張英楠，姚圣城，郭雯雯，史凌云，吳小進

221000 江蘇 徐州，徐州市第一人民醫(yī)院 腫瘤中心放療科(張英楠、郭雯雯、史凌云、吳小進);221000 江蘇 徐州，徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 骨科(姚圣城)

我國肺癌發(fā)生率和死亡率居高不下，已成為惡性腫瘤之首，是我國重大的公共衛(wèi)生問題和巨大的社會負擔。肺癌也已超越肝癌成為死亡率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌的治療手段不斷進步，從手術治療、化療、放療、免疫治療到多種療法聯(lián)合應用[2]，雖然取得一定的成效，但總體效果仍不令人滿意。因此，從根本上探明肺癌的發(fā)病機理具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。

導致肺癌患者死亡的多數(shù)原因是癌細胞遠處器官轉移，例如腦轉移、骨轉移等。由各種細胞和非細胞因素組成的腫瘤微環(huán)境在癌癥轉移中起著重要作用[3-4]。在肺癌組織中有大量的炎癥細胞浸潤，如中性粒細胞、巨噬細胞等[5]。中性粒細胞是多形核細胞，約占白細胞總數(shù)的50%～70%，是機體固有免疫的重要組成部分。作為參與炎癥反應的重要細胞，近年來腫瘤相關中性粒細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用被研究者廣泛關注[6]。在癌癥微環(huán)境中，中性粒細胞可以通過產生抗腫瘤因子，如NO、H2O2和TSP-1來抑制腫瘤的發(fā)展[7-9]，但更多的報道是中性粒細胞作為腫瘤的幫兇，通過調節(jié)腫瘤的生存和遷移、免疫反應和血管生成來促進癌癥的發(fā)展和轉移[10-14]。中性粒細胞促進肺癌轉移的作用機理尚不清楚，進一步研究揭示中性粒細胞促進肺癌轉移的分子機制具有重要的臨床意義。

自分泌運動因子(autotaxin，ATX)又稱外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員2(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2，ENPP2)，具有磷脂酶D (phospholipases D，PLD)活性，能夠催化溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)向溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)的轉化。LPA通過細胞膜上的LPA受體激活細胞內的G蛋白及其下游信號通路，從而促進淋巴細胞的遷移[15]和多種腫瘤細胞的運動[16-18]。迄今為止的大多數(shù)研究都集中在針對ATX-LPA受體軸來治療各種炎癥相關疾病，但最近的研究指出，ATX不僅有磷脂酶的作用，還作為免疫細胞的一種外分泌的功能蛋白，以自分泌或旁分泌方式直接與靶細胞表面的整合素相互作用來調節(jié)其他細胞的功能[19]。肺癌組織中有大量中性粒細胞浸潤，同時中性粒細胞作為ATX的主要來源之一，是否調控肺癌細胞的轉移仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌細胞促進中性粒細胞ATX的合成與分泌，進一步中性粒細胞來源的ATX與肺癌細胞整合素β3相結合從而激活下游SRC信號通路，增強了肺癌細胞的侵襲與遷移能力，本研究初步探討了中性粒細胞促進肺癌轉移的新機制，并嘗試為肺癌臨床治療提供了新靶點及策略。

1 材料和方法

1.1 材料

中性粒細胞由HL-60細胞系(購買自ATCC公司)加含有1.3% 二甲基亞砜的完全培養(yǎng)基誘導5～7天分化形成[20]；A549和H1299肺癌細胞系購買自ATCC公司、液氮冷凍保存；Transwell小室購買自美國Corning公司；ATX一抗、整合素β3一抗、Protein A/G beads購買自美國Santa cruz公司；SRC一抗、p-SRC一抗、β-Actin一抗購買自美國CST公司；ATX ELISA試劑盒購買自Cloud-Clone公司；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清購自Thermo公司。

1.2 Transwell實驗

侵襲實驗：提前在超凈臺中將Transwell小室底層均勻鋪上Matrigel膠(用培養(yǎng)基稀釋終濃度為0.8 mg/mL)，放入培養(yǎng)箱5 h；胰酶消化肺癌細胞，PBS清洗2遍，細胞計數(shù)后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞(1×105/mL)；中性粒細胞制備同前，PBS清洗2遍，細胞計數(shù)后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞(1×107/mL)；24孔板底部加入600 μL中性粒細胞懸液，預鋪Matrigel膠的小室加入100 μL肺癌細胞懸液，小室放入24孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h后，用鑷子小心取出小室，吸凈上室液體，移到加入600 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min，下室中性粒細胞懸液2 000 rpm離心10 min，上清及細胞放-80℃冰箱備用；小心取出小室，吸凈上室液體，移到加入500 μL結晶紫的孔中，室溫染色20 min；取出小室，吸凈上室液體，用濕棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細胞，用室溫PBS清洗數(shù)次；Transwell小室底面朝上，自然晾干后于顯微鏡下拍照；顯微鏡下取5個隨機視野拍照，ImageJ軟件計數(shù)，統(tǒng)計結果。遷移實驗步驟同侵襲實驗，但是小室不鋪Matrigel膠。

1.3 Western blot實驗

收集活化后中性粒細胞或共培養(yǎng)后肺癌細胞，用含有蛋白酶抑制劑(1%)及苯甲基磺酰氟(1%)的RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白，測蛋白濃度，濃度一致后加入Loading buffer；SDS-PAGE凝膠電泳；轉膜后一抗4℃孵育過夜；次日孵育二抗；化學發(fā)光法顯色；ImageJ軟件灰度分析。

1.4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)實驗

共培養(yǎng)后收集肺癌細胞A549和H1299，RIPA冰上裂解30 min提取總蛋白；各組取出50 μL作為In-put組；余下部分分別加入等量整合素β3抗體，同源Normal IgG；4℃慢搖8 h；加入30 μL Protein A/G agarose beads，顛倒混勻，4℃慢搖過夜；1 000 g，4 ℃，離心5 min，棄上清，加入1×RIPA裂解液1 mL，重復以上步驟，洗滌4～5次；加入50 μL 2×SDS-PAGE Loading buffer蛋白上樣液，100℃加熱10 min，進行Western Blot實驗，一抗孵育整合素β3和ATX。

1.5 ATX濃度測定

收集上述共培養(yǎng)活化上清，利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定ATX濃度，具體方法參照試劑盒說明書提供的檢測步驟。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準誤表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 中性粒細胞促進肺癌細胞侵襲與遷移

為了驗證中性粒細胞是否促進肺癌細胞轉移，我們利用Transwell實驗檢測肺癌細胞的侵襲(小室預鋪Matrigel膠過夜)與遷移能力，肺癌細胞A549或H1299接種于Transwell上室，中性粒細胞接種于下室，對照組不接種中性粒細胞，12 h后對穿過的肺癌細胞進行固定染色并計數(shù)，圖1A結果顯示，在侵襲實驗中共培養(yǎng)組A549通過小室的細胞數(shù)為(117.4±4.0)個，對照未培養(yǎng)組通過的細胞數(shù)為(83.6±5.2)個；遷移試驗中共培養(yǎng)組A549通過小室的細胞數(shù)為(123.0±9.2)個，對照未培養(yǎng)組通過的細胞數(shù)為(88.0±9.7)個；圖1B結果顯示，在侵襲實驗中共培養(yǎng)組H1299通過小室的細胞數(shù)為(145.8±21.8)個，對照未共培養(yǎng)組通過的細胞數(shù)為(81.8±6.9)個，遷移試驗中共培養(yǎng)組A549通過小室的細胞數(shù)為(265.0±13.4)個，對照未共培養(yǎng)組通過的細胞數(shù)為(142.6±8.8)個，結果有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。以上結果說明中性粒細胞顯著增強肺癌細胞侵襲與遷移的能力。

圖1 中性粒細胞促進肺癌細胞侵襲與遷移

2.2 肺癌細胞促進中性粒細胞ATX合成與分泌

進一步，為了探究中性粒細胞促進肺癌細胞侵襲與遷移能力的原因，我們在6孔板中將肺癌細胞與中性粒細胞共培養(yǎng)4 h，離心收集活化的中性粒細胞與上清。Western blot結果顯示，肺癌細胞激活中性粒細胞后，中性粒細胞ATX表達顯著升高(圖2)。因為ATX可以作為分泌蛋白在胞外發(fā)揮生物學效應，所以我們利用ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)后ATX的水平顯著升高(圖2C和2D)。以上結果表明肺癌細胞激活中性粒細胞可以使中性粒細胞ATX產生和分泌增加。

圖2 肺癌促進中性粒細胞ATX合成與分泌

2.3 中性粒細胞通過ATX促進肺癌細胞侵襲與遷移

中性粒細胞是否通過分泌的ATX促進肺癌細胞侵襲與遷移呢？進一步，我們首先用ATX特異性抑制劑HA130孵育中性粒細胞，Western blot驗證抑制效率(圖3A)，然后再進行Transwell試驗。圖3B結果顯示，在侵襲實驗中HA130組A549通過小室的細胞數(shù)為(68.4±5.1)個，對照組通過的細胞數(shù)為(135.8±6.4)個；在遷移試驗中HA130組A549通過小室的細胞數(shù)為(118.6±4.0)個，對照組通過的細胞數(shù)為(170.8±6.4)個；圖3C結果顯示，在侵襲實驗中HA130組H1299通過小室的細胞數(shù)為(42.0±2.4)個，對照組通過的細胞數(shù)為(66.6±7.0)個，在遷移試驗中HA130組H1299通過小室的細胞數(shù)為(64.6±6.4)個，對照組通過的細胞數(shù)為(85.6±4.5)個，結果有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。以上結果說明中性粒細胞通過ATX的分泌促進肺癌細胞侵襲與遷移。

2.4 ATX與整合素β3結合激活肺癌細胞SRC通路

已有研究報道，ATX的N端SMB結構域可與血小板和中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)的整合素αIIbβ3相結合進而激活下游信號通路增強靶細胞的遷移能力[21]，而肺癌細胞表面整合素β3的活化在肺癌的轉移過程中發(fā)揮重要的調控作用[22]。因此，我們推測中性粒細胞分泌的ATX可以與肺癌細胞表面整合素β3結合，CO-IP實驗結果顯示，肺癌細胞A549或H1299在與中性粒細胞共培養(yǎng)后，整合素β3與ATX發(fā)生蛋白與蛋白相互結合，而未培養(yǎng)對照組則沒有結合(圖4A)。進一步，圖4B和圖4C結果顯示，肺癌細胞A549或H1299在與中性粒細胞共培養(yǎng)后整合素下游信號SRC磷酸化增強。以上結果表明中性粒細胞分泌的ATX與肺癌細胞整合素β3相互結合激活下游SRC信號通路。

圖3 中性粒細胞通過ATX促進肺癌細胞侵襲與遷移

圖4 ATX與整合素β3結合激活肺癌細胞SRC通路

綜上，肺癌細胞激活中性粒細胞促進中性粒細胞ATX分泌，ATX與肺癌細胞整合素相互結合激活下游SRC信號通路，進而促進增強肺癌細胞的侵襲與遷移能力。

3 討 論

除了傳統(tǒng)的手術、放化療等治療方式外，目前新興的靶向及免疫治療也為肺癌治療提供了新的手段，但是肺癌患者的總體治療效果仍不盡人意，其中導致肺癌患者治療失敗及死亡的主要原因仍是肺癌細胞的遠處轉移[23]。揭示肺癌細胞轉移的分子機理具有重要的理論意義及現(xiàn)實意義。本研究首次發(fā)現(xiàn)中性粒細胞通過分泌ATX與肺癌細胞整合素β3結合進而激活下游SRC信號,增強肺癌細胞的侵襲與遷移能力，ATX抑制劑HA130能夠有效反轉中性粒細胞促進的肺癌細胞侵襲與遷移，或可為肺癌患者臨床抗轉移治療提供了新的靶點及策略。

腫瘤逐漸被人們認為是一種慢性炎癥性疾病，中性粒細胞作為固有免疫的一線細胞，一些研究已經表明腫瘤微環(huán)境浸潤的中性粒細胞促進癌細胞增殖、遷移和侵襲。腫瘤浸潤中性粒細胞活化后通過分泌IL-8、IL-17、Arginase I等抑制機體免疫反應促進腫瘤進展[24-25]，同時還可以分泌基質金屬蛋白酶MMP-9、MMP-13等促進癌細胞外基質降解從而促進癌細胞轉移[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞可以早于腫瘤細胞在肺部聚集，形成早期轉移灶，靶向敲除中性粒細胞可以減少腫瘤肺轉移[28]。在肺癌移植瘤模型中，高中性粒細胞浸潤釋放過多的G-CSF從而引起前動力蛋白2(Bv8)增多，促進中性粒細胞活化并且促進血管生成，抑制Bv8的表達能夠減少中性粒細胞腫瘤浸潤，進而降低肺癌血管生成和增殖能力[29]。但是腫瘤浸潤中性粒細胞是否會直接增強肺癌細胞的運動能力尚缺乏報道，我們的研究證明肺癌細胞可以直接激活中性粒細胞，并且活化的中性粒細胞可以分泌ATX促進肺癌細胞侵襲與遷移，ATX抑制劑HA130可以顯著反轉中性粒細胞的促肺癌轉移能力(圖1)。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)ATX可以與肺癌細胞整合素β3結合，導致整合素下游SRC磷酸化的增加(圖4)，進而直接增強肺癌細胞的運動能力，最終導致肺癌的遠處轉移。

研究表明ATX不僅有磷脂酶的作用，還作為分泌蛋白，以自分泌或旁分泌方式直接與靶細胞表面的整合素相互作用來調節(jié)其他細胞的生物功能[19]。與報道一致的是，我們研究發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的確可以促進中性粒細胞的ATX蛋白合成與分泌(圖2)。但是ATX是通過怎樣的途徑調控肺癌細胞轉移的呢？ATX蛋白N端SMB結構域可與血小板和CHO細胞的整合素αIIbβ3相結合進而激活下游信號通路增強靶細胞的遷移能力[21]，同時整合素β3參與肺癌細胞運動調控[22]。CO-IP實驗證實ATX可以直接與整合素β3結合，說明腫瘤浸潤中性粒細胞來源的ATX通過自分泌或旁分泌的調控肺癌細胞轉移。這一機制對進一步闡明中性粒細胞促進肺癌轉移的分子機制具有一定意義。

腫瘤患者自身免疫能力較差，常伴隨感染等風險，因此完全靶向消除中性粒細胞可能對患者本身的免疫功能造成一定負面影響[30]，這一問題不容忽視且需要進一步研究，因此基于文獻報道和我們的研究結果，可以考慮靶向腫瘤特異性中性粒細胞ATX基因的肺癌治療策略，減弱中性粒細胞對肺癌細胞轉移的促進作用，從而達到減弱中性粒細胞促進肺癌進展的治療目的。

綜上所述，中性粒細胞通過ATX調控整合素β3促進肺癌細胞發(fā)生轉移，ATX抑制劑HA130顯著減弱中性粒細胞對肺癌細胞轉移的促進作用。為進一步研究中性粒細胞與肺癌之間的關系及ATX的功能具有一定的指導意義。靶向中性粒細胞ATX基因可能為肺癌患者臨床治療提供新的思路。

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