胡昌泉 林覓 顏靜宛 林智敏

摘 要：鑒定水稻花青素新基因及揭示其代謝機制，用于水稻新品種選育，是創(chuàng)制功能性水稻的手段之一。為探討水稻紫色穎殼形成對花青素積累代謝途徑的作用，以從水稻秈稻轉(zhuǎn)化體組織培養(yǎng)中篩選獲得的1個紫色穎殼雜合突變體（PiX）為材料，采用Illumina HiSeqTM 6000高通量轉(zhuǎn)錄組學（RNA-Seq）技術(shù)對其自交獲得的突變型、正常型及野生型進行轉(zhuǎn)錄組測序研究。結(jié)果表明：突變型（ME）與野生型（F8）相比上調(diào)基因5108個、下調(diào)基因4288個，自交分離正常表型（PD）與野生型（F8）相比上調(diào)基因4653個、下調(diào)基因4397個，自交分離正常表型（PD）與突變型（ME）相比上調(diào)基因2078個、下調(diào)基因2829。GO功能富集分析表明水解酶活性類基因差異表達變化顯著;KEGG Pathway分析結(jié)果表明，與野生型相比，在類黃酮生物合成途徑中，突變型中與類黃酮合成相關色素基因數(shù)量多，且主要受編碼查爾酮異構(gòu)酶OsCHI影響。該研究結(jié)果可為研究水稻花色苷積累的分子機制提供參考。

關鍵詞：水稻;紫殼;花青素;轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號：S 511?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2022）02-0020-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.02.004

Transcriptome Analysis of A Rice Glume Purple Mutant

HU Chang-quan， LIN Mi， YAN Jing-wan， LIN Zhi-min*

（Institute of Biotechnology， FujianAcademy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstracts： There is a way to create functional rice by identifying new rice anthocyanin genes and revealing their metabolic mechanism for the breeding of new rice varieties. In order to explore the effect of purple glume formation on anthocyanin accumulation and metabolism pathway in rice， a purple glume hybrid mutant （PiX） was screened from the tissue culture of Indica rice transformants， and the mutant，normal and wild-type transcripts obtained through its selfing was sequenced by Illumina hiseqtm 6000 high throughput transcriptome （RNA SEQ） technology. The results showed compared with wild-type （F8）， mutant （ME） has 5108 up-regulated genes and 4288 down regulated genes，self segregation normal phenotype （PD） has 4653 up-regulated genes and 4397 down regulated genes，and self segregation normal phenotype （PD） has 2078 up-regulated genes and 2829 down regulated genes compared with mutant （ME）. The Go function enrichment analysis showed that the differential expression of hydrolase activity genes changed significantly. The KEGG pathway analysis revealed that compared with the wild-type， the mutant had more pigment genes related to flavonoid synthesis in the flavonoid biosynthesis pathway， and those genes were mainly affected by the encoding chalcone isomerase OsCHI. The results can provide a reference for studying the molecular mechanism of anthocyanin accumulation in rice.

Key words：? Rice; Purple glume; Anthocyanin; Transcriptome

水稻是世界上主要的糧食作物之一，與小麥、玉米和土豆等三大作物被全球一半的人口消費[1]?；ㄇ嗨兀╝nthocyanin）是植物重要的次級代謝產(chǎn)物之一，花色苷作為水稻重要的生物活性物質(zhì)，已成為當前功能性稻米開發(fā)研究的熱點之一。研究人員在水稻植株的不同部位發(fā)現(xiàn)花青素，特別是在水稻穎殼中也發(fā)現(xiàn)花青素，這導致了誘人的顏色[2]。Ghasemzadeh等研究發(fā)現(xiàn)水稻中可能含有大量抗氧化化合物，如花青素是其中一種，花青素主要分布在果皮為黑色（紫色）和紅色的色素水稻品種中[3]。花青素是一種水溶性植物色素，在葉子、水果、谷物和花朵上均有分布[4]?；ㄇ嗨貙χ参锞哂卸喾N生物功能，它在植物中的作用主要是在生理代謝過程中保護自由基，尤其是在植物生物或非生物脅迫下生長，花青素可以減輕細胞損傷[5]，并維持正常的光合活性[6]。此外，作為一種植物營養(yǎng)素，花青素具有很強的抗氧化和抗突變活性，對人類健康很重要[7]。許多結(jié)構(gòu)基因編碼各種酶，它們具有催化植物中花青素和原花青素（PAs）的生物合成，同時，合成的花青素被運輸?shù)揭号莺推渌胤酵ㄟ^各種修飾進行存儲[8]。結(jié)構(gòu)基因包括早期生物合成基因（EBG）和晚期生物合成基因（LBG）2個關鍵基因組[9]。其中EBG包括查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）、類黃酮-3′-羥化酶（F3′H）和類黃酮-3′-羥化酶（F3′5′H），參與黃酮醇和黃酮類化合物的生物合成;LBG包含二氫黃酮醇4-還原酶白細胞花青素還原酶花青素合成酶（ANS）、花青素還原酶（ANR）和糖基轉(zhuǎn)移酶[10]。水稻中與花青素調(diào)控相關研究主要集中于MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子[11]。水稻6號染色體上的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子OsC1克隆發(fā)現(xiàn)其與玉米關鍵花青素生物合成基因C1是同源基因，而且主要引起水稻葉鞘花青素積累[12]。OsRb是水稻中一種bHLH基因[12]。研究表明，Rd參與了水稻果皮原花青素的生物合成[13]。此外，通過EMS誘變，從秈稻中分離獲得1個水稻紫葉突變體（pl），與野生型相比，花色素苷生物合成基因OsPAL、OsCHS、OsANS和OsMYB55在pl植物中表現(xiàn)出上調(diào)[14]。本研究從水稻秈稻轉(zhuǎn)化體組織培養(yǎng)中篩選獲得1個紫色穎殼突變體（PiX），采用高通量轉(zhuǎn)錄組學（RNA-Seq）測序分析，以增加對水稻紫色穎殼形成對花青素積累代謝途徑的認識，為后續(xù)開展花青素功能的研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 ?試驗材料

以秈稻恢復系明恢86為轉(zhuǎn)化受體中獲得1份組織培養(yǎng)穎殼紫色特異表達突變體，命名為PiX。通過突變體自交和野生型種植，獲得2個分離群體：自交分離無表型的水稻幼穗（PD）;自交分離紫色穎殼表型的水稻幼穗（ME）。野生型水稻幼穗（F8）。所有水稻材料種植在福州壽山轉(zhuǎn)基因基地溫室內(nèi)，取未灌漿水稻穗穎殼用于轉(zhuǎn)錄組學分析，液氮取樣后貯存于-80℃下備用。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?植物總RNA提取 水稻穎殼通過液氮研磨后，利用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（目錄號：DP432）提取總RNA，具體操作見說明手冊。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組學分析 委托北京諾禾致源生物科技有限公司完成質(zhì)控、建庫及Illumina HiSeqTM 6000測序，每個材料設3個重復。

（1）差異基因聚類分析：將所有比較組的差異基因取并集之后作為差異基因集。試驗分為3組，對差異基因集進行聚類分析，將表達模式相近的基因聚在一起。同時，采用主流的層次聚類對基因的FPKM值進行聚類分析，對行（row）進行均一化處理（Z-score）。熱圖中表達模式相近的基因或樣本會被聚集在一起，每個方格中的顏色反映的不是基因表達值，而是表達數(shù)據(jù)的行進行均一化處理后得到的數(shù)值（一般在-2到2之間），所以熱圖中的顏色只能橫向比較（同一基因在不同樣本中的表達情況），不能縱向比較（同一樣本不同基因的表達情況）。

（2）GO注釋及KEGG富集分析：GO富集分析是通過選取最顯著的30個Term繪制散點圖進行展示，若不足30個，則繪制所有Term。橫坐標為注釋到GO Term上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為GO Term，點的大小代表注釋到GO Term上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小，并且篩選|log2FC|>1的差異基因進行GO功能注釋。KEGG富集分析是整合基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫，其通路富集以padj小于0.05作為顯著性富集的閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體PiX表型分析

試驗結(jié)果表明，突變體PiX表型主要表現(xiàn)為水稻種子穎殼為紫色，其余性狀均為正常（圖1A，圖1B），同時穗型變小，穗粒數(shù)變少，且有效種子變少（圖1D），導致產(chǎn)量減少。此外，試驗結(jié)果表明，突變體PiX種子的萌發(fā)率下降明顯;通過自交后代分析表明，該突變體為雜合型，其后代有2個表型：突變型與正常型（圖1B，圖1C）。

2.1 轉(zhuǎn)錄組學測序分析

2.1.1 差異基因聚類分析 采用主流的層次聚類對基因的FPKM值進行聚類分析，對行（row）進行均一化處理（Z-score）。若FC（flod change，差異倍數(shù)）≥2或≤-2，且FDR（false discovery rate，錯誤發(fā)現(xiàn)率）<0.01，則認為該基因在樣品部存在顯著的表達差異。繪制DEGs表達模式聚類圖，對水稻穎殼、自交分離正常顏色和野生型正常顏色3組不同葉片的差異表達基因進行對比分析。從圖2可見，3個樣本的重復樣品間的差異基因測序結(jié)果相對一致，而且3個樣品間的差異基因存在明顯不同。其中MEvsF8中上調(diào)基因5108個、下調(diào)基因4288個，PDvsF8中上調(diào)基因4653個、下調(diào)基因4397個，PDvsME中上調(diào)基因2078個、下調(diào)基因2829。

2.1.2 差異表達基因的GO通路分析 從圖3可知，水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性類基因差異變化大（PD/ME）;轉(zhuǎn)移酶活性、氧化還原酶、過氧化物酶、抗氧化劑類基因差異變化大（ME/F8）;過氧化物酶、抗氧化劑類基因差異變化大（PD/F8）。因此，水解酶活性類基因可能影響穎殼紫色形成花青素積累的主因。

2.1.3 差異表達基因的KEGG通路分析 采用clusterProfile軟件對差異基因集進行KEGG通路富集分析。由于突變體表型是穗穎殼突變?yōu)樽仙栽贙EGG通路中重點關注類黃酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）中的差異基因（圖4、圖5）。研究結(jié)果（圖4）表明，從PD/ME中分析明顯差異基因主要是：Os12g0240900（柚皮素7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）、Os10g0317900（cytochrome P450）、Os03g0819600（金黃色穎殼和節(jié)間，OsCHI）;ME/F8中分析明顯差異基因主要是：Os12g0240900（柚皮素7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶），Os10g0317900 （cytochrome P450）、Os03g0819600（金黃色穎殼和節(jié)間，OsCHI）、Os11g0116300（chalcone-flavonone isomerase）;PD/F8中分析明顯差異基因主要是：Os11g0116300（chalcone-flavonone isomerase）、Os09g0422000（transferase family protein）。因此，推測Os03g0819600可能是影響紫色穎殼的一個關鍵基因。

3 結(jié)論與討論

在水稻中，一些光誘導表達基因OsCHS1、OsCHI和OsF3′H是受調(diào)控蛋白調(diào)控與色素的沉著有關[15]。 先前研究表明OsCHS1和OsCHI[16]是同源序列，OsDFR和OsANS1[17]是水稻花青素中具功能特征的結(jié)構(gòu)基因。當前類黃酮途徑突變體研究主要集中在花和種子，例如種子顏色突變體有擬南芥、玉米、水稻及小麥[18]。在過去幾年隨著水稻基因組測序后穎殼種皮著色開始研究，其外殼包括外稃和內(nèi)稃與真雙子葉植物的萼片相對應[19]。黃金穎殼（gh2）和褐溝抑制劑（ibf）2個基因已經(jīng)在水稻穎殼和其他物種中開展相關研究[20]。研究表明OsCHI在類黃酮中的重要作用，其新陳代謝可能會影響稻殼的顏色[21]。櫻花素是一種存在于水稻中的類黃酮抗真菌植保素，主要編碼柚皮素7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（NOMT）的OsNOMT;NOMT是生產(chǎn)庫脲酸的關鍵酶[22]。此外，水稻中類黃酮特異性途徑基因的表達調(diào)控似乎獨立于玉米中的花青素途徑基因，研究通過RNA-Seq分析確定紫色果皮水稻基因型，來比較類黃酮生物合成途徑相關基因的差異表達，結(jié)果表明水稻黃酮合酶Ⅱ（CYP93G1）插入突變體缺乏tricin，將改變木質(zhì)素組成，提高生物量消化率[23]。

本研究從水稻秈稻轉(zhuǎn)化體組織培養(yǎng)中篩選獲得1個紫色穎殼雜合突變體（PiX），利用高通量測序分析表明，紫色穎殼形成對穎殼內(nèi)水解酶活性影響較大，其次主要是影響穎殼內(nèi)類黃酮生物合成的基因發(fā)生變化，主要集中在柚皮素7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、細胞色素P450、金黃色穎殼控制基因（OsCHI）、查爾酮異構(gòu)酶和一些轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，其中與PiX突變表型影響關系較大的主要是金黃色穎殼控制基因（OsCHI）。

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（責任編輯：林玲娜）