祁永章 陳亞莉 王滋興 曹曉婷 沈從墨

[摘要]目的：研究紅景天苷在高海拔地區(qū)干預(yù)大鼠創(chuàng)傷性慢性創(chuàng)面后對創(chuàng)面愈合的影響、微血管的表達(dá)及LDH活性檢測。方法：選取75只成年SD雄性大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，每組25只，并進(jìn)行創(chuàng)傷造模。造模完成后，一般創(chuàng)面組只用生理鹽水紗布濕敷創(chuàng)面，慢性創(chuàng)面組在此基礎(chǔ)上連續(xù)肌注7 d氫化可的松（80 mg/kg），紅景天苷組則連續(xù)肌注7 d氫化可的松（80 mg/kg），并在創(chuàng)面濕敷溶有紅景天苷的生理鹽水紗布。通過分光光度計(jì)分別檢測造模3、7、14 d后各組的乳酸脫氫酶（LDH）活性。HE染色及CD31免疫組織化學(xué)染色，觀察第14天肉芽組織的新生毛細(xì)血管分布情況及微血管密度。第7、14、21、28 d觀察各組創(chuàng)面愈合情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。結(jié)果：紅景天苷組LDH活性在造模后3、7、14 d均低于一般創(chuàng)面組及慢性創(chuàng)面組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第14天時(shí)，紅景天苷組HE染色下創(chuàng)面新生毛細(xì)血管，CD31免疫組織化學(xué)染色下CD31表達(dá)及微血管密度均高于一般創(chuàng)面組及慢性創(chuàng)面組（P<0.05）。紅景天苷組創(chuàng)面愈合率明顯高于一般創(chuàng)面組及慢性創(chuàng)面組（P<0.05），紅景天苷組創(chuàng)面愈合情況最好，皮膚邊緣纖維組織增生最少，創(chuàng)面未見明顯滲出及炎癥反應(yīng)。結(jié)論：紅景天苷干預(yù)可促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷性慢性創(chuàng)面的愈合，促進(jìn)微血管生成，減輕組織損傷，加速創(chuàng)面愈合。

[關(guān)鍵詞]高海拔地區(qū);紅景天苷;大鼠;慢性創(chuàng)面;創(chuàng)面愈合率;乳酸脫氫酶

[中圖分類號]R632.1? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2022）03-0096-04

Study on the Role of Salidroside in Traumatic Chronic Wound Healing in High

Altitude Area

QI Yongzhang，CHEN Yali，WANG Zixing，CAO Xiaoting，SHEN Congmo

（Department of Burns and Plastic Surgery，Affiliated Hospital of Qinghai University，Qinghai 810000，Xining，China）

Abstract： Objective To study the effect of salidroside on wound healing， microvascular expression and LDH activity after intervening in traumatic chronic wound in rats at high altitude. Methods Forty five SD male rats were selected to make trauma models.The rats were divided into 3 groups according to the random number table method，which were general wound group，chronic wound group and salidroside group.In the general wound group， only normal saline gauze was used to wet compress the wound， in the chronic wound group， hydrocortisone（80 mg/kg） was injected intramuscularly for 7 days，and in salidroside group， hydrocortisone （80 mg/kg） was injected intramuscularly for 7 days， and salidroside dissolved normal saline gauze was wet applied to the wound.The activity of lactate dehydrogenase （LDH） in each group was detected by spectrophotometer in 3rd， 7th， 14th day.Hematoxylin eosin staining and CD31 immunohistochemical staining were performed to observe the distribution of new capillaries and microvessel density in granulation tissue on 14th day . The wound healing of each group was observed on the 7th，14th，21st，28th day to observation and the wound healing rate was calculated. Results LDH activity in salidroside group was lower than that in general wound group and chronic wound group at 3rd， 7th and 14th days，the comparative differences were statistically significant（P<0.05）. On the 14th day， the expression of CD31 and microvessel density in salidroside group were higher than those in general wound group and chronic wound group，the comparative differences were statistically significant（P<0.05）. The wound healing rate of salidroside group was significantly higher than that of general wound group and chronic wound group，the comparative differences were statistically significant（P<0.05）. The wound healing in salidroside group was the best， the proliferation of fibrous tissue on the edge of the skin was the least， and there was no obvious exudation and inflammatory reaction on the wound. Conclusion The intervention of salidroside can promote the healing of chronic traumatic wounds in rats， promote microangiogenesis， reduce tissue damage， and accelerate wound healing.

Key words： high altitude areas; salidroside; rats; chronic wounds; wound healing rate; LDH

青海省深居內(nèi)陸，最高海拔達(dá)6 851 m，最低海拔1 644 m，平均海拔3 000 m以上。青海屬于高原大陸性氣候，日照時(shí)間長、輻射強(qiáng)、缺氧、是導(dǎo)致慢性創(chuàng)面形成的重要外在因素[1]。而深度燒傷、糖尿病足、放射性損傷、壓瘡等，則是形成慢性創(chuàng)面的主要原因[2]。紅景天全株都可入藥，其有效單體是紅景天苷及和苷元酪醇，在創(chuàng)面愈合、耐缺氧及抗氧化應(yīng)激等方面有作用[3]。創(chuàng)面修復(fù)愈合的過程離不開新鮮肉芽組織及新生血管的生成，CD31作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)物，促進(jìn)細(xì)胞的黏附運(yùn)動(dòng)及血管生成[4]。紅景天耐缺氧作用的機(jī)制可能是通過不減少血液CO2含量使血液保持正常pH度，減輕氧離曲線左移而減少組織缺氧[5]。乳酸脫氫酶（LDH）是微生物中催化苯丙酮酸生成苯乳酸的一類關(guān)鍵酶，研究表明[6]可能主要是由于劇烈運(yùn)動(dòng)、創(chuàng)傷后導(dǎo)致心肌、骨骼肌等組織的細(xì)胞膜頭痛性上升，從而致使漏出的酶含量上升，進(jìn)一步使血清酶活性增加。有研究示兩個(gè)不同海拔地區(qū)（青海及河北）的牦牛心肌酶活性、機(jī)體代謝功能及抗氧化能力存在一定差異，較高海拔地區(qū)的牦牛長期身處低氧環(huán)境，逐漸產(chǎn)生高原適應(yīng)性[7]。本研究選用高海拔地區(qū)SD大鼠，制備大鼠創(chuàng)傷性慢性創(chuàng)面，并使用紅景天苷進(jìn)行治療，觀察在高海拔地區(qū)創(chuàng)面愈合、微血管的表達(dá)及LDH活性檢測的變化，并觀察紅景天苷是否可有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合，初步探討其相關(guān)機(jī)制，為高海拔地區(qū)慢性創(chuàng)面患者的治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級健康3月齡SD雄性大鼠75只，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，體重（290±15）g。動(dòng)物安全使用合格證號：SCXK（湘）2016-0002。實(shí)驗(yàn)大鼠均適應(yīng)性生長7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該研究經(jīng)過青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批，倫理批號：YJ-SJ-20190009。

1.2 主要試劑：蘇木素、伊紅染色液（武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司）;CD31兔多克隆抗體（美國Abcam公司）;山羊血清、山羊抗兔工作液、DAB染色劑（北京中杉金橋生物有限公司）。

1.3 主要儀器：脫水包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)（德國萊卡公司）;倒置光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;分光光度計(jì)（山東奧萊機(jī)械有限責(zé)任公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及造模：選取成年雄性健康大鼠75只，數(shù)字隨機(jī)法分為3組，一般創(chuàng)面組、慢性創(chuàng)面組及紅景天苷組，每組25只。用電子秤稱取75只健康雄性大鼠體重并記錄，用碘伏消毒注射部位后按150 mg/kg的鹽酸氯胺酮進(jìn)行腹腔注射麻醉。背部脫毛，用3.0 cm×3.0 cm的卡片在脫毛區(qū)用縫合線固定四周標(biāo)記造模面積，準(zhǔn)備一次性無菌切開包及其他物品，待麻醉生效后，用碘伏消毒3遍大鼠背部皮膚備皮處（注意大鼠保暖，減少死亡率），沿標(biāo)記線剪去皮下組織至肌筋膜，止血，形成大鼠全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面模型[8]。見圖1。

1.4.2 一般創(chuàng)面組：造模后，將2 ml生理鹽水滴于單層紗布后覆蓋于創(chuàng)面。自實(shí)驗(yàn)前1 d起，肌注青霉素鉀鹽（4 000單位/只），連續(xù)4 d，以預(yù)防感染。創(chuàng)面隔日換藥，常規(guī)沖洗及包扎。

1.4.3 慢性創(chuàng)面組：造模后，即刻肌肉注射氫化可的松（80 mg/kg），連續(xù)注射7 d，2 ml生理鹽水滴于單層紗布后覆蓋于創(chuàng)面。自實(shí)驗(yàn)前1 d起，肌注青霉素鉀鹽（4 000 單位/只），連續(xù)4 d，以預(yù)防感染。創(chuàng)面隔日換藥，常規(guī)沖洗及包扎。

1.4.4 紅景天苷組：造模后，即刻肌肉注射氫化可的松（80 mg/kg），連續(xù)注射7 d，紅景天苷（40 mg）溶于2 ml生理鹽水滴于單層紗布后覆蓋于創(chuàng)面。自實(shí)驗(yàn)前1 d起，肌注青霉素鉀鹽（4 000單位/只），連續(xù)4 d，以預(yù)防感染。創(chuàng)面隔日換藥，常規(guī)沖洗及包扎。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 在造模后3、7、14 d取血，每組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)取6只。使用分光光度計(jì)檢測3組分別在造模3、7、14 d后的乳酸脫氫酶（LDH）活性。分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至450 nm，蒸餾水調(diào)零。充分混勻，室溫靜置3 min，分光光度計(jì)（450 nm）下測定吸光度。

1.5.2 HE染色觀察第14天創(chuàng)面肉芽組織生長情況，400倍倒置光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面新生毛細(xì)血管分布情況。

1.5.3 CD31免疫組織化學(xué)染色觀察第14天CD31表達(dá)及微血管計(jì)數(shù)。CD31陽性染色為棕黃色，在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，凡被免疫組化染色成棕黃色的圓形、橢圓形定義為一個(gè)微血管。每張標(biāo)本首先在低倍鏡下尋找血管高密度集中的區(qū)域作為“熱點(diǎn)”，然后在高倍鏡下選取3個(gè)視野，用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件（Image-pro Plus6.0）計(jì)算平均微血管數(shù)目。

1.5.4 于造模后第7、14、21、28 d，將大鼠麻醉后觀察創(chuàng)面愈合情況。將創(chuàng)面未愈部分在透明膠上按1：1的比例描線，測定創(chuàng)面面積并記錄，計(jì)算各時(shí)間段的創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，假定方差齊性選擇“LSD-t 檢驗(yàn)”，未假定方差齊性選擇“Tamhane’s T2”，P<0.05 則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 比較三組在不同時(shí)間的LDH活性：造模3 d后，紅景天苷組的LDH活性低于慢性創(chuàng)面組及一般創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模7 d后，紅景天苷組的LDH活性低于慢性創(chuàng)面組及一般創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模14 d后，紅景天苷組的LDH活性低于慢性創(chuàng)面組及一般創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 比較三組第14天創(chuàng)面肉芽組織生長情況：3組創(chuàng)面比較（見圖2），紅景天苷組可見大量新生毛細(xì)血管，肉芽組織內(nèi)大量纖維增生，細(xì)胞排列較緊密;一般創(chuàng)面組可見少許新生毛細(xì)血管，細(xì)胞及膠原散在分布;慢性創(chuàng)面組未見明顯新生毛細(xì)血管，膠原纖維很少，成纖維細(xì)胞增生不明顯。

2.3 比較三組第14天CD31表達(dá)情況和微血管密度：紅景天苷組CD31表達(dá)整體較一般創(chuàng)面組及慢性創(chuàng)面組廣泛且顯著，可見大量被染成棕黃色的顆粒，微血管密集（見圖3）。三組創(chuàng)面微血管密度值比較，經(jīng)LSD檢驗(yàn)，一般創(chuàng)面組微血管密度高于慢性創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;紅景天苷組微血管密度高于一般創(chuàng)面組、慢性創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4 比較三組不同時(shí)間的創(chuàng)面愈合情況：總結(jié)觀察結(jié)果得出，紅景天苷組創(chuàng)面愈合情況最好，皮膚邊緣纖維組織增生最少，創(chuàng)面未見明顯滲出及炎癥反應(yīng)（見圖4、表3）。

2.5 比較三組不同時(shí)間的創(chuàng)面愈合率：第7天，一般創(chuàng)面組創(chuàng)面愈合率明顯高于慢性創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），紅景天苷組與慢性創(chuàng)面組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;第14天，紅景天苷組創(chuàng)面愈合率高于慢性創(chuàng)面組，并高于一般創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），一般創(chuàng)面組與慢性創(chuàng)面組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;第21天，紅景天苷組創(chuàng)面愈合率高于慢性創(chuàng)面組，并高于一般創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），一般創(chuàng)面組與慢性創(chuàng)面組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;第28天，紅景天苷組創(chuàng)面愈合率明顯高于慢性創(chuàng)面組及一般創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），一般創(chuàng)面組高于慢性創(chuàng)面組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

3? 討論

在高海拔地區(qū)，慢性創(chuàng)面的治療是為了促進(jìn)創(chuàng)面愈合，提高生活質(zhì)量，臨床上對慢性難愈合創(chuàng)面大多數(shù)首選外科手術(shù)治療，常采用自體皮轉(zhuǎn)移、移植以及其他生物材料覆蓋以消滅創(chuàng)面，然而這些方法存在增加創(chuàng)傷、引起排異反應(yīng)等弊端[9]。近年來發(fā)現(xiàn)許多中草藥對于皮膚的創(chuàng)傷和慢性疾病造成的皮膚潰瘍具有獨(dú)特療效，中草藥中的一些有效成分對創(chuàng)面生長因子的分泌有促進(jìn)作用[10]。

紅景天苷作為祖國中草藥可以顯著促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)，機(jī)制與其促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促使血管增生，改善創(chuàng)傷部位新生肉芽組織血供有關(guān)[11]。有研究表明[12]移植紅景天苷預(yù)處理的ADSCs能夠促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合，且創(chuàng)面中CK19、CD31、α-SMA的表達(dá)均升高。本實(shí)驗(yàn)中，紅景天苷組創(chuàng)面第14、21及28天總創(chuàng)面愈合率高于慢性創(chuàng)面組及一般創(chuàng)面組，并且紅景天苷組大鼠的微血管密度較他組更高，CD31表達(dá)較他組廣泛且顯著，由此可見，在高海拔地區(qū)紅景天苷有利于促進(jìn)慢性創(chuàng)面局部血管新生，改善局部血供情況，加速創(chuàng)面愈合。金雪蓮[13]在進(jìn)行了4種缺氧情況下紅景天苷的抗缺氧作用，發(fā)現(xiàn)在常壓低氧下，紅景天苷能很好的延長大鼠生命，在高壓缺氧的情況下也有較好的效果，西寧作為高海拔地區(qū)，慢性創(chuàng)面患者長期耐受低氧環(huán)境，紅景天苷能減少細(xì)胞氧耗，治療作用更加明顯。紅景天苷可逆轉(zhuǎn)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的HUVECs損傷，其機(jī)制主要表現(xiàn)為細(xì)胞活力的上調(diào)和乳酸脫氫酶（LDH）釋放的下調(diào)。紅景天甙通過抑制氧化應(yīng)激和改善線粒體功能紊亂，通過激活A(yù)MPK/SIRT 1通路，保護(hù)HUVECs免受氧化低密度脂蛋白損傷[14-15]，張勇[16]等報(bào)道紅景天苷在適當(dāng)濃度可相應(yīng)的促進(jìn)小牛胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，也能減少內(nèi)皮細(xì)胞中NO、LDH釋放，說明紅景天苷能促進(jìn)正常內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制氧化應(yīng)激，具有舒張血管的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第3、7、14天紅景天苷組LDH較其他兩組更低，表明LDH下降可能與紅景天苷激活A(yù)MPK/SIRT 1通路，抑制氧化應(yīng)激，減輕組織損傷有關(guān)。

本項(xiàng)目研究證實(shí)紅景天苷能夠降低組織損傷，有效促進(jìn)高海拔地區(qū)創(chuàng)傷性慢性創(chuàng)面愈合，為高海拔地區(qū)慢性創(chuàng)面的治療提供了新的思路。此研究將高海拔地區(qū)慢性創(chuàng)面的治療與祖國中醫(yī)藥相結(jié)合，符合青海省獨(dú)特的地理位置及豐富的資源特點(diǎn)，為相關(guān)患者的治療提供一個(gè)新的思路及方法。

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[收稿日期]2021-01-11

本文引用格式：祁永章，陳亞莉，王滋興，等.紅景天苷在高海拔地區(qū)創(chuàng)傷性慢性創(chuàng)面愈合中的作用及其研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2022，31（3）：96-99.