何榮榮，嚴(yán)玉晶，王瑜婷，田清清，徐東婷，余欣彤，魏梅

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山528244）

土茯苓為百合科植物光葉菝葜Smilax glabraRoxb.的干燥根莖，始載于《本草經(jīng)集注》，別稱禹余糧、過(guò)山龍、刺豬苓等，其味甘、淡，性平，歸肝、胃經(jīng)，具有解毒、除濕、通利關(guān)節(jié)的功效[1]。土茯苓主要含有黃酮類、皂苷類、生物堿類、有機(jī)酸類、苯丙素類、鞣質(zhì)等多種有效成分，是治療痛風(fēng)的傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝損傷、免疫調(diào)節(jié)、利尿、抑菌等諸多藥理活性[2?6]。

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的土茯苓配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下只規(guī)定了落新婦苷的含量[7]，而中藥成分復(fù)雜多樣，單一指標(biāo)成分的定量分析模式，難以全面反映土茯苓配方顆粒的質(zhì)量，不能滿足中藥現(xiàn)代化對(duì)質(zhì)量控制的要求。一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi?components by single?maker,QAMS）是根據(jù)中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測(cè)定一個(gè)成分（對(duì)照品易得、穩(wěn)定者）即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分（對(duì)照品匱乏者）的同步測(cè)定[8]，是一種用于多成分質(zhì)量控制的新模式。本研究以相對(duì)價(jià)廉、易得的落新婦苷為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)相對(duì)校正因子（relative correction fator,RCF）計(jì)算各待測(cè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并與外標(biāo)法（esternal standard method,ESM）測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，考察QAMS 在土茯苓配方顆粒多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中的準(zhǔn)確性、適用性，以期為土茯苓配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters H?CLASS 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Agilent 1290型超高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；XP26型百萬(wàn)分之一天平、ME204E型萬(wàn)分之一天平（瑞士METTLER TDLEDO 公司）；Milli?Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck 公司）；KQ?500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

新落新婦苷（批號(hào)：DSTDX007701，純度≥98%）、新異落新婦苷（批號(hào)：DXTDX021601，純度≥98%）、異落新婦苷（批號(hào)：DXTDX007801，純度≥95%）對(duì)照品均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；落新婦苷（批號(hào)：111798?201805，純度93.6%）、黃杞苷（批號(hào)：111906?201102，純度93.7%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck公司）；乙酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水，其他試劑為分析純。10 批土茯苓配方顆粒（編號(hào)S1-S10）由廣東一方制藥有限公司制備，具體批號(hào)見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information table

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7]

色譜柱：Agilent ZORBAX SB?C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）?0.2%乙酸溶液（B）梯度洗脫（0～2 min，13%A；2～5 min，13%～17%A；5～14 min，17%～23%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：291 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷適量，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加60%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為49.705 6、46.949 8、48.222 0、49.666 4、47.149 8 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取土茯苓配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，供試品溶液色譜與混合對(duì)照品溶液色譜在相應(yīng)的保留時(shí)間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)UPLC色譜圖Figure 1 UPLC chromatograms of specificity test

2.4.2 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2、1、2、4、6、8 mL 置10 mL 量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，得線性混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2，表明各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷峰面積的RSD 值分別為0.05%、0.22%、0.13%、0.18%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取土茯苓配方顆粒（編號(hào)S1）適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.74%、1.30%、0.84%、0.51%、0.11%，其RSD 值分別為1.33%、1.46%、1.55%、1.34%、2.34%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取土茯苓配方顆粒（編號(hào)S1）適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷峰面積的RSD 值分別為0.57%、0.68%、0.34%、0.61%、1.41%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的土茯苓配方顆粒（編號(hào)S1）適量，研細(xì)，精密稱取9 份，每份約0.05 g，置具塞錐形瓶中，分為3組，分別精密加入相當(dāng)于供試品中各被測(cè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、100%、150%的混合對(duì)照品溶液（新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷質(zhì)量濃度分別為52.420 2、61.177 0、40.935 5、23.373 0、6.156 1 μg/mL），揮干溶劑，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表3，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.5 相對(duì)校正因子（RCF）的確定[9?10]

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以落新婦苷為內(nèi)標(biāo)物，按公式fj/s=fj/fs=（Aj*Cs）/（As*Cj）（As、Aj分別為內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)成分峰面積，Cs、Cj分別為內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)成分質(zhì)量濃度）計(jì)算新落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷的RCF，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6 耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性研究[11?12]

2.6.1 不同儀器及色譜柱對(duì)RCF 的影響以落新婦苷為內(nèi)標(biāo)物，考察其他4 種成分在Waters H?CLASS、Agilent 1290 型2 種超高效液相色譜系統(tǒng)，Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters CORTECS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Agilent ZORBAX SB?C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）3 種色譜柱下的RCF，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，各成分RCF 的RSD 均小于3%，表明不同的儀器和色譜柱對(duì)各成分RCF無(wú)顯著影響。

2.6.2 不同柱溫對(duì)RCF的影響采用Waters H?CLASS型超高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX SB?C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），考察3 種不同柱溫（25、30、35 ℃）對(duì)各成分RCF 的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。可見(jiàn)，各成分RCF的RSD 均小于3%，表明柱溫的變化對(duì)各成分RCF無(wú)顯著影響。

2.6.3 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響采用Waters H?CLASS 型超高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX SB?C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），考察3 種不同流速（0.2、0.3、0.4 mL/min）對(duì)各成分RCF的影響，結(jié)果見(jiàn)表7?？梢?jiàn)，各成分RCF 的RSD 均小于3%，表明流速的變化對(duì)各成分RCF無(wú)顯著影響。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 2 Results of linear relationship

表3 土茯苓配方顆粒中5種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Sample recovery test results of 5 components inSmilax glabraformula granules

表4 各成分的RCFTable 4 RCF of various constituents

表5 不同儀器、色譜柱下各成分的RCFTable 5 Effects of different instruments and columns on RCF

表6 不同柱溫下各成分的RCFTable 6 Effects of different column temperature on RCF

表7 不同流速下各成分的RCFTable 7 Effects of different flow rates on RCF

2.7 待測(cè)成分色譜峰的定位

一測(cè)多評(píng)法可利用相對(duì)保留時(shí)間法、保留時(shí)間差法來(lái)準(zhǔn)確定位各待測(cè)成分色譜峰[13?14]。本研究以落新婦苷為內(nèi)標(biāo)物，考察其他4 種成分在Waters H?CLASS、Agilent 1290 型2 種超高效液相色譜系統(tǒng)，Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Wa?ters CORTECS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Agi?lent ZORBAX SB?C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）3 種色譜柱下的相對(duì)保留時(shí)間，以此增加各定位組分的可信度，結(jié)果見(jiàn)表8?？梢?jiàn)，各成分相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于3%，表明采用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行色譜峰定位是可行的。

表8 各成分的相對(duì)保留時(shí)間Table 8 Relative retention time of various constituents

2.8 QAMS與ESM比較

取10 批土茯苓配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，運(yùn)用SPSS20.0 軟件對(duì)ESM 實(shí)測(cè)值和QAMS 計(jì)算結(jié)果進(jìn)行成對(duì)t檢驗(yàn)及Pearson相關(guān)系數(shù)（r）分析，結(jié)果見(jiàn)表9?？梢?jiàn)，2 種方法之間的相關(guān)系數(shù)r均為1.000，t檢驗(yàn)顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明建立的QAMS準(zhǔn)確、可行。

表9 ESM與QAMS測(cè)定結(jié)果比較Table 9 Comparison of results obtained by ESM and QAMS method w/（g·100 mg-1）

3 討論

中藥成分的復(fù)雜性和多效性致使單一指標(biāo)成分的定量測(cè)定難以體現(xiàn)其整體質(zhì)量，建立多成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法能更全面地反映其內(nèi)在質(zhì)量。傳統(tǒng)的ESM 進(jìn)行多成分檢測(cè)時(shí)需用到多種對(duì)照品，且有些中藥化學(xué)對(duì)照品價(jià)格昂貴、不易獲得，QAMS只需1 種對(duì)照品即可計(jì)算其他多個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可以有效解決對(duì)照品稀缺問(wèn)題，節(jié)約檢驗(yàn)成本、提高檢測(cè)效率。

土茯苓的主要有效成分為黃酮類化合物，包括黃酮醇類、二氫黃酮類、異黃酮類和黃烷醇類等，這些成分與其抗炎、抗癌、抑菌等藥理作用密切相關(guān)[15]。已有將QAMS應(yīng)用于土茯苓藥材中5種黃酮類成分含量測(cè)定的報(bào)道，結(jié)果表明建立的方法穩(wěn)定可行[16]。中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等工序制得的一種顆粒劑，具有療效確切、服用方便、患者順應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的發(fā)展前景，對(duì)其產(chǎn)品質(zhì)量的全面把控也尤為重要。本研究將新落新婦苷、落新婦苷、新異落新婦苷、異落新婦苷、黃杞苷5種黃酮類成分作為土茯苓配方顆粒質(zhì)量控制的指標(biāo)，選擇化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定且價(jià)格適中的落新婦苷為內(nèi)標(biāo)物，建立了土茯苓配方顆粒中5 種黃酮類成分的QAMS，確定了4 種成分的RCF。結(jié)果表明，不同儀器、色譜柱、柱溫及流速等外部條件對(duì)RCF 無(wú)顯著影響，且各待測(cè)成分色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間均穩(wěn)定。采用QAMS 與ESM 2種方法測(cè)定10 批土茯苓配方顆粒中5 種黃酮類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，所得結(jié)果基本一致，說(shuō)明建立的QAMS 法科學(xué)、可靠，可為土茯苓配方顆粒多指標(biāo)質(zhì)量控制研究提供參考。