李兆祺，司家屹，楊秀云

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 山西 太谷 030801）

植物在次生代謝過程中會產(chǎn)生許多分子量低且易揮發(fā)的化學(xué)物質(zhì)，這類物質(zhì)是植物與外界環(huán)境進行相互作用的重要媒介[1-3]。植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)不僅對自身生長、繁衍、抵抗逆境脅迫具有重要作用[4-6]，而且會在改變大氣質(zhì)量、預(yù)防人體疾病和調(diào)節(jié)情緒等方面產(chǎn)生一些影響[7]。近年來，我國園林綠化工作者在保證城市景觀效果的同時兼顧其康養(yǎng)價值[8]，部分植物揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物對人體有一定的保健作用，具有揮發(fā)性物質(zhì)的園林植物的開發(fā)利用可為建設(shè)保健型園林綠地提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

百里香(Thymus mongolicus)是唇形科(Labiatae)百里香屬一種典型的草本芳香植物，其全株具有誘人的香氣，是重要的食用、藥用和蜜源植物，同時在保持生態(tài)和園林觀賞等方面也具有較高價值，是極具開發(fā)潛力的芳香植物[9]。目前世界上記載的百里香有350余種，我國百里香種質(zhì)資源眾多，與國外品種相比，我國的百里香適應(yīng)性較強，病蟲害較少，栽培成本低，但是有效成分芳香油的含量以及自然狀態(tài)下釋放的揮發(fā)性物質(zhì)含量低，觀賞價值也較國外低[10]。當(dāng)前國內(nèi)學(xué)者對百里香的研究主要集中在花色、揮發(fā)性氣味、精油提取等方面[10-12]，對其不同物候期與揮發(fā)性物質(zhì)釋放量的關(guān)系的研究尚鮮少報道。因此，對百里香的揮發(fā)性物質(zhì)在不同物候條件下的釋放節(jié)律的研究，有利于我國百里香資源的進一步開發(fā)應(yīng)用以及營造康養(yǎng)型植物景觀。

本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)，分析不同物候期百里香葉片揮發(fā)性物質(zhì)的種類與含量，旨在探明百里香揮發(fā)性物質(zhì)釋放節(jié)律，以期為百里香的進一步推廣應(yīng)用及植物葉片揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年4月至9月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)站百里香種質(zhì)資源圃進行。該地區(qū)位于112°57′23.11″ E，37°85′27.96″ N，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候。試驗材料為引種自渾源地區(qū)的野生百里香植株。分別在生長旺盛期(4月17日)、開花期(5月14日)、結(jié)果期(8月20日)和衰敗期(9月27日)4個物候期間，于10:00采用多株混合取樣法，選取生長健壯、無病蟲害侵染的百里香成熟葉片，用蒸餾水沖洗干凈后，每份樣品稱取0.5 g，3次重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取

分別精確稱取0.5 g百里香葉片，剪碎置于20 mL萃取瓶內(nèi)并迅速密封。萃取條件：萃取頭為DVB/CAR/PDMS，50 ℃震蕩15 min，吸附5 min，進樣溫度為270 ℃，解吸附5 min，進行GC-MS檢測。

1.2.2 GC-MS檢測

色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細管柱，載氣為高純氦氣，流速為1 mL·min-1，采用不分流進樣方式，起始溫度為40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升溫至270 ℃，保持6 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源，離子傳輸線溫度為250℃，離子源溫度為230 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu。

1.2.3 揮發(fā)性成分定性定量方法

定性方法：根據(jù)GC-MS檢測得到的質(zhì)譜信息，采用計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與NIST質(zhì)譜庫進行比對，對揮發(fā)物成分進行鑒定。

定量方法：以右旋龍腦(純度 ≥ 99%，湖南晃龍公司生產(chǎn))為外標(biāo)，根據(jù)右旋龍腦標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(y)和峰面積(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y= 0.000 000 000 13x+0.042 083 942 95，R2= 0.991)，揮發(fā)物的含量 = 濃度 ×內(nèi)標(biāo)體積/樣本質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010和SPSS 19.0軟 件對所測數(shù) 據(jù)整理分析，用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示測定結(jié)果，采用Duncan法對不同采樣時期各類揮發(fā)性物質(zhì)含量多重比較，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 不同物候期百里香葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量分析

百里香葉片在4個物候期中共檢測出69種揮發(fā)性物質(zhì)，但是不同物候期釋放的揮發(fā)性物質(zhì)在種類上存在著明顯的差異(表1)。百里香葉片的揮發(fā)性物質(zhì)種類隨著物候期的變化呈下降趨勢。其中，生長旺盛期的種類最多為53種，開花期和結(jié)果期分別為50種和43種，而衰敗期僅有28種。

表1 不同物候期百里香葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)及含量Table 1 Volatile components and amounts released from Thymus mongolicus leaves at different phenological periods

續(xù)表1 (1)Table 1 (Continued)

續(xù)表1 (2)Table 1 (Continued)

在各物候期的百里香葉片中釋放種類最多的揮發(fā)性物質(zhì)均為烯烴類化合物，表現(xiàn)為生長旺盛期(23種) ＞ 開花期(21種) ＞ 結(jié) 果期(20種) ＞ 衰敗期(13種)；醇類揮發(fā)性物質(zhì)在生長旺盛期釋放種類相對較多(10種)，而在開花期和結(jié)果期均釋放了7種，衰敗期釋放了6種；芳香烴類揮發(fā)性物質(zhì)種類在開花期最多(7種)，在衰敗期最少(4種)；酯類揮發(fā)性物質(zhì)的種類在生長旺盛期、開花期、結(jié)果期和衰敗期分別為5種、3種、2種和1種。此外，酮類揮發(fā)性物質(zhì)在各個物候期的釋放種類均相對較少，衰敗期僅釋放了1種揮發(fā)物，其余物候期釋放了4種揮發(fā)物。

不同物候期百里香葉片釋放的揮發(fā)性物質(zhì)總量不同(圖1)，隨著物候期推移呈先升后降的變化趨勢，表現(xiàn)為開花期和結(jié)果期含量相對較高，分別為163.90和157.21 μg·g-1；而生長旺盛期和衰敗期相對較低，分別為104.47和75.42 μg·g-1，顯著低于開花期和結(jié)果期的含量(P＜ 0.05)。

百里香葉片各類揮發(fā)性物質(zhì)含量在不同物候期間存在差異(圖1)。其中，烯烴類揮發(fā)性物質(zhì)在生長旺盛期、開花期、結(jié)果期和衰敗期含量分別為43.12、85.82、83.52和11.69 μg·g-1，開花期和結(jié)果期的含量顯著高于其他時期(P＜ 0.05)。醇類揮發(fā)性物質(zhì)在結(jié)果期含量最高，為27.30 μg·g-1，衰敗期含量最低，僅為8.96 μg·g-1。芳香烴類揮發(fā)性物質(zhì)含量在開 花 期(54.84 μg·g-1)、衰 敗 期(53.40 μg·g-1)和 結(jié) 果期(43.32 μg·g-1)差異不顯著(P＞ 0.05)，但3個時期均顯著高于生長旺盛期含量(29.14 μg·g-1)。酮類揮發(fā)性物質(zhì)在結(jié)果期(3.01 μg·g-1)釋放量最大，顯著高于其他物候期。酯類揮發(fā)性物質(zhì)在生長旺盛期(2.32 μg·g-1)的釋放量高于開花期(0.80 μg·g-1)、結(jié)果期(0.51 μg·g-1)與衰敗期(0.13 μg·g-1)。其他類揮發(fā)性物質(zhì)在生長旺盛期釋放量(12.27 μg·g-1)均高于其他時期。

圖1 4個物候期百里香葉釋放的揮發(fā)性物質(zhì)含量Figure 1 Volatile components released from Thymus mongolicus leaves in the four phenological periods

2.2 百里香葉片4個物候期主要揮發(fā)性物質(zhì)的物候節(jié)律性變化

4個物候期的百里香葉片共有揮發(fā)性物質(zhì)有23種，其中含量高于3.00 μg·g-1的揮發(fā)性物質(zhì)有11種，主要是烯烴類、醇類及芳香烴類物質(zhì)。

百里香葉片中烯烴類揮發(fā)性物質(zhì)在不同物候期的變化情況如圖2所示。γ-松油烯在開花期的釋放量相對較高，為44.96 μg·g-1，明顯高于其他各個時期；莰烯、雙環(huán)[3.1.0]六角-2-烯、月桂烯和檜烯均在結(jié)果期釋放量相對較高，分別為14.94、13.13、9.09和3.31 μg·g-1，其次為開花期，含量分別為7.35、7.50、7.84和1.83 μg·g-1。反式石竹烯的含量表現(xiàn)為開花期(9.50 μg·g-1) ＞ 生長旺盛期(7.68 μg·g-1) ＞ 結(jié)果期(2.81 μg·g-1) ＞ 衰敗期(0.97 μg·g-1)；而β-蒎烯含量最大值則出現(xiàn)在結(jié)果期，為4.09 μg·g-1。

圖2 共有主要揮發(fā)物中烯烴類揮發(fā)性物質(zhì)含量Figure 2 Analysis of volatile alkenes among the common major volatiles

百里香葉片中主要的醇類和芳香烴類揮發(fā)性物質(zhì)在不同物候期的變化情況如圖3所示。桉葉油 醇 的 含 量 表 現(xiàn) 為 結(jié) 果 期(18.90 μg·g-1) ＞ 開 花 期(13.92 μg·g-1) ＞ 衰 敗 期(7.06 μg·g-1) ＞ 生 長 旺 盛 期(4.89 μg·g-1)；右旋龍腦在生長旺盛期含量最大(6.41 μg·g-1)，衰敗期最小(0.90 μg·g-1)，開花期和結(jié)果期分別釋放了3.99和4.81 μg·g-1；鄰-異丙基甲苯的含量表現(xiàn)為衰敗期(52.93 μg·g-1) ＞ 開花期(46.84 μg·g-1) ＞結(jié)果期(36.94 μg·g-1) ＞ 生長旺盛期(25.71 μg·g-1)；2-甲氧基-4-甲基-1-(1-甲基乙基)苯在衰敗期含量最低(0.25 μg·g-1)，與開花期(7.02 μg·g-1)、結(jié)果期(5.02 μg·g-1)和生長旺盛期(2.92 μg·g-1)含量差異較大。

圖3 共有主要揮發(fā)物中醇類和芳香烴類揮發(fā)性物質(zhì)含量Figure 3 Analysis of volatile alcohols and aromatic hydrocarbons among the common major volatiles

3 討論與結(jié)論

植物揮發(fā)性物質(zhì)的合成與釋放是植物自身代謝調(diào)控和各類環(huán)境因子綜合作用的結(jié)果[13]。隨著物候的變化，外界環(huán)境因子發(fā)生改變，植物也相應(yīng)進入不同的生長發(fā)育時期，其揮發(fā)性物質(zhì)作為生長發(fā)育過程中的一種細胞調(diào)控信號，伴隨自身代謝調(diào)控和物候期的變化呈現(xiàn)出相應(yīng)的動態(tài)特征，形成了節(jié)律性的差異[14]。蔣冬月等[15]對比了黃金香柳(Melaleuca bracteata)季節(jié)動態(tài)變化和日變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，6月檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)種類相對較多，認為這主要是由于夏季溫度升高，光照時間變長，植物代謝途徑發(fā)生了活躍的變化，從而釋放相對較多的揮發(fā)性物質(zhì)。楊素華等[16]研究了樟樹(Cinnamomum camphora)葉片揮發(fā)性物質(zhì)的年季變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，植株5月份釋放的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多。李娟等[17]研究側(cè)柏(Platycladus orientalis)揮發(fā)性物質(zhì)季節(jié)變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏揮發(fā)物含量隨季節(jié)變化表現(xiàn)為夏季 ＞ 春季 ＞秋季 ＞ 冬季。郭阿君等[18]對火炬樹(Rhus tyhpina)葉片揮發(fā)性物質(zhì)季節(jié)動態(tài)變化規(guī)律進行研究發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)火炬樹揮發(fā)性物質(zhì)種類及相對含量存在差異。春、秋兩季以萜烯類化合物為主，夏季烴類化合物比例稍高于萜烯類，同時包含少量的酮類和醇類化合物。本研究表明，百里香春季生長旺盛期種類最多，與其代謝速率相對較強，且葉片需要進行多種途徑的代謝活動以滿足生長發(fā)育的需求有關(guān)；在植株進入生殖生長期后，葉片功能發(fā)生了變化，需要通過降低代謝速率以滿足生殖生長的養(yǎng)分需求，從而導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物種類的減少[19]。不同時期的葉片積累物質(zhì)由于植物生理需求的不同而產(chǎn)生變化，因此進入衰敗期后，生殖生長期間大量的養(yǎng)分消耗和外界氣候因子變化的雙重影響使植物次生代謝活動進一步減緩，造成這一時期百里香葉片中揮發(fā)性物質(zhì)種類顯著降低[20]。

有關(guān)研究表明，次生代謝產(chǎn)物在植物的生理調(diào)節(jié)、生存競爭、自身保護以及協(xié)調(diào)與環(huán)境之間的關(guān)系等方面起著重要作用[21]。隨季節(jié)的變化，外界的光、空氣、土壤、溫度和濕度等各種生態(tài)環(huán)境因素以及生物自身的調(diào)控均會發(fā)生改變，從而影響到植物的次生代謝過程。已有研究證實植物中揮發(fā)性物質(zhì)的釋放量與光照、空氣、土壤、溫度、濕度以及蒸騰速率等環(huán)境因子密切相關(guān)[22-27]。在本研究中，百里香葉片揮發(fā)性物質(zhì)總釋放量在開花期和結(jié)果期顯著高于其他各生長時期，而生長旺盛期、衰敗期揮發(fā)性物質(zhì)含量較低，這是多重因素協(xié)同作用產(chǎn)生的結(jié)果，是植物通過自身代謝調(diào)控以適應(yīng)外界環(huán)境變化的表現(xiàn)。百里香開花期與結(jié)果期處于5月下旬到10月之間，此階段光照時間長，植物葉片可以充分進行光合作用，為植物次生代謝提供了充足的反應(yīng)前體物質(zhì)與能量，并且在一定范圍內(nèi)，溫度升高會使參與次生代謝有關(guān)的酶活性增強，促進揮發(fā)性物質(zhì)釋放量的提高[28]。此外，一些學(xué)者證實，強烈的蒸騰作用使植物葉片氣孔張大，氣孔的開合度對植物體揮發(fā)性物質(zhì)的釋放具有調(diào)控作用[29-30]。本研究在不同物候期選取百里香的葉片部位進行測定，測得揮發(fā)性物質(zhì)含量存在差異的結(jié)果，與葉片氣孔開度的大小也具有一定的關(guān)聯(lián)。

烯烴類、醇類、酮類揮發(fā)物是一類富含碳原子的次生代謝產(chǎn)物，其在衰敗期釋放量最低，主要是由于植株在進入衰敗期前經(jīng)歷了生殖生長期，大量的碳水化合物、激素等養(yǎng)分被消耗，且由于進入衰敗期時，外界日照時長、溫度等生態(tài)環(huán)境因子也發(fā)生了顯著的降低[31]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，在百里香葉片中測得的烯烴類物質(zhì)在開花期釋放量最高，醇類和酮類物質(zhì)在結(jié)果期釋放量最高，百里香進入衰敗期后，葉片中測得的烯烴類、酮類和醇類揮發(fā)性物質(zhì)的含量均降到最低。百里香葉片中芳香烴類揮發(fā)物在衰敗期的釋放量相對較高。芳香烴類的揮發(fā)物質(zhì)是由苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生的，與植物抗性聯(lián)系密切，已有研究證實，光照、溫度、病蟲害、機械損傷、外源激素等都能夠誘導(dǎo)苯丙烷代謝途徑相關(guān)酶系的活性增加[32-35]，酶活性的增加在一定程度上促進了其調(diào)控產(chǎn)物的積累量。由于衰敗期受到外界的光照、溫度、土壤水分含量等環(huán)境因子的刺激，植物會通過生理代謝上的策略，即加速次生代謝來應(yīng)對和克服脅迫條件[30]。因此，揮發(fā)性物質(zhì)的釋放與有關(guān)酶活性的研究對揭示百里香揮發(fā)性物質(zhì)釋放的物候節(jié)律也尤為必要。

本研究表明，在4個物候期從百里香葉片中共檢測出69種揮發(fā)性物質(zhì)，其中生長旺盛期釋放種類最多為53種，其次為開花期50種，結(jié)果期和衰敗期分別有43種和28種。百里香葉片揮發(fā)性物質(zhì)總釋放量在開花期和結(jié)果期顯著高于生長旺期和衰敗期。其中含量高于3.00 μg·g-1的揮發(fā)性物質(zhì)有11種，主要是烯烴類、醇類及芳香烴類物質(zhì)隨物候期變化表現(xiàn)出差異性特征。