孫新新 迪麗努爾·阿卜拉 劉濤 羅甜甜 王邦耀 陳越 劉奕杉

[摘要]目的：探討0.1%納米銀溶液用于根管封藥對慢性根尖周炎大鼠RORγT、IL-17、Foxp3表達(dá)的影響。方法：對40只雄性大鼠雙側(cè)下頜第一磨牙開髓建立根尖周炎模型，術(shù)后2周處死4只大鼠用RVG+HE判斷造模成功，將剩余36只大鼠隨機均分為空白對照組（K組），氫氧化鈣組（Q組）及0.1%納米銀溶液組（N組）。于用藥后7、14、21 d各組隨機處死4只大鼠，免疫組織化學(xué)檢測Foxp3表達(dá)，qRT-PCR檢測RORγT、IL-17的表達(dá)。結(jié)果：免疫組化顯示3組于用藥7、14、21 d時Foxp3表達(dá)呈逐漸上升趨勢，N、Q組均高于K組（P<0.05）。qRT-PCR顯示，N組RORγT、IL-17表達(dá)在14、21 d均低于K組（P<0.05），21 d時，N較Q組IL-17表達(dá)無差異（P>0.05），RORγT表達(dá)有差異（P<0.05）。結(jié)論：0.1%納米銀溶液用于根管封藥效果好，可降低RORγT、IL-17水平，促進(jìn)Foxp3的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]0.1%納米銀溶液;慢性根尖周炎;RORγT;IL-17;Foxp3

[中圖分類號]R781.34? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）03-0087-03

Effects of 0.1% Nano-silver Solution on the Expression of RORγT， IL-17 and Foxp3 in Rats with Chronic Periapical Inflammation

SUN Xinxin1，Dilinuer·ABULA1，LIU Tao2，LUO Tiantian1，WANG Bangyao1，CHEN Yue1，LIU Yishan1

[1.Department of Pediatric Stomatology-Oral Prophylaxis，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University（Affiliated Stomatological Hospital），Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Stomatology，Urumqi 830000，China; 2.Medical Laboratory Center of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China]

Abstract： Objective To investigate the effect of 0.1% nano-silver solution as root canal sealing agent on the expression levels of RORγT， IL-17 and Foxp3 in rats with chronic periapical inflammation. Methods The model of periapical inflammation was established by opening the pulp of the first mandibular molars of rats. Two weeks after surgery， Hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to judge the success of modeling. The rats were randomly divided into blank control group （K group）， calcium hydroxide paste group （Q group） and 0.1% nano silver solution group （N group）. Four rats in each group were randomly sacrificed on day 7， 14 and 21 after administration， and Foxp3 expression was detected by immunohistochemistry. Quantitative real-time polymerase chain reaction （QRT-PCR） was used to detect the expression of RORγT and IL-17. Results Immunohistochemistry showed that Foxp3 expression in group N was significantly higher than that in group K （P<0.05）， and increased gradually with the extension of medication time. QRT-PCR showed that the expression of RORγT and IL-17 in N group was lower than that in K group at 7， 14 and 21 days （P<0.05）， and decreased gradually with time. Conclusion? 0.1% nano silver solution was effective for root canal sealing， which could reduce RORγT and IL-17 levels and promote Foxp3 expression.

Key words： 0.1% nano-silver solution; chronic periapical disease; RORγT; IL-17; Foxp3

慢性根尖周炎是牙齒根尖部及其周圍組織的慢性炎癥，主要由細(xì)菌感染引起，就診率高，嚴(yán)重時可影響患者生活質(zhì)量[1]。其主要病理表現(xiàn)是根尖周組織的炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞，若能抑制炎癥的發(fā)生，根尖周炎的進(jìn)展便會被明顯抑制。

氫氧化鈣在根管消毒中至關(guān)重要，可有效清除病原體，防止疾病復(fù)發(fā)。但有研究表明，氫氧化鈣滲入牙本質(zhì)小管深度有限，封藥后難以徹底清除[2]。納米銀作為一種新型抑菌材料，有較強滲透及殺菌作用，應(yīng)用較為廣泛[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Th17和Treg細(xì)胞在慢性根尖周炎進(jìn)展中分別發(fā)揮著相反的生物學(xué)作用。因此，本研究擬建立實驗性根尖周炎模型，采用0.1%納米銀溶液用于根管封藥治療慢性根尖周炎，探討其對根尖周組織中Th17型細(xì)胞因子（IL-17、RORγT）及Treg型細(xì)胞因子（Foxp3）的影響，以期為探尋新型根管消毒藥物提供實驗依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：選用40只5周齡SD雄性大鼠，體重（150±5）g（由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會實驗動物福利倫理分會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IACUC20201225-23）

1.2 動物模型建立和分組：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg），仰臥固定，1/4球鉆對雙側(cè)下頜第一磨牙開髓，15#K銼清理。術(shù)后2周隨機處死4只大鼠RVG+HE判斷造模成功（詳見結(jié)果2.1），將剩余36只大鼠隨機分為空白對照組（K組），氫氧化鈣組（Q組）及0.1%納米銀溶液組（N組），每組12只。其中K組對根管行疏通、預(yù)備、沖洗，隔濕干燥后，置入PBS棉球;Q組置入氫氧化鈣糊劑;N組置入0.1%的納米銀溶液棉球。進(jìn)口玻璃離子充填暫封窩洞，調(diào)整咬合及高點。于用藥后7、14、21 d各組隨機處死4只大鼠，免疫組織化學(xué)檢測Foxp3表達(dá)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）檢測RORγT、IL-17的表達(dá)。

1.3 組織學(xué)檢查（HE+免疫組織化學(xué)）：用藥7、14、21 d后，大鼠左側(cè)下頜骨去盡牙齦等軟組織，4%多聚甲醛溶液固定48 h，EDTA脫鈣液脫鈣30 d，乙醇梯度脫水后浸蠟包埋。沿磨牙長軸近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片4 μm，蘇木素伊紅（HE）染色。切片行胃蛋白酶抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加一抗，以PBS代替一抗作為空白對照，4℃孵育過夜。次日按試劑盒說明書行免疫組化染色，顯微鏡下觀察Foxp3表達(dá)并采圖。用ImagePro Plus 6.0軟件半定量分析Foxp3表達(dá)并計算平均光密度值。

1.4 qRT-PCR

1.4.1 RNA提取：取用藥7、14、21 d后大鼠右側(cè)下頜第一磨牙根尖周骨組織樣品，液氮研磨、Trizol法提取并純化組織的RNA，選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的標(biāo)本放于-80°冰箱保存或立即PCR。

1.4.2 qRT-PCR反應(yīng)：采用二步法將RNA反轉(zhuǎn)錄為對應(yīng)的cDNA模板，根據(jù)PCR試劑盒于PCR儀行擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 ul：上下游引物各1.4 ul，模板cDNA 2.0 ul。反應(yīng)條件：95℃、2 min;95℃、5 s;59℃、30 s，循環(huán)40次。每組樣本設(shè)3個復(fù)孔，GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct法分析基因的相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用xˉ±s表示，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 大鼠慢性根尖周炎模型的建立（RVG+HE）：如圖1A箭頭處所示，術(shù)后2周，RVG結(jié)果可見隨機抽取的大鼠根尖部有明顯的低密度暗影;如圖1B箭頭處所示，HE染色結(jié)果顯示，牙髓壞死，根尖區(qū)病灶可見淋巴細(xì)胞浸潤。

2.2 組織學(xué)變化：K組于未用藥14 d時Foxp3表達(dá)隨著炎癥的進(jìn)展開始緩慢升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;Q組用藥7、14、21 d時，F(xiàn)oxp3表達(dá)逐漸升高，組內(nèi)對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;N組用藥14、21 d時，F(xiàn)oxp3表達(dá)高于K組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），用藥14、21 d時N與Q組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2～3。

2.3 qRT-PCR結(jié)果：用藥7、14、21 d，N、Q組IL-17表達(dá)較K組均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但N組較Q組IL-17表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。用藥7 d，N、Q組RORγT表達(dá)較K組下降無統(tǒng)計學(xué)意義，N組較Q組RORγT表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。用藥14 d，N、Q組RORγT表達(dá)較K組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），N組較Q組RORγT表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。用藥21 d，N、Q組RORγT表達(dá)較K組下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），N組較Q組RORγT表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2～3。

3? 討論

Th17細(xì)胞以分泌IL-17為特征，需要RORγT參與啟動其增殖及分化過程，具有促炎作用[4]。目前，在人和大鼠慢性根尖周炎病變組織中已檢測到IL-17表達(dá)[5]。RORγT在健康根尖周組織中幾乎不表達(dá)，在根尖周病變組織中其表達(dá)量顯著升高[6]。此外，在被敲除RORγT基因的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及IL-17的表達(dá)較正常小鼠顯著減少。研究認(rèn)為，一定程度上RORγT的含量可大致代表Th17細(xì)胞含量。

Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，以表達(dá)Foxp3為特點，分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，控制免疫介導(dǎo)的組織損害[7]。有文獻(xiàn)報道，Treg參與調(diào)節(jié)慢性根尖周炎進(jìn)程，發(fā)揮抑炎及促炎雙向調(diào)節(jié)作用[8]。Foxp3在根尖周病慢性期表達(dá)增高，提示Foxp3可抑制過度活化的T細(xì)胞，保護(hù)機體免受過度炎癥反應(yīng)造成的組織損傷[9]。Th17和Treg細(xì)胞正常狀態(tài)下二者保持相對穩(wěn)定，當(dāng)慢性根尖周炎發(fā)生時，將誘導(dǎo)Th17分泌增加，導(dǎo)致Th17/Treg比例失衡，加速慢性根尖周炎進(jìn)展[10]。因此，對大鼠根尖周組織中IL-17、RORγT及Foxp3水平的檢測，可大致反映Th17和Treg的表達(dá)變化，為臨床治療提供依據(jù)。

另有研究發(fā)現(xiàn)納米銀滲透作用及生物安全性好，易去除，已應(yīng)用于各種領(lǐng)域。納米銀的抑菌效果和相對細(xì)胞毒性與其濃度呈正相關(guān)[11-12];濃度低于25 g/L的納米銀顆粒無細(xì)胞毒性。加入納米銀的新型根管封閉劑可再生牙本質(zhì)礦物質(zhì)，增加牙本質(zhì)硬度[13];納米顆?？咕鷦┮蚰芷茐纳锬げ⒎乐辜?xì)菌粘附，已被提出作為治療根管內(nèi)感染的替代方案[14]。當(dāng)前，也有研究顯示，0.1%納米銀溶液的應(yīng)用對根尖周組織無刺激性[15]，較為安全。

qRT-PCR結(jié)果示N、Q組在14、21 d時IL-17、RORγT表達(dá)較K組均下調(diào)，21 d時，N較Q組IL-17表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義，RORγT表達(dá)有差異。免疫組化結(jié)果示K組隨慢性期延長Foxp3表達(dá)增高，但未有效終止炎癥。N、Q組Foxp3表達(dá)較K組上升，且21 d較7 d增加有顯著性差異，提示Treg分泌的抑炎因子數(shù)量及效能的增加，可減輕根尖周組織病損。以上結(jié)果表明納米銀的應(yīng)用可抑制炎癥因子表達(dá)，并促進(jìn)Foxp3分泌，使Th17/Treg免疫平衡恢復(fù)正常，促進(jìn)根尖周組織恢復(fù)，進(jìn)一步驗證了Th17/Treg免疫平衡的機制。

綜上所述，0.1%納米銀溶液能有效控制根尖周組織炎癥，可降低IL-17、RORγT表達(dá)，提高Foxp3水平，這為探尋新的根管消毒藥物提供了新的研究思路。本研究不足之處在于僅探討了封藥7、14、21 d時0.1%納米銀溶液的效果，其長遠(yuǎn)療效及納米銀最佳抑菌效果在后續(xù)細(xì)胞或動物實驗中需建立時間或藥物濃度梯度以進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2021-09-14

本文引用格式：孫新新，迪麗努爾·阿卜拉，劉濤，等.0.1%納米銀溶液對慢性根尖周炎大鼠RORγT、IL-17及Foxp3表達(dá)的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，31（3）：87-90.