)照吸光度。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除率測(cè)定

參考李娜等[21]的方法測(cè)定ABTS+自由基清除率。吸取0.3 mL不同質(zhì)量濃度的迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)樣液，加入2.7 mL ABTS+工作液，混合搖勻，室溫避光條件下反應(yīng)30 min，并測(cè)定其在734 nm處的吸光度，根據(jù)公式(3)計(jì)算ABTS+自由基清除率(R2)。

R2=(1-As/A0)×100%

(3)

式中:A0為空白對(duì)照吸光度；As為樣液吸光度。

1.2.4.3 鐵還原力測(cè)定

參考Yen等[22]的方法測(cè)定鐵還原力。取1 mL不同質(zhì)量濃度的迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)樣液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液和2.5 mL鐵氰化鉀溶液混合均勻，在50℃水浴中反應(yīng)20 min后加入2.5 mL三氯乙酸溶液中止反應(yīng)，靜置10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL三氯化鐵溶液，混勻后室溫放置10 min，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.4.4 羥自由基清除率測(cè)定

參考Smirnoff等[23]的方法稍作改動(dòng)。取2 mL不同質(zhì)量濃度的迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)樣液，加入0.25 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、0.25 mL 9 mmol/L水楊酸溶液和0.25 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，搖勻，室溫下反應(yīng)10 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式(4)計(jì)算羥自由基清除率(R3)。

R3=[1-(As-Ab)/Ac]×100%

(4)

式中：Ac為空白對(duì)照吸光度；As為樣液吸光度；Ab為陰性對(duì)照吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并利用Prism 8.0數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)期對(duì)迷迭香鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸得率的影響

6、8、10、12、24個(gè)月生長(zhǎng)期迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸得率如圖1所示。

注：相同指標(biāo)柱子上的不同字母代表差異顯著(P<0.05)。下同

從圖1可以看出：迷迭香生長(zhǎng)期為6～10個(gè)月時(shí)，鼠尾草酸得率變化不顯著，但到生長(zhǎng)期10個(gè)月后，鼠尾草酸得率迅速下降；鼠尾草酚得率隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)先增加后降低，在生長(zhǎng)期10個(gè)月時(shí)，鼠尾草酚得率最高，達(dá)到0.334 7%；熊果酸得率先隨著生長(zhǎng)期延長(zhǎng)不斷增加，到生長(zhǎng)期10個(gè)月得率達(dá)到最大值，隨后趨于穩(wěn)定。由此可見，迷迭香生長(zhǎng)期越長(zhǎng)，所提脂溶性抗氧化物質(zhì)得率不一定越高。綜合考慮，迷迭香最優(yōu)生長(zhǎng)期為10個(gè)月。

2.2 干燥方式對(duì)迷迭香鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸得率的影響

陰干、晾曬、烘干處理迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸得率如圖2所示。

圖2 干燥方式對(duì)迷迭香鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸得率的影響

由圖2可知，經(jīng)3種不同干燥方式處理，烘干迷迭香中鼠尾草酸得率最高，達(dá)到4.285%，然后依次為陰干和晾曬。烘干迷迭香中鼠尾草酚得率最高，達(dá)到1.895%，其次為晾曬、陰干。烘干迷迭香中熊果酸得率最高，其次為陰干、晾曬。烘干迷迭香中3種脂溶性抗氧化物質(zhì)得率與陰干、晾曬的相比差異顯著，說明烘干處理對(duì)迷迭香中脂溶性抗氧化物質(zhì)的影響最小。因此，烘干能有效降低迷迭香抗氧化物質(zhì)的損失。

2.3 干燥方式對(duì)迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)抗氧化活性的影響

2.3.1 DPPH自由基清除能力

3種不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同干燥方式對(duì)迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)DPPH自由基清除能力的影響

由圖3可知，DPPH自由基清除能力隨著脂溶性抗氧化物質(zhì)質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL時(shí)，烘干、陰干與晾曬迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率分別為95.18%、92.48%和89.59%。烘干、陰干和晾曬迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的DPPH自由基清除率的半抑制濃度(IC50)分別為0.034、0.040、0.047 mg/mL。因此，不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)楹娓?陰干>晾曬。結(jié)果表明烘干處理可更好地保留迷迭香葉中脂溶性抗氧化物質(zhì)。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

3種不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的ABTS+自由基清除能力測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同干燥方式對(duì)迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)ABTS+自由基清除能力的影響

由圖4可知，3種干燥方式處理的迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)對(duì)ABTS+自由基均有較強(qiáng)的清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，但弱于TBHQ。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL時(shí)，烘干迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的ABTS+自由基清除能力達(dá)到94.72%，強(qiáng)于陰干、晾曬。烘干、陰干及晾曬迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)清除ABTS+自由基的IC50分別為0.068、0.075、0.122 mg/mL，表明烘干處理能減少迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)的損失。

2.3.3 鐵還原力

3種不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的鐵還原力見圖5。

圖5 不同干燥方式對(duì)迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)

從圖5可看出，3種不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性均隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度由0.02 mg/mL增加到0.64 mg/mL，烘干迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的鐵還原力從0.069增加到0.819，陰干迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的鐵還原力由0.044增加到0.663，晾曬迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的鐵還原力由0.055增加到0.733。因此，與陰干、晾曬相比，烘干迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)具有更好的鐵還原力。

2.3.4 羥自由基清除能力

3種不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的羥自由基清除能力測(cè)定結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同干燥方式對(duì)迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)羥自由基清除能力的影響

從圖6可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL時(shí)，烘干、陰干和晾曬迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)對(duì)羥自由基的清除率分別達(dá)到92.00%、87.42%、90.85%，但均弱于TBHQ。烘干、陰干和晾曬迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)對(duì)羥自由基的IC50分別為0.067、0.084、0.071 mg/mL。不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的羥自由基清除能力大小依次為烘干>晾曬>陰干，這與鐵還原力強(qiáng)弱順序一致。

綜上，不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)對(duì)ABTS+自由基、DPPH自由基的清除能力趨勢(shì)是一致的，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.64 mg/mL時(shí)，其清除能力大小均為烘干>陰干>晾曬，不同干燥方式迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)對(duì)羥自由基的清除能力和鐵還原力大小順序?yàn)楹娓?晾曬>陰干，說明烘干迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性最強(qiáng)。

3 結(jié) 論

本文對(duì)迷迭香最佳生長(zhǎng)期進(jìn)行探討，并在此基礎(chǔ)上研究迷迭香經(jīng)過不同干燥方式處理后，對(duì)所提脂溶性抗氧化物質(zhì)抗氧化能力的影響。結(jié)果表明：迷迭香最佳生長(zhǎng)期為10個(gè)月；45℃低溫烘干迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)中鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸得率最高，且抗氧化能力最強(qiáng)，能有效保護(hù)迷迭香的脂溶性活性物質(zhì)。陰干和晾曬處理的迷迭香可能由于長(zhǎng)時(shí)間與空氣接觸，干燥過程中也易受溫度、光照等因素的影響，迷迭香中脂溶性抗氧化物質(zhì)發(fā)生氧化或分解，導(dǎo)致迷迭香脂溶性抗氧化物質(zhì)損失較多。因此，采用10個(gè)月生長(zhǎng)期，經(jīng)烘干處理的迷迭香所提脂溶性抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力最強(qiáng)，適于工業(yè)生產(chǎn)。