張正，施文婷，莫秋怡，曹嵌，鄧桂海，田清清，梁志毅

（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528244）

大黃為蓼科大黃屬植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，至今已有1 000 多年的藥用歷史［1］。2020 年版《中國(guó)藥典》以掌葉大黃﹑藥用大黃﹑唐古特大黃的干燥根及根莖入藥［2］。大黃味苦性寒，歸脾﹑胃﹑大肝﹑心包經(jīng)，有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐淤通經(jīng)，利濕退黃的功效［3］。大黃中含有豐富的蒽醌類﹑蒽酮類﹑鞣質(zhì)類﹑有機(jī)酸類﹑揮發(fā)油和多糖類成分［4–5］，其中以蒽醌類成分研究最為廣泛，游離型蒽醌主要有大黃酸﹑大黃素﹑大黃酚﹑蘆薈大黃素﹑大黃素甲醚等，結(jié)合型蒽醌衍生物為游離蒽醌類的葡萄糖苷或雙蒽酮苷，雙蒽酮苷類包括番瀉苷A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F 等［6］。現(xiàn)代藥理研究表明，大黃具有調(diào)節(jié)胃腸道功能﹑保護(hù)心腦血管﹑保肝利膽﹑免疫調(diào)節(jié)﹑抗炎﹑抗病毒﹑抗腫瘤等作用［7–8］。

2020 年版《中國(guó)藥典》一部大黃飲片項(xiàng)下炮制方法為“除去雜質(zhì)，洗凈，潤(rùn)透，切厚片或塊，晾干”［2］，缺乏具體的工藝參數(shù)，不利于大黃飲片的質(zhì)量控制。關(guān)于掌葉大黃飲片炮制工藝的研究多以2020 年版《中國(guó)藥典》一部大黃項(xiàng)下的質(zhì)量控制指標(biāo)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，較為單一，鮮見指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)研究掌葉大黃飲片炮制工藝的報(bào)道［9］。筆者通過建立UPLC（高效液相色譜）指紋圖譜并結(jié)合相似度評(píng)價(jià)﹑聚類分析﹑主成分分析和方差分析，對(duì)不同潤(rùn)制時(shí)間﹑干燥方式﹑烘干溫度及時(shí)間的掌葉大黃飲片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為掌葉大黃飲片具體炮制工藝參數(shù)的確定和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Waters Arc 型，美國(guó)Waters公司。

電子天平：（1）XP26 型，感量為0.001 mg；（2）ME204E 型，感量為0.1 mg，瑞士METTLER TOLEDO 公司。

超純水系統(tǒng)：Milli–Q Direct 型，德國(guó)Merck 公司。

高速中藥粉碎機(jī)：111B 型，浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ–500DE 型，昆山市超聲儀器有限公司。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG–9146A 型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

沒食子酸［批號(hào)：110831–201605，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為90.8%］﹑兒茶素［批號(hào)：110877–201604，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.2%］﹑番瀉苷A［批號(hào)：110824–201702，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為95.2%］﹑番瀉苷B［批號(hào)：110825–201603，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為95%］﹑蘆薈大黃素［批號(hào)：110795–201710，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為98.3%］﹑大黃酸［批號(hào)：110757–201607，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.3%］﹑大黃素［批號(hào)：110756–201913，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為96%］﹑大黃酚［批號(hào)：110796–201922，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.4%］﹑大黃素甲醚［批號(hào)：110758–201817，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.2%］對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

大黃酚-8-O- 葡萄糖苷對(duì)照品：批號(hào)為CFS201801，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）98%，武漢天植生物技術(shù)有限公司。

大黃素8-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品：批號(hào)為18080601，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

甲醇：色譜純，德國(guó)Merck 公司。

磷酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用其余試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

大黃藥材：批號(hào)為YG1906003，產(chǎn)地為甘肅，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為蓼科植物掌葉大黃的干燥根和根莖。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters CORTECS T3 色譜柱（150 mm×2.1mm，1.6μm，美國(guó)Waters 公司）；流動(dòng)相：乙腈（A）–0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脫程序：0～5 min，3%～21%A；5～20min，21%～40%A；20～27 min，40%～50%A；27～40min，50%～58%A；40～50 min，58%～95%A；50～53min，95%～3%A；流量：0.25mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；進(jìn)樣體積：1 μL［10–11］。

1.3 溶液配制

（1）混合對(duì)照品溶液的制備。精密稱取沒食子酸﹑兒茶素﹑番瀉苷A﹑番瀉苷B﹑大黃酚-8-O-葡萄糖苷﹑大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷﹑蘆薈大黃素﹑大黃酸﹑大黃素﹑大黃酚﹑大黃素甲醚對(duì)照品適量，加入甲醇，配制成質(zhì)量濃度均分別為6.603﹑5.321﹑8.950﹑

7.602﹑7.969﹑12.654﹑12.162﹑12.595﹑15.297﹑9.235﹑13.132 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。取掌葉大黃飲片粉末（過四號(hào)篩）約0.2g，精密稱定，置于25mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30min，取出，放冷，補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取空白溶劑﹑混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，按1.2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖如圖1 所示，供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)UPLC 色譜圖

2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取按1.3 中混合對(duì)照品溶液，在1.2 色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，以圖1 中7 號(hào)色譜峰蘆薈大黃素為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品粉末，平行稱定6 份，按1.3 中方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以7 號(hào)色譜峰蘆薈大黃素為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取1.3 中供試品溶液，按1.2 色譜條件分別在第0﹑2﹑4﹑6﹑8﹑12﹑24h 進(jìn)樣測(cè)定，以7 號(hào)峰蘆薈大黃素為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果均小于3.0%，表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 潤(rùn)制時(shí)間考察

2.5.1 指紋圖譜的建立

取同一批掌葉大黃藥材進(jìn)行潤(rùn)制，分別于潤(rùn)制0﹑2﹑4﹑8﹑12﹑24﹑36﹑48h 取樣（編號(hào)為S0～S7），切厚片，低溫干燥，見表1。按1.3 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。樣品數(shù)據(jù)依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 掌葉大黃飲片不同潤(rùn)制時(shí)間考察

2.5.2 特征峰比較

計(jì)算不同潤(rùn)制時(shí)間掌葉大黃飲片UPLC 指紋圖譜各共有峰的色譜峰面積–取樣量比值（mV·s·mg–1），結(jié)果見表2。

表2 不同潤(rùn)制時(shí)間掌葉大黃飲片的峰面積–取樣量比值

由表2 可知，隨著潤(rùn)制時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合型蒽醌水解轉(zhuǎn)變成游離蒽醌，導(dǎo)致蘆薈大黃素﹑大黃酸﹑大黃素﹑大黃酚﹑大黃素甲醚的提取率呈上升趨勢(shì)；掌葉大黃飲片中兒茶素﹑番瀉苷A﹑番瀉苷B﹑大黃酚-8-O-葡萄糖苷﹑大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷的提取率均呈下降趨勢(shì)。表明潤(rùn)制時(shí)間對(duì)掌葉大黃飲片各指標(biāo)成分的影響顯著。

2.5.3 相似度評(píng)價(jià)

計(jì)算樣品S1～S7 的指紋圖譜與掌葉大黃藥材（S0）指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表3。由表3 可知，潤(rùn)制2h 以內(nèi)的掌葉大黃飲片與其藥材的相似度大于0.95，而潤(rùn)制4h 以上掌葉大黃飲片與其藥材的相似度均小于0.90。表明隨著潤(rùn)制時(shí)間的延長(zhǎng)，掌葉大黃飲片各指標(biāo)成分的含量較藥材的差異逐漸變大。

表3 不同潤(rùn)制時(shí)間考察掌葉大黃飲片指紋圖譜相似度結(jié)果

2.5.4 聚類分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)各特征峰的峰面積–取樣量比值進(jìn)行聚類分析，建立不同潤(rùn)制時(shí)間掌葉大黃飲片的聚類分析樹狀圖，結(jié)果如圖2 所示。通過分析可將不同潤(rùn)制時(shí)間的掌葉大黃飲片聚為2 類，潤(rùn)制2﹑4﹑8﹑12h 與掌葉大黃藥材聚為I 類，潤(rùn)制24﹑36﹑48h 聚為II 類。表明潤(rùn)制時(shí)間對(duì)掌葉大黃飲片指標(biāo)成分含量的影響較顯著。

圖2 不同潤(rùn)制時(shí)間時(shí)掌葉大黃飲片聚類分析（CA）樹狀圖

2.5.5 主成分分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)掌葉大黃飲片11 個(gè)共有峰的峰面積–取樣量比值進(jìn)行因子分析，結(jié)果見表4﹑表5，成分因子分析圖見圖3。根據(jù)主成分的提取原則，取特征值大于1 對(duì)應(yīng)的成分作為提取主成分［12］，因子載荷值反映大黃各指標(biāo)成分對(duì)主成分載荷的相對(duì)大小和影響的方向，數(shù)值反映原變量對(duì)因子影響的大小，正負(fù)代表方向的差別［13］。

表4 主成分分析結(jié)果

表5 主成分因子載荷矩陣

圖3 主成分因子分析圖

由表4﹑表5 及圖3 可知，前兩個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為94.915%，表明提取的2 個(gè)主成分基本能反映全部指標(biāo)信息。主成分1 的特征值為8.917，方差貢獻(xiàn)率為81.060%，兒茶素﹑番瀉苷B﹑番瀉苷A﹑大黃酚-8-O-葡萄糖苷﹑大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為負(fù)相關(guān)，蘆薈大黃素﹑大黃酸﹑大黃素﹑大黃酚和大黃素甲醚的載荷較高且均為正相關(guān)，表明其主要反映主成分1 的信息；主成分2 的特征值為1.524，方差貢獻(xiàn)率為13.855%，沒食子酸載荷較高且呈正相關(guān)，表明其主要反映主成分2 的信息。上述對(duì)掌葉大黃飲片指紋圖譜差異貢獻(xiàn)較大的成分，可能是掌葉大黃飲片炮制過程中含量變化的關(guān)鍵成分。

2.5.6 綜合評(píng)分

綜合評(píng)分由公式Fi=a1X1+a2X2+…….+ajXm（a為特征值，由成分矩陣中的第j列載荷除以對(duì)應(yīng)成分特征值的算術(shù)平方根所得，X為原始指標(biāo)）計(jì)算［13–14］，計(jì)算得到F1﹑F2兩個(gè)主成分的表達(dá)式。將原始指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而得到綜合評(píng)分函數(shù)（F=0.810 60F1+0.138 55F2，其中F1和F2為2 個(gè)主成分的得分，系數(shù)為各成分的方差貢獻(xiàn)率），即綜合評(píng)分，結(jié)果見表6。由表6 可知，當(dāng)掌葉大黃飲片潤(rùn)制36h 后，其綜合評(píng)分最高，表明掌葉大黃飲片的最佳潤(rùn)制時(shí)間為36h。

表6 不同潤(rùn)制時(shí)間考察掌葉大黃飲片綜合評(píng)分結(jié)果

2.6 干燥方式考察

2.6.1 指紋圖譜的建立

取同一批掌葉大黃藥材潤(rùn)制36h 后，切厚片，分成三份，分別采用晾干﹑曬干﹑烘干（60 ℃）三種干燥方式進(jìn)行干燥（編號(hào)分別為S8～S10），按1.3 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。不同干燥方式的掌葉大黃飲片的樣品數(shù)據(jù)依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.6.2 相似度評(píng)價(jià)

計(jì)算樣品S8–S10 的指紋圖譜與掌葉大黃飲片潤(rùn)制36h（S6）指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表7。由表7 可見，各樣品相似度均大于0.95。

表7 不同干燥方式的掌葉大黃飲片指紋圖譜相似度結(jié)果

2.6.3t檢驗(yàn)分析

3 份掌葉大黃飲片各特征峰的峰面積–取樣量比值結(jié)果見表8，采用SPSS 20.0 軟件對(duì)其進(jìn)行獨(dú)立樣本–t檢驗(yàn)分析。結(jié)果表明，不同干燥方式對(duì)掌葉大黃飲片的各成分含量無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際考慮，確定掌葉大黃飲片的最佳干燥方式為烘干。

表8 不同干燥方式的掌葉大黃飲片色譜峰結(jié)果（n=2）

2.7 不同烘干溫度和烘干時(shí)間考察

2.7.1 指紋圖譜的建立

取同一批掌葉大黃藥材潤(rùn)制36h 后，分別置于40﹑55﹑70 ℃鼓風(fēng)烘箱內(nèi)烘干，于干燥4﹑8﹑12﹑24h時(shí)取樣（編號(hào)分別為S11～S22，見表9），按1.3 方法制備供試品溶液，按1.2 色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。不同烘干溫度和烘干時(shí)間的掌葉大黃飲片樣品數(shù)據(jù)依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表9 掌葉大黃飲片不同烘干溫度及時(shí)間考察

2.7.2 相似度評(píng)價(jià)

計(jì)算樣品S11～S22 的指紋圖譜與掌葉大黃飲片潤(rùn)制36h（S6）指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表10。由表10 可見，各樣品相似度均大于0.95。

表10 不同烘干溫度及時(shí)間的掌葉大黃飲片指紋圖譜相似度結(jié)果

2.7.3t檢驗(yàn)分析

12 份掌葉大黃飲片各特征峰的峰面積–取樣量比值結(jié)果見表11，采用SPSS 20.0 軟件對(duì)其進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。結(jié)果表明，不同干燥方式對(duì)掌葉大黃飲片的各成分含量無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)合各實(shí)驗(yàn)組飲片的水分結(jié)果，為提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，確定掌葉大黃飲片烘干工藝參數(shù)為50～70 ℃干燥8～12h。

表11 不同烘干溫度及時(shí)間的掌葉大黃飲片色譜峰面積–取樣量比值（n=2）

2.8 掌葉大黃飲片炮制工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)選的掌葉大黃飲片炮制工藝參數(shù)，稱取三份掌葉大黃藥材，每份約200g，進(jìn)行三份平行驗(yàn)證試驗(yàn)，分別潤(rùn)制36h 后，切厚片，于70 ℃下烘10 h，將測(cè)得的數(shù)據(jù)代入數(shù)據(jù)組中進(jìn)行分析，結(jié)果見表12。三份驗(yàn)證的各特征峰峰面積–取樣量比值的RSD 值均小于3%，其綜合評(píng)分分別為35.94﹑36.23﹑36.07，表明優(yōu)選的掌葉大黃飲片炮制工藝穩(wěn)定可行。

表12 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=2）

3 結(jié)語

優(yōu)選的掌葉大黃飲片最佳炮制工藝：潤(rùn)制36h，切厚片，50～70 ℃干燥8～12h。研究表明潤(rùn)制時(shí)間對(duì)掌葉大黃飲片的各指標(biāo)成分含量影響顯著，相關(guān)文獻(xiàn)表明，大黃中的游離型蒽醌類成分與其“清熱解毒”功效呈正相關(guān)［15–16］，結(jié)合型蒽醌類成分則與其“瀉下攻積”功效呈正相關(guān)［17–18］，故臨床應(yīng)用可根據(jù)證候結(jié)合藥理作用，調(diào)整掌葉大黃飲片炮制過程中的工藝參數(shù)，提高治療的針對(duì)性。此外，不同干燥方式﹑不同的烘干溫度及時(shí)間對(duì)掌葉大黃飲片各指標(biāo)成分的含量影響并不明顯。2020 年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定掌葉大黃飲片的干燥方式為“晾干”，但晾干耗時(shí)長(zhǎng)，物料長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，易發(fā)生氧化降解和霉變，而烘干不受外界因素影響，且能縮短干燥時(shí)間，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，提高生產(chǎn)效率，更適用于掌葉大黃飲片的工業(yè)生產(chǎn)［19］。

中藥有效成分在炮制過程中充分的保留是保證中藥臨床療效發(fā)揮的重要前提，影響掌葉大黃飲片炮制工藝的因素眾多，本研究參照2020 年版《中國(guó)藥典》一部﹑各種炮制規(guī)范及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)掌葉大黃飲片的炮制工藝參數(shù)進(jìn)行研究，優(yōu)選出科學(xué)﹑合理﹑穩(wěn)定﹑可行的掌葉大黃飲片炮制工藝參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量一致的掌葉大黃飲片提供參考。同時(shí)也為唐古特大黃飲片和藥用大黃飲片的炮制工藝研究奠定了基礎(chǔ)。