董喆，曹進，胡越，孫磊，羅嬌依，李夢怡

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（RM）是一種已經(jīng)確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值的物質(zhì)或材料，作為分析測量行業(yè)中的“量具”，在校準(zhǔn)測量儀器和裝置﹑評價測量分析方法﹑測量物質(zhì)或材料特性值和考核分析人員的操作技術(shù)水平等領(lǐng)域有著不可或缺的作用［1–4］。

克倫特羅俗稱“瘦肉精”，它既不是獸藥，也不是飼料添加劑，但因其對牲畜有明顯的促進生長﹑減少脂肪沉積﹑提高瘦肉率的作用，近年來作為“瘦肉精”被非法添加到動物飼料中。但研究表明，人吃了含有克倫特羅的畜產(chǎn)品會造成食物中毒，嚴(yán)重危害身體健康［5–6］。2010 年，全國食品安全整治辦公室發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單（第四批）》的通知(整頓辦函〔2010〕50 號)中將其列入食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第四批），然而在經(jīng)濟利益驅(qū)動下，“瘦肉精”事件依然時有發(fā)生。

為監(jiān)控實驗室克倫特羅的檢測能力，保證檢測結(jié)果有效可靠，且具有溯源性﹑可比性和準(zhǔn)確性，筆者研制了豬肉凍干粉中克倫特羅成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于相關(guān)檢測實驗進行克倫特羅分析方法的確認(rèn)和過程質(zhì)量控制，并保證測試分析量值溯源鏈的有效性和不間斷性，同時為研制食品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供了可操作的流程實例［7–8］。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：TQ–S 型，美國Waters 公司。

電子天平：AL204 型，感量為0.1 mg，瑞士METTLER 公司。離心機：HC–3018R 型，中佳科學(xué)儀器有限公司。pH 計：SevenEasy 型，瑞士METTLER 公司。鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%，德國Dr.E 公司。

鹽酸克倫特羅–D9 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，德國Dr.E 公司。

甲醇﹑甲酸：質(zhì)譜級，美國Thermo Fisher 公司。

乙酸鈉﹑氯化鈉﹑氫氧化鈉﹑高氯酸﹑氨水﹑異丙醇﹑乙酸乙酯：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

實驗用水為GB/T 6682 規(guī)定的一級水。

1.2 樣品制備

活豬（體重約100 kg）飼喂至穩(wěn)定狀態(tài)后，采用大腿肌肉注射法給藥，每天注射濃度為10 mg/mL的鹽酸克倫特羅溶液1 mL，持續(xù)注射17 天，分別在第3﹑5﹑7﹑10﹑15﹑17 天檢測豬血清中克倫特羅含量，豬血清中克倫特羅含量體內(nèi)變化如圖1 所示，17 天后豬血清中克倫特羅含量基本穩(wěn)定。

圖1 豬血清中克倫特羅含量體內(nèi)變化圖

宰殺活豬，將豬各部分器官（如心﹑肝﹑脾﹑肺﹑腎）分離后取豬肉部分，勻漿，凍干，粉碎研磨，過250 μm 篩網(wǎng)數(shù)遍，混勻后進行均勻性初檢，制備的陽性豬肉凍干粉中克倫特羅含量為87 μg/kg。

將上述制成的陽性克倫特羅豬肉凍干粉，按照1∶7 的比例與陰性豬肉凍干粉混合均勻，制備成中間濃度豬肉凍干粉；再將中間濃度豬肉凍干粉，按照1∶8 的比例與陰性豬肉凍干粉混合均勻，制備成豬肉凍干粉中含克倫特羅基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含量約為1.0 μg/kg），經(jīng)過均勻性初篩后，分包裝為2 g/瓶樣品，以塑料瓶密閉冷凍保存。

1.3 實驗方法

參考GB/T 22286—2008 《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定》［9］，同時查閱相關(guān)檢測方法文獻［10–11］，對豬肉中克倫特羅的含量測定方法進行提取和凈化步驟的優(yōu)化，最終確定本研究的檢測方法。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取鹽酸克倫特羅11.3 mg（精確至0.01 mg），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成濃度約為1 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，逐級稀釋成含克倫特羅0.1﹑0.5﹑1﹑2﹑5﹑10 μg/L 以及鹽酸克倫特羅–D9 內(nèi)標(biāo)10 μg/L 六個濃度梯度。

1.3.2 樣品處理

樣品復(fù)原：稱取約0.4 g 樣品于50 mL 離心管中，精密加入4 倍質(zhì)量的水復(fù)溶至肉糜狀，相當(dāng)于約2 g 肉糜樣品，振搖使其充分混勻，待測。

提取與凈化：向上述復(fù)原肉糜樣品中加入8 mL乙酸鈉緩沖液，充分混勻加蓋置于水平振蕩器振蕩15 min，離心10 min（5 000 r/min）。取離心上清液4 mL，添加100 μL （100 ng/mL）鹽酸克倫特羅–D9內(nèi)標(biāo)工作液，充分振蕩，加入0.1 mol/L 高氯酸溶液5 mL，混合均勻，用高氯酸調(diào)節(jié)至pH 1。離心10 min 后，將全部上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，用10 mol/L 的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 11。加入10 mL 飽和氯化鈉溶液和10 mL 異丙醇–乙酸乙酯（體積比為6∶4）混合溶液，充分提取，再離心，轉(zhuǎn)移全部有機相，在40 ℃水浴下用氮氣將其吹干。加入5 mL乙酸鈉緩沖液，超聲混勻，使殘渣充分溶解后，上陽離子交換柱。將小柱連接到真空裝置上，依次用2 mL 水，2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL 甲醇洗滌柱子并徹底抽干，最后用2 mL 的5%氨水甲醇溶液洗脫柱子上的待測成分。流量控制在0.5 mL/min，洗脫液在40 ℃水浴下用氮氣吹干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 0.1%甲酸溶液–甲醇（體積比為95∶5），超聲混勻。將溶液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管里，以15 000 r/min離心10 min。上清液過0.22 μm 膜后，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.3 儀器工作條件

（1）色譜條件。

色譜柱：Waters HSS T3柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters 公司）；流動相：A（0.1%甲酸溶液）和B（含0.1%甲酸的乙腈溶液）組成；洗脫梯度：0～1 min（95% A），1～3 min（95%～5% A），3～4.5 min（5%A），4.5～5 min（5%～95% A），5～7 min（95% A）；流量：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：5 μL。

（2）質(zhì)譜條件。

離子源：電噴霧ESI 正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：230 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；去溶劑氣流量：800 L/h；去溶劑氣溫度：400℃；克倫特羅測定離子：m/z277，203(定量離子)，m/z277，259（定性離子）；克倫特羅–D9 內(nèi)標(biāo)測定離子：m/z286，204(定量離子)。

1.3.4 結(jié)果計算

以克倫特羅與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)，以克倫特羅與內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)進行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣品中目標(biāo)物的含量。

1.4 樣品均勻性和穩(wěn)定性考察

參照CNAS GL03—2018《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》﹑CNAS GL 29—2010 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》［12–13］中關(guān)于均勻性﹑穩(wěn)定性檢驗的要求進行統(tǒng)計。

均勻性檢驗：當(dāng)實驗總樣本數(shù)小于500 個時，隨機抽取15 個樣品進行均勻性測定，每個樣品平行測定2 次。采用單因素方差分析評定樣品的均勻性。

穩(wěn)定性檢驗：按照先密后疏的原則設(shè)置不同的采樣時間點，采用同步穩(wěn)定性評估方法進行穩(wěn)定性分析。以均勻性檢測結(jié)果為長期穩(wěn)定性0 點，按推薦方式儲存樣品。分別在第1﹑2﹑4﹑6 月取樣，每次取4 份樣品，每份樣品檢測2 次。采用回歸分析評定樣品的穩(wěn)定性。

1.5 計量溯源

計量溯源性是確保標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果能夠在不同時間與空間保持可比的關(guān)鍵。有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CRM）具有一種或多種足夠均勻和很好地確定了的特性，用以校準(zhǔn)測量裝置﹑評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質(zhì)［14］。此次定值采用英國政府化學(xué)家實驗室研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，確保量值的可溯源性。

1.6 定值方法

參考JJF 1343—2012 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》﹑ISO GUIDE 35: 2017 《Reference materials—Guidance for characterization and assessment of homogeneity and stability》［15–16］，采用一種方法多家實驗室聯(lián)合定值的方式，穩(wěn)健的統(tǒng)計方法定值。

選擇其它7 家行業(yè)領(lǐng)域經(jīng)驗豐富且經(jīng)國家認(rèn)證的檢測實驗室或檢測中心。分別向每個定值實驗室提供豬肉凍干粉空白樣品和陽性樣品各不少于4 份，每個樣品分別平行測定2 組數(shù)據(jù)。各定值機構(gòu)提供不少于8 組測量數(shù)據(jù)。同時，定值過程中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制單位制定了明確的定值方案，并要求進行隨行質(zhì)量控制，以確保各實驗室定值結(jié)果可靠﹑穩(wěn)定。

回收定值檢測結(jié)果后，對每一組獨立測量結(jié)果采用格拉布斯（Grubbs）檢驗進行離群值檢驗，采用狄克森（Dixon）檢驗對組間數(shù)據(jù)進行離群值檢驗。剔除離群值后，采用Kolmogorov-Smirnor（KS）檢驗對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗。在符合正態(tài)分布的情況下，計算出各實驗室檢測結(jié)果中位值的中位值，該總體中位值即樣品的定值結(jié)果。

1.7 不確定度的評定

對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來說，其定值結(jié)果的不確定度由3 部分組成：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引起的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引起的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度。將上述3 部分不確定度按照相對不確定進行合成，記為uCRM。該合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k（置信水平為95%，k=2）得出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴展不確定度，記為U。

1.7.1 指定值的不確定度計算

計算各協(xié)作單位結(jié)果的中位值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)指定值的絕對差值，記為Qi，Q1，Q2…Qn的中位值記為QM。則協(xié)作定值的不確定度按式(1)計算。

其中：uchar——協(xié)作定值引入的不確定度；

N——協(xié)作標(biāo)定的實驗室個數(shù)；

s——正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差，s=QM/0.674。

2 結(jié)果與討論

2.1 均勻性檢驗結(jié)果

按1.4 進行均勻性檢測，采用單因素方差分析方法對樣品測定結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計?？藗愄亓_含量測定結(jié)果如表1 所示，F(xiàn)檢驗分析結(jié)果如表2 所示。樣品的F計算值小于F臨界值，表明樣品均勻性良好。

表1 豬肉凍干粉樣品中克倫特羅含量測定結(jié)果 μg/kg

表2 豬肉凍干粉樣品中克倫特羅含量測定方差分析結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

按1.4 進行穩(wěn)定性考察，結(jié)果見表3。對表3 檢測結(jié)果以時間–濃度做線性擬合，并做回歸方差分析，結(jié)果見表4。由表4 可知，在95%的置信水平下，斜率的P>0.05，說明樣品在考察期限內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 豬肉凍干粉樣品中克倫特羅穩(wěn)定性檢測結(jié)果

表4 豬肉凍干粉樣品中克倫特羅穩(wěn)定性檢驗回歸方差分析

2.3 協(xié)作定值結(jié)果及離群值檢驗

按照“1.3.2 定值方法”發(fā)放協(xié)作定值樣品，回收各協(xié)作單位定值檢測結(jié)果，見表5。其中，單位A～F 返回8 個檢測數(shù)據(jù)，單位G 返回了10 個檢測數(shù)據(jù)。采用格拉布斯法進行組內(nèi)可疑值檢驗，νi/S均小于λ(α，n)查表值，未觀測到組內(nèi)離群值；采用狄克森檢驗對組間數(shù)據(jù)進行離群值檢驗，r值均小于f(α，n)查表值，未觀測到組間離群值，可保留所有數(shù)據(jù)；采用KS 檢驗對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，P值為0.101，符合正態(tài)分布。協(xié)作定值結(jié)果直方分布圖見圖2.

表5 協(xié)作定值結(jié)果 μg/kg

圖2 協(xié)作定值結(jié)果直方分布圖

2.4 定值不確定度的計算

按“1.7 不確定度的評定”所述方法進行定值不確定度計算。定值過程﹑均勻性﹑穩(wěn)定性引入的不確定度及相對合成不確定度計算結(jié)果見表6﹑表7。按95%的置信區(qū)間，取k=2，按公式(6)計算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴展不確定度，結(jié)果為0.075 μg/kg。

表6 協(xié)作定值結(jié)果計算 μg/kg

表7 相對不確定度計算結(jié)果

2.5 豬肉凍干粉中克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果

經(jīng)過均勻性檢驗，6 個月內(nèi)的4 個月次的穩(wěn)定性檢驗和8 家實驗室協(xié)作定值，最終確定豬肉凍干粉中克倫特羅基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果為（0.927±0.075） μg/kg（k=2，以復(fù)原后的肉糜計）。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制方法探討

2.6.1 樣品制備方法選擇

豬肉中克倫特羅基質(zhì)標(biāo)物的制備一般采用陰性豬肉加入一定濃度的克倫特羅溶液完成，但該過程與實際的飼料喂養(yǎng)差別較大。因此本研究采用活體注射給藥的辦法，使藥物能夠參與到體內(nèi)的代謝過程，與實際的市售陽性豬肉更為相似，同時也可以縮短喂養(yǎng)方式制備基質(zhì)標(biāo)物的時間，是基質(zhì)標(biāo)物制備技術(shù)的一種新的探索。同時，考慮到豬肉含水率很高，為保證在儲存過程中基質(zhì)不變質(zhì)和目標(biāo)物含量的穩(wěn)定，最終采用冷凍干燥方式制備成凍干粉使用。

2.6.2 方法準(zhǔn)確度檢測

在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程中，測定方法的準(zhǔn)確性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的基本要求。筆者參考GB/T 22286—2008 《動物源性食品中多種β–受體激動劑殘留量的測定》對克倫特羅含量進行測定，通過陰性樣品和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比對確定樣品基質(zhì)對待測組分無干擾，用加標(biāo)回收率考察樣品的提取和凈化過程，通過同位素內(nèi)標(biāo)消除基質(zhì)效應(yīng)。方法學(xué)結(jié)果表明，克倫特羅在0.04～10 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.998，加標(biāo)回收率范圍為98%～109%，精密度偏差小于3%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于豬肉凍干粉中克倫特羅的定值研究。

2.6.3 定值方法選擇

在以往的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值研究中，通常計算多家實驗室結(jié)果的總體平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用總體平均值作為定值結(jié)果，采用標(biāo)準(zhǔn)偏差計算指定值的A 類不確定度。筆者采用了一種穩(wěn)健的統(tǒng)計定值方式，即使用總體的中位值作為定值結(jié)果，可以減少個別極端值對整體定值結(jié)果的影響，是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的一種新的嘗試。

3 結(jié)語

采用活體注射給藥法制備了豬肉凍干粉中克倫特羅基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過對其溯源性﹑準(zhǔn)確性﹑均勻性﹑穩(wěn)定性和不確定性研究，最終確定該樣品中克倫特羅含量結(jié)果為（0.927±0.075） μg/kg（k=2，以復(fù)溶后肉糜計）。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)滿足豬肉凍干粉中克倫特羅檢測基體參考物質(zhì)的使用條件，可用于相關(guān)檢測實驗進行克倫特羅分析方法的確認(rèn)和過程質(zhì)量控制，并保證測試分析量值溯源的有效性和不間斷性。