江潔怡，黃華靖，楊敏娟，李素梅，李養(yǎng)學(xué)，畢曉黎

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東廣州510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405）

慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下及淋巴組織的慢性炎癥，具有發(fā)病率高、病程久、復(fù)發(fā)率高、癥狀頑固、不易治愈等特點，嚴(yán)重影響著人們的正常生活。慢性咽炎屬中醫(yī)“喉痹”病證范疇[1]，清肺利咽顆粒為廣東省第二中醫(yī)院在中醫(yī)藥理論的基礎(chǔ)上，根據(jù)中醫(yī)臨床經(jīng)驗處方開發(fā)而成的院內(nèi)制劑，由玄參、天冬、知母、炒白芍、蟬蛻、射干、西青果、木蝴蝶、甘草、桔梗組成，其中玄參清熱涼血、瀉化滋陰，天冬養(yǎng)陰潤燥、清肺生津，知母清熱瀉火、滋陰潤燥，炒白芍養(yǎng)血斂陰，蟬蛻疏散風(fēng)熱、利咽開音，射干清熱解毒、消痰利咽，西青果清熱生津、利咽解毒，木蝴蝶清肺利咽，甘草酸甘化陰、調(diào)和諸藥，桔梗祛痰利咽、引藥入經(jīng)，諸藥合用，共奏清熱養(yǎng)陰、利咽生津之功，臨床上對慢喉痹虛火上炎證有良好的療效。

該制劑臨床應(yīng)用多年，療效確切，深受患者喜愛，為了進(jìn)一步的開發(fā)推廣，本課題組前期已采用薄層色譜法（TLC）建立了方中玄參、知母、炒白芍、甘草4 味藥的定性鑒別方法，同時采用高效液相色譜法（HPLC）建立方中芒果苷的含量測定方法，但以上方法指標(biāo)成分單一，難以對其內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行全面控制。指紋圖譜是基于多指標(biāo)成分對中藥制劑進(jìn)行質(zhì)量控制的有效手段，指紋圖譜結(jié)合模式識別方法能有效彌補(bǔ)現(xiàn)有質(zhì)量控制方法的不足[2]。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）對12批清肺利咽顆粒進(jìn)行指紋圖譜研究，應(yīng)用指紋圖譜相似度評價結(jié)合主成分分析法進(jìn)行分析，為清肺利咽顆粒的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，為其開發(fā)成為安全有效、穩(wěn)定可控的中藥制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

Agilent 1290 色譜儀（美國Agilent 公司）；KQ5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER XS205 DU 型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler?Toledo 公司）；HH?8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；Milli?Q Advan?tage A10自動純水機(jī)（美國MilliPore公司）。

乙腈、磷酸等液相用試劑為色譜純（德國Merck公司），水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司），其余試劑均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）；清肺利咽顆粒[批號：20181001、20181002、20181003、20190401、20190402、20190403、20191001、20191002、20191003、20200401、20200402、20200403，依次編號為S1-S12，規(guī)格：每袋裝15 g（每1 g 相當(dāng)于飲片1.40 g）]由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供；沒食子酸（批號：110831?201204，純度：91.5%）、芒果苷（批號：111607?200402，純度：98.1%）、芍藥苷（批號：110736?201741，純度：96.8%）、鞣花酸（批號：111959?201606，純度：88.8%）、射干苷（批號：111632?200501，純度：98.7%）、黃芩苷（批號：110715?201821，純度：95.4%）、肉桂酸（批號：110786?201604，純度：98.8%）、黃芩素（批號：111595?201808，純度：97.9%）、次野鳶尾黃素（批號：111557?200602，純度：99.9%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；羥基芍藥苷（批號：Q?019?160627，純度：＞98%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號：S?011?180908，純度：＞98%）、甘草酸銨（批號：G?003?150917，純度：＞98%）對照品均購于成都瑞芬思生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters Cortecs T3（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）為色譜柱；柱溫為25 ℃；以乙腈（A）?0.1%磷酸（B）為流動相，進(jìn)行梯度洗脫（0～3 min，5%→8%A；3～18 min，8%→25%A；18～25 min，25%→40%A；25～29 min，40%→60%A）；流速為0.35 mL/min；檢測波長為245 nm、280 nm；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液取清肺利咽顆粒適量，研細(xì)，精密稱取約2 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：300 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，并用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，超速離心（轉(zhuǎn)速：10 000 r/min）5 min，取上清，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液分別精密稱取沒食子酸、羥基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芒果苷、芍藥苷、鞣花酸、射干苷、黃芩苷、肉桂酸、黃芩素、甘草酸銨、次野鳶尾黃素對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 含343.6、1310、159.1、218.4、306.2、256.0、103.6、247.1、21.36、223.8、135.6、151.2 μg的對照品溶液，備用。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗取同一供試品溶液（S12），按“2.1”項色譜條件，連續(xù)測定6 次，記錄色譜圖，以芍藥苷（8 號峰）為參照，計算出23 個共有峰的相對保留時間（RRT）及相對峰面積（RPA），結(jié)果RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液（S12），按“2.1”項色譜條件，分別于供試品溶液制備后第0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測試，記錄色譜圖，以芍藥苷（8 號峰）為參照，計算出23個共有峰的RRT及RPA，結(jié)果RSD 均小于2%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗分別取同一批次樣品（S12），按“2.2”項供試品溶液制備方法，平行處理6 份供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以芍藥苷（8 號峰）為參照，計算出23 個共有峰的RRT 及RPA，結(jié)果RSD 均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度評價分別取12批清肺利咽顆粒樣品，按“2.2”項方法制備供試品溶液，再分別精密吸取各對照品溶液適量，加甲醇配制成分別含沒食子酸34.36 μg/mL、羥基芍藥苷39.30 μg/mL、芍藥內(nèi)酯苷7.955 μg/mL、芒果苷10.92 μg/mL、芍藥苷45.92 μg/mL、鞣花酸51.20 μg/mL、射干苷5.180 μg/mL、黃芩苷12.36 μg/mL、肉桂酸2.136 μg/mL、黃芩素11.19 μg/mL、甘草酸銨13.56 μg/mL、次野鳶尾黃素7.560 μg/mL 的混合對照品溶液，吸取上述混合對照品溶液1 μL，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣測定，同時記錄245 nm、280 nm 下色譜圖，并分別將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2.0 版）”，以S12 為參照圖譜，以中位數(shù)法，時間窗0.1 min，全譜自動匹配，生成對照指紋圖，見圖1-2。共標(biāo)定了23 個峰為特征峰，通過與對照品保留時間及紫外吸收光譜比對，歸屬指認(rèn)了其中2 號峰為沒食子酸、4 號峰為羥基芍藥苷、5 號峰為芍藥內(nèi)酯苷、6 號峰為芒果苷、8 號峰為芍藥苷、10號峰為鞣花酸、11號峰為射干苷、16號峰為黃芩苷、17號峰為肉桂酸、19號峰為黃芩素、21號峰為甘草酸銨、22號峰為次野鳶尾黃素，見圖3。

圖1 12 批清肺利咽顆粒UPLC 疊加圖譜和對照指紋圖譜（245 nm）Figure 1 UPLC characteristic chromatograms overlapping and comparison fingerprint of 12 batches of Qingfei Liyan granule(245 nm)

12 批清肺利咽顆粒供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.99，見表1。結(jié)果表明，12批次樣品所含化學(xué)成分相似，清肺利咽顆粒原藥材質(zhì)量與制劑工藝較穩(wěn)定。

2.3.5 化學(xué)模式識別分析

圖2 12 批清肺利咽顆粒UPLC 疊加圖譜和對照指紋圖譜（280 nm）Figure 2 UPLC characteristic chromatograms overlapping and comparison fingerprint of 12 batches of Qingfei Liyan granule(280 nm)

圖3 清肺利咽顆粒UPLC圖譜Figure 3 UPLC chromatograms of Qingfei Liyan granule

表1 相似度評價結(jié)果Table 1 Similarity evaluation results

2.3.5.1 聚類分析以指紋圖譜中23 個共有峰的峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后數(shù)據(jù)為變量，運(yùn)用SPSS 26.0 軟件對12 批清肺利咽顆粒樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（CA），采用組間聯(lián)接聚類法，選取平方Euclidean 距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)，全距從0～1作標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。從樹狀圖結(jié)果得知，當(dāng)平方Euclidean距離為15時，12個樣品被分為兩類，S7-S9為一類，其他批次聚為一類，其中S7-S9 批次為2019 年10月生產(chǎn)的3 批樣品，聚類分析能將不同時間生產(chǎn)的樣品進(jìn)行初步的分類，表明清肺利咽顆粒的質(zhì)量受到原藥材質(zhì)量等條件影響，為制劑生產(chǎn)的原藥材質(zhì)量把控提供了實驗依據(jù)。

圖4 系統(tǒng)聚類分析圖Figure 4 System cluster analysis

2.3.5.2 主成分分析以指紋圖譜中23個共有峰的峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后數(shù)據(jù)為變量，運(yùn)用SIMCA 14.1軟件對12 批清肺利咽顆粒樣品進(jìn)行主成分分析（principal components analysis, PCA），選取特征值最大的兩個主成分進(jìn)行擬合分析，其累積方差貢獻(xiàn)率分別為70.01%、84.8%，得到12 批清肺利咽顆粒樣品的PCA 得分圖，見圖5。結(jié)果顯示所有樣品均在95%可信區(qū)間內(nèi)，且能分為兩類，S7-S9 為一類，其他批次為一類，與CA分析結(jié)果一致。

圖5 PCA分析得分圖Figure 5 PCA score

以指紋圖譜中23 個共有峰的峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理后數(shù)據(jù)為變量，運(yùn)用SPSS 26.0 軟件對12 批清肺利咽顆粒樣品進(jìn)行PCA 分析，以特征值大于3 為判斷標(biāo)準(zhǔn)，得主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率和主成分因子載荷矩陣，見圖6、表2-3。其中，前2個成分的特征值分別為16.10、3.413，累計方差貢獻(xiàn)率分別為70.01%、84.8%，表明前2 個主成分能夠充分體現(xiàn)出樣品的基本特征和主要信息，與SIMCA 14.1結(jié)果一致。通過因子載荷矩陣得知，峰1、2（沒食子酸）、3、4（羥基芍藥苷）、5（芍藥內(nèi)酯苷）、6（芒果苷）、8（芍藥苷）、9、11（射干苷）、12、15、16（黃芩苷）、17（肉桂酸）、18、19（黃芩素）、20、21（甘草酸銨）、22（次野鳶尾黃素）、23在主成分1上有較高載荷，對主成分1 產(chǎn)生主要影響；峰6（芒果苷）、7、10（鞣花酸）在主成分2 上有較高載荷，對主成分2 產(chǎn)生主要影響。表明上述成分在特征變量的重要性評估中具有優(yōu)勢，對其進(jìn)行含量監(jiān)測，對清肺利咽顆粒的質(zhì)量控制具有重要的意義。

圖6 PCA分析碎石圖Figure 6 PCA scree plot

表2 特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalue and variance contribution rate

表3 主成分因子載荷矩陣Table 3 Factor loading matrix

3 討論

由于復(fù)方制劑成分復(fù)雜，不同組成在不同波段的吸收強(qiáng)度有較大的差異，在檢測波長考察過程中，采用紫外210～400 nm 全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)245 nm 處，能包含絕大部分成分的色譜峰，但仍有部分成分245 nm 不出峰或吸收較弱；而同時對280 nm 進(jìn)行檢測，可兼顧245 nm下不出峰的成分，且280 nm 接近部分含測指標(biāo)成分的最大吸收，在此波長下進(jìn)行含量測定，可增加結(jié)果的準(zhǔn)確度，故最終選擇同時檢測245 nm、280 nm。先后考察了不同色譜柱（Waters CORTECS UPLC T3、Waters ACQUI?TY UPLC BEH Shield RP C18、Phenomenex Kinetex XB C18）、不同流動相體系（乙腈?水、乙腈?0.1%甲酸、甲醇?0.1%磷酸）、不同柱溫（20、25、30 ℃）以及不同流速（0.25、0.30、0.35 mL/min），最終確定了“2.1”項下色譜條件。

清肺利咽顆粒由玄參、天冬、知母、炒白芍、蟬蛻、射干、西青果、木蝴蝶、甘草、桔梗等水煎、濃縮、制粒而成，其中玄參中的肉桂酸成分，具有抗氧化、抗菌、神經(jīng)保護(hù)等作用[3?4]；知母所含的芒果苷具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗炎、抗菌等作用[5?6]；以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為代表的單萜及其苷類成分是白芍中公認(rèn)的藥效物質(zhì)，具有廣泛的抗炎鎮(zhèn)痛、減毒增效等作用[7?8]；沒食子酸、鞣花酸等多酚是西青果中主要藥效成分，具有抗氧化、抗炎抑菌等作用[9?11]；黃芩苷、黃芩素等黃酮類成分為木蝴蝶發(fā)揮抗氧化、抗炎抑菌藥理作用的主要成分[12?13]；射干苷、次野鳶尾黃素等黃酮類成分是射干中的主要藥效成分，具有抗氧化、抗炎抑菌等作用[14?15]；甘草具有清熱解毒、祛痰止咳的作用，其中甘草酸具有抑菌、抗病毒等作用[16?17]。本研究建立了全方指紋圖譜，并對方中所含的沒食子酸、羥基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芒果苷、芍藥苷、鞣花酸、射干苷、黃芩苷、肉桂酸、黃芩素、甘草酸銨、次野鳶尾黃素等12個成分進(jìn)行指認(rèn)與控制，指標(biāo)成分兼顧君臣佐使，對清肺利咽顆粒的質(zhì)量控制達(dá)到整體、全面的效果。

據(jù)報道，方中玄參、知母、桔梗等藥味中，仍存在系列的皂苷類活性成分，此類成分難以通過紫外檢測器進(jìn)行測定，需采用蒸發(fā)光檢測器（ELSD）等[18]，下一步將繼續(xù)對其測定方法進(jìn)行探索。

12 批清肺利咽顆粒指紋圖譜相似度較高，制備工藝、質(zhì)量較穩(wěn)定，質(zhì)量差異主要表現(xiàn)在各成分含量上，各批次之間的成分含量差異可能與投料藥材的產(chǎn)地、采收期等因素有關(guān)，仍需對其藥材來源進(jìn)行進(jìn)一步的分析、控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。本研究僅從化學(xué)成分層面出發(fā)，對清肺利咽顆粒質(zhì)量進(jìn)行控制，下一步可結(jié)合藥理研究，明確其質(zhì)量標(biāo)志物，保證產(chǎn)品的安全、有效。