林 豪 韓 蕊 黃萍萍 徐禮斌 楊 晶 馬 雷

種植義齒具備美觀、舒適以及功能性好等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為牙列缺損患者更青睞的選擇。種植體周圍炎是種植修復(fù)常見的并發(fā)癥[1]。最近一項(xiàng)Meta分析顯示歐洲和北美等區(qū)域種植體周圍炎的發(fā)生率高達(dá)22%[2]，其發(fā)生的根本原因?yàn)榧?xì)菌在種植義齒周圍黏附、堆積[3，4]，牙齦卟啉單胞菌是種植體周圍炎的主要致病菌[5]。減少細(xì)菌在種植義齒表面的附著，是預(yù)防種植體周圍炎發(fā)生的關(guān)鍵[6]。

鈦為牙科種植體的最常用的材料，然而，鈦本身不具備抵抗細(xì)菌粘附的特性。因此，通過對(duì)鈦的表面改性，使細(xì)菌無法粘附在種植體表面，成為預(yù)防種植體周圍炎的研究熱點(diǎn)。近年來，無機(jī)納米顆粒由于其優(yōu)異的抗菌活性而受到越來越多的關(guān)注，有關(guān)銀納米粒子、二氧化硅納米粒子、氧化鋅納米粒子、鈷納米粒子等研究均較為廣泛[7-10]。納米氧化鎂作為無機(jī)納米顆粒的一種，具有制作成本低，抗菌效果優(yōu)異等優(yōu)勢(shì)[11-13]。研究證明，納米氧化鎂對(duì)革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性桿菌均有很好的抑菌作用[14，15]。

物體表面制備納米氧化鎂的方法有多種，現(xiàn)階段最常用的包括化學(xué)沉積法，溶膠-凝膠法以及磁控濺射等方法。其中，化學(xué)沉積法存在以下缺點(diǎn)：1.薄膜厚度難以控制；2.反應(yīng)不夠徹底，溶液易造成環(huán)境污染。溶膠-凝膠法的操作及裝置較為簡(jiǎn)單，但這一方法的主要缺陷是：樣本在制作過程中，極易發(fā)生團(tuán)聚，影響樣本的質(zhì)量[16]。而磁控濺射有著操作簡(jiǎn)便、結(jié)合強(qiáng)度高、無污染、薄膜生長均勻致密等優(yōu)勢(shì)[17]，可以很好的彌補(bǔ)前兩者的缺陷。因此本實(shí)驗(yàn)擬利用磁控濺射技術(shù)在純鈦表面制備不同厚度納米氧化鎂薄膜，并檢測(cè)其對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抑菌作用。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑99.99%氧化鎂靶材（中諾新材北京科技有限公司），維生素K、氯化血紅素、厭氧產(chǎn)氣包、BHI培養(yǎng)基、瓊脂粉（青島海博生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（BI，以色列），CCK-8試劑（MCE，美國），磷酸鹽緩沖溶液（大連美侖生物技術(shù)有限公司），0.25%胰蛋白酶、鏈霉素-青霉素雙抗（Solarbio，中國），MC3T3-E1 subclone 14小鼠前成骨細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 高真空磁控濺射薄膜沉積系統(tǒng)（中國科學(xué)院沈陽科學(xué)儀器股份有限公司），掃描電鏡（zeiss supra，德國），X射線能譜儀（Oxford，英國），原子力顯微鏡（Bruker，美國），X射線衍射儀（Bruker，德國），酶標(biāo)儀（BIO-TEK，美國），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Wiggens，德國），電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（ICPE-9000，日本）。

1.3 樣本制作 首先制作直徑14 mm，厚3 mm的圓形鈦片，然后將各組鈦片拋光備用。采用磁控濺射技術(shù)，以純度＞99.99%的氧化鎂為靶材，以圓形鈦片為底材，將各組鈦片放入真空反應(yīng)室，通入氬氣，氣壓3.5 Pa，恒溫20℃，真空度為6.0×10-5，沉積速率為1.37 nm/min。MgO-Ⅰ組沉積73 min，約100 nm厚度；MgO-Ⅱ組沉積146 min，約200 nm厚；MgO-Ⅲ組沉積218 min，約300 nm厚；拋光后不進(jìn)行磁控濺射沉積的記為Ti組。

1.4 表面特征 使用掃描電鏡（SEM）觀察各組樣本表面形貌。通過X射線能譜（EDS）分析各組樣本表面元素。使用原子力顯微鏡（AFM）對(duì)各組樣本表面粗糙度進(jìn)行分析。通過X射線衍射（XRD）對(duì)各組表面進(jìn)行物相分析。

1.5 親水性測(cè)定 使用接觸角測(cè)量儀分別測(cè)量各組樣本三次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。接觸角的大小與親水性成反比。

1.6 鎂離子釋放 樣本在37℃的10 ml PBS中浸泡1、3、5、7、14天。同一時(shí)間點(diǎn)收集上清液，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀檢測(cè)鎂離子的釋放量。

1.7 體外抗菌檢測(cè)

1.7.1 細(xì)菌培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)選用牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，-ATCC 33277）進(jìn)行抗菌性檢測(cè)，在添加了維生素K和氯化血紅素的BHI培養(yǎng)基上進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。

1.7.2 菌落計(jì)數(shù) 各組鈦片使用75%的酒精浸泡2 h，PBS沖洗，放入24孔板中，于各鈦片表面接種60 ul濃度為107CFU/ml的牙齦卟啉單胞菌菌液，培養(yǎng)24 h，PBS沖洗掉未黏附的細(xì)菌，將鈦片轉(zhuǎn)移到盛有4 ml PBS的離心管中，充分震蕩1 min，取400 ul上述液體，加入3.6 ml的PBS中，再稀釋10倍和100倍，涂布于固體培養(yǎng)基上，待細(xì)菌生長1 d，篩選合適的稀釋倍數(shù)，進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)。

1.7.3 細(xì)菌形態(tài) 各組鈦片使用75%的酒精浸泡2 h，PBS沖洗，放入24孔板中，于各鈦片表面接種60 ul濃度為107CFU/ml的牙齦卟啉單胞菌菌液，培養(yǎng)24 h，2.5%的戊二醛固定2 h，PBS沖洗，不同濃度梯度的乙醇(30%、50%、75%、90%、95%、100%)依次脫水，掃描電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.8 細(xì)胞毒性 采用MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。將四組樣本使用75%的酒精浸泡2 h，PBS沖洗，放入24孔板中，每孔接種4×104個(gè)MC3T3-E1細(xì)胞，放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，每個(gè)鈦片表面加入500 ul的培養(yǎng)基和50 ul的CCK-8試劑，避光培養(yǎng)2 h，然后吸出上述孔內(nèi)的液體至96孔板中，100 ul/孔，3孔/組。使用酶標(biāo)儀于波長450 nm下測(cè)量各組OD值。然后重復(fù)上述步驟測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h后的OD值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析使用Graph Pad Prism軟件，采用單因素方差分析評(píng)定差異P的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 表面特征

2.1.1 磁控濺射原理 采用磁控濺射技術(shù)，在鈦片上制備納米氧化鎂薄膜。在真空環(huán)境中，氧化鎂靶材被轟擊后生成納米氧化鎂顆粒，納米氧化鎂顆粒不斷沉積在鈦片上，最終形成連續(xù)的薄膜（圖1）。

圖1 磁控濺射工作原理

2.1.2 掃描電鏡Ti組樣本表面僅可見少量劃痕，未見雜質(zhì)存在。MgO-Ⅰ表面明顯可見有薄膜覆蓋，局部薄膜出現(xiàn)裂痕，薄膜分布較均勻。MgO-Ⅱ組樣本表面薄膜無裂痕出現(xiàn)，局部可見一些氧化鎂的靶材顆粒沉積。MgO-Ⅲ組樣本表面薄膜也是清晰可見，值得一提的是，和前三組相比，MgO-Ⅲ組的樣本表面沉積了更多的氧化鎂顆粒（圖2）。

圖2 各組SEM觀察圖像

2.1.3 X射線能譜分析EDS元素含量結(jié)果分析顯示，除Ti組外，MgO-Ⅰ組、MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組表面均可檢測(cè)出鎂元素和氧元素（圖3）。

圖3 X射線能譜分析結(jié)果

2.1.4 X射線衍射Ti組和MgO-Ⅰ組僅見Ti的衍射峰，MgO-Ⅱ和MgO-Ⅲ組表面除Ti的衍射峰外，MgO的衍射峰也開始出現(xiàn)，并且部分Ti的衍射峰消失（圖4）。

圖4 各組X射線衍射結(jié)果

2.1.5 粗糙度Ti組，MgO-Ⅰ組，MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組的RA分別為（39.07±2.8 nm）、（49.93±3.89 nm）、（70.4±4.73 nm）、（78.23±3.84 nm），表明隨納米氧化鎂薄膜厚度的增加，樣本表面的粗糙度也在增加。與Ti組相比，實(shí)驗(yàn)組的粗糙度顯著增加(P＜0.05)。與MgO-Ⅰ組相比，MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組兩者的粗糙度也有顯著增加（P＜0.001）。MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組兩者相比，樣本表面粗糙度無差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 各組原子力顯微鏡圖像及粗糙度

2.1.6 親水性Ti組表面的水接觸角最大，為（56.82±2.66）。MgO-Ⅰ組和MgO-Ⅱ組表面的水接觸角有所減小，分別是（37.83±0.59）和（36.42±0.67），而MgO-Ⅲ組表面的水接觸角最小，是（28.44±1.48）。Ti組與實(shí)驗(yàn)組相比，水接觸角明顯增大（P＜0.05），表明Ti組的親水性最差。MgO-Ⅰ組和MgO-Ⅱ組之間的水接觸角變化不明顯（P＞0.05）。MgO-Ⅲ組與其余三組相比，其表面的水接觸角最?。≒＜0.05），表明MgO-Ⅲ組的親水性都要好（圖6）。

圖6 各樣本表面水接觸角代表性圖像及接觸角數(shù)值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.1.7 鎂離子釋放MgO-Ⅰ組、MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組表面的鎂離子在第一天都獲得了爆發(fā)性釋放，各組初期的釋放速度較快，隨著時(shí)間的推移，釋放速度逐漸減慢。第三天，MgO-Ⅰ組鎂離子釋放開始減少，基本消失不見。MgO-Ⅱ組鎂離子的釋放持續(xù)到第5 d才開始變得緩慢，后續(xù)仍有少量鎂離子釋放。MgO-Ⅲ組鎂離子一直持續(xù)釋放，在7-14 d，仍可檢測(cè)到鎂離子的釋放（圖7）。

圖7 MgO?I、MgO?Ⅱ、MgO?Ⅲ鎂離子釋放曲線

2.2 體外抗菌活性

2.2.1 菌落計(jì)數(shù)Ti組表面的牙齦卟啉單胞菌可以正常生長，而其余覆蓋納米氧化鎂薄膜的三組，樣本表面牙齦卟啉單胞菌的生長均受到抑制，并且隨著薄膜厚度的增加，菌落數(shù)也逐漸減少。MgO-Ⅰ組對(duì)牙齦卟啉單胞菌的平均抑菌率達(dá)78.14%，MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組的平均抑菌率更高，分別為87.16%和99.86%。各組之間的平均抑菌率，存在明顯差異（P＜0.001）（圖8）。

圖8 各組對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果及抗菌率

2.2.2 細(xì)菌形態(tài)Ti表面，細(xì)菌形態(tài)完整，細(xì)菌生長良好，MgO-Ⅰ組表面出現(xiàn)破裂的細(xì)菌，兩者之間的數(shù)量無明顯差異。MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組表面的細(xì)菌數(shù)量明顯減少，且大部分細(xì)菌出現(xiàn)破裂，無完整結(jié)構(gòu)（圖9）。

圖9 各組掃描電鏡下的細(xì)菌形態(tài)

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 使用MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)，分別測(cè)試24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞存活率，各組細(xì)胞存活率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），表明三種厚度的納米氧化鎂薄膜均無細(xì)胞毒性（圖10）。

圖10 各組樣本表面培養(yǎng)MC3T3?E1細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性

3.討論

隨著種植義齒的廣泛應(yīng)用，種植體周圍炎的發(fā)病率也逐漸增加[18，19]。為了減少種植體周圍炎的發(fā)生，人們不斷進(jìn)行著探索和研究，其中表面改性是一大熱點(diǎn)。現(xiàn)有的抗菌涂層，都或多或少的存在各種缺陷，例如，抗菌肽(AMPs)的穩(wěn)定性差[20]，銀等金屬離子存在細(xì)胞毒性[21]，TiO2需要光照發(fā)揮抗菌效果等。因此，人們一直致力于開發(fā)一種簡(jiǎn)便、安全、有效的涂層。

納米氧化鎂具有制作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、抗菌效果優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)，研究證明其對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有一個(gè)良好的抗菌活性[22，23]。因此，納米氧化鎂涂層可解決當(dāng)前涂層存在的多種弊端。作為物理氣相沉積的一種方式，磁控濺射操作簡(jiǎn)便，薄膜與底材的結(jié)合強(qiáng)度高，無污染，所生成的薄膜致密[17]?；谏鲜隹紤]，本研究選用磁控濺射技術(shù)，制備了不同厚度的納米氧化鎂薄膜，探索其對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果。種植體表面改性涂層的結(jié)合強(qiáng)度對(duì)于涂層發(fā)揮長期的生物學(xué)作用具有重要影響。但遺憾的是，目前并沒有較為可靠準(zhǔn)確的方法來測(cè)量涂層與鈦表面的結(jié)合強(qiáng)度。先前研究表明，通過磁控濺射法在鈦的表面上形成的羥基磷灰石涂層的拉伸粘結(jié)強(qiáng)度可達(dá)80MPa[24]。趙玉濤等人借助磁控濺射技術(shù)在鈦表面制備了HA/YSZ（釔穩(wěn)定氧化鋯，Yt-tria stabilized zirconia）生物梯度涂層，通過檢測(cè)得出鈦與該涂層之間結(jié)合強(qiáng)度可達(dá)60 MPa[25]。因此，我們認(rèn)為通過磁控濺射在鈦表面形成的涂層是穩(wěn)定可靠的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，厚度約100 nm的薄膜已具備良好抑菌效果且隨薄膜厚度的增加，其抗菌效果也會(huì)增強(qiáng)，當(dāng)薄膜厚度達(dá)到約300 nm時(shí)，牙齦卟啉單胞菌基本無法在其表面存活。由此可見，通過控制納米氧化鎂薄膜的厚度，可獲得理想的抗菌效果。此外，觀察掃描電鏡下的細(xì)菌形態(tài)顯示，除Ti外，另外三組均出現(xiàn)破碎的細(xì)菌，并且MgO-Ⅱ組和MgO-Ⅲ組表面的細(xì)菌數(shù)量明顯減少。由此可得出結(jié)論，納米氧化鎂薄膜不僅可以抑制牙齦卟啉單胞菌的生長，還可破壞細(xì)菌的結(jié)構(gòu)。

目前納米氧化鎂的抗菌機(jī)制尚未明確，大部分研究人員認(rèn)為納米氧化鎂的抗菌機(jī)制與活性氧（reactive oxygen species，ROS）損傷有關(guān)。溶液中存在的O2在納米氧化鎂的催化作用下發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)生的超氧陰離子自由基O2-可以破壞細(xì)胞膜壁，從而殺死細(xì)菌[26]。Hewitt提出納米氧化鎂催化O2發(fā)生催化反應(yīng)，依靠的是其表面存在的氧空位，進(jìn)一步導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和ROS的產(chǎn)生[27]。此外，納米氧化鎂與水反應(yīng)生成Mg(OH)2，形成的堿性環(huán)境可以為O2-提供更加穩(wěn)定的一個(gè)環(huán)境，提高殺菌效果[28]。

然而，Leung[29]制作了三組不同的納米氧化鎂，發(fā)現(xiàn)三組納米氧化鎂對(duì)大腸桿菌均有良好的抗菌效果，但只有一組納米氧化鎂可以檢測(cè)出ROS，因此提出納米氧化鎂可能通過與細(xì)菌接觸，改變細(xì)胞膜周圍PH值，或者釋放Mg2+，來破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，以達(dá)到抗菌效果。此外，Yamamoto[30]等也通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米氧化鎂除引起氧化損傷外，也可吸附到細(xì)菌表面，破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)。納米氧化鎂的尺寸小，比表面積大，可以更好的與細(xì)菌相接觸。綜上所述，關(guān)于納米氧化鎂的抗菌機(jī)制，仍存在爭(zhēng)議，還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果存在差異，也與納米氧化鎂薄膜表面親水性較強(qiáng)有關(guān)。因?yàn)槭杷诩?xì)菌在物體表面黏附[31]，其可能由于蛋白質(zhì)的吸附作用及細(xì)菌與疏水表面的相互作用。同時(shí)，Yang等人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，比起疏水表面，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更易黏附于親水的表面[32]。這對(duì)于種植義齒修復(fù)的臨床治療，是非常有利的。

樣本的粗糙度也是本次實(shí)驗(yàn)需要關(guān)注的一項(xiàng)物理特征，因?yàn)榇植诙群图?xì)菌黏附也有密切的關(guān)系。研究表明，粗糙物體的表面比光滑物體更容易引起細(xì)菌的黏附[33]。為進(jìn)一步研究粗糙度對(duì)細(xì)菌黏附的影響，Bollen CML制作了普通機(jī)械加工處理的鈦的基臺(tái)和高度拋光的陶瓷基臺(tái)，并通過比較兩者表面的口腔多種微生物的黏附數(shù)量，提出了一個(gè)影響細(xì)菌黏附的粗糙度的精準(zhǔn)閾值，當(dāng)粗糙度大于200 nm時(shí)，會(huì)使細(xì)菌黏附增加[34]。本研究中，實(shí)驗(yàn)組因?yàn)楸砻婕{米氧化鎂顆粒的存在，粗糙度比起對(duì)照組均有所增加，但各組的Ra值都遠(yuǎn)低于200 nm，所以納米氧化鎂顆粒導(dǎo)致的粗糙度增加并不會(huì)影響細(xì)菌的黏附。

4.結(jié)論

在本研究中，通過在鈦表面制備不同厚度的納米氧化鎂薄膜，有效地抑制了牙齦卟啉單胞菌的生長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米氧化鎂有望用于種植義齒表面，預(yù)防種植體周圍炎的發(fā)生。本研究尚存在不足之處：⑴關(guān)于納米氧化鎂對(duì)牙齦卟啉單胞菌的確切抗菌機(jī)制還有待進(jìn)一步探究；⑵納米氧化鎂薄膜對(duì)鈦的機(jī)械強(qiáng)度的是否會(huì)有影響，以及材料在口腔內(nèi)長期存在后薄膜的結(jié)合強(qiáng)度是否會(huì)改變?nèi)杂写谶M(jìn)一步研究。我們相信，隨著材料的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，納米氧化鎂有望成為各領(lǐng)域中常用的抗菌材料。