姚潔,鮑立寧，姜宇,朱曙光,

(1.安徽建筑大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.安徽建筑大學(xué) 水污染控制與廢水資源化安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601；3.安徽建筑大學(xué) 安徽省綠色建筑先進(jìn)技術(shù)研究院，安徽 合肥 230601；)

重金屬污染日益嚴(yán)重，直接或間接地影響了生態(tài)系統(tǒng)和人類的生命健康。重金屬在土壤中的隱蔽性、潛伏性、長期性等特點(diǎn)，使其成為環(huán)境污染防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。生物修復(fù)技術(shù)作為新時(shí)期科技發(fā)展的產(chǎn)物，利用植物、微生物的生命代謝活動(dòng)來減少環(huán)境中的有害物質(zhì)濃度，使被污染的環(huán)境能夠部分或完全恢復(fù)初始狀態(tài)[1]。目前生物修復(fù)技術(shù)主要包括植物修復(fù)、微生物修復(fù)和植物-微生物聯(lián)合修復(fù)三個(gè)方面。植物修復(fù)是利用超積累植物對土壤中的重金屬進(jìn)行提取、吸收、轉(zhuǎn)化和固定等，在修復(fù)的同時(shí)改善生態(tài)環(huán)境[2]。微生物修復(fù)是通過細(xì)菌、真菌、藻類等微生物對土壤中的重金屬進(jìn)行吸附與轉(zhuǎn)化[3]。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)是在單一植物修復(fù)基礎(chǔ)上，將與植物共生或非共生微生物聯(lián)合起來，形成聯(lián)合修復(fù)體對受重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)，從而減輕土壤的重金屬污染[4-5]。植物-微生物聯(lián)合修復(fù)是目前生物修復(fù)重金屬污染土壤的一種有效方法。張勝爽[6]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑麥草與擬青霉菌、嗜麥芽窄食單胞菌聯(lián)合作用，可以修復(fù)被重金屬污染的耕地土壤,黑麥草對鉛的富集主要集中在根部,種植接種菌株的黑麥草可達(dá)到修復(fù)土壤污染的目的。江春玉等[7]從土壤樣品中篩選出一株鉛鎘抗性細(xì)菌，接種該菌株能使印度芥菜和油菜的生物量及植株內(nèi)的鉛鎘總含量均顯著增加。通過接種重金屬抗性菌株，增強(qiáng)了不同植物對重金屬的富集作用，證明了植物與重金屬抗性菌株聯(lián)合作用可以降低土壤中重金屬的含量，減少土壤重金屬污染。

選取袖珍椰子和鳳尾蕨兩種景觀植物分別與寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonaspavanii)協(xié)同修復(fù)重金屬鉛污染的土壤，研究袖珍椰子和鳳尾蕨兩種植物的株高、葉綠素、重金屬鉛含量和酶活。根據(jù)結(jié)果分析植物—耐鉛微生物聯(lián)合修復(fù)對土壤中鉛去除效果的影響，試圖進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)植物在聯(lián)合修復(fù)體系中所起的作用，為今后研究植物—微生物聯(lián)合修復(fù)土壤重金屬污染提供技術(shù)支撐與積累。

1 材料與方法

1.1 供試細(xì)菌、植物及土壤

試驗(yàn)菌株篩選樣品采自某工廠處理水的剩余污泥，從污泥樣品中用含鉛培養(yǎng)基篩選出多株微生物菌株，經(jīng)篩選鑒定后最終選出一株抗性最好的菌株，為寡養(yǎng)單胞菌屬，文中該菌株用W表示[8]。

供試植物選取袖珍椰子(ChamaedoreaelegansMart)和鳳尾蕨(PteriscreticaL.var.nervosa)，均購自合肥花鳥市場。試驗(yàn)土壤為安徽建筑大學(xué)南校區(qū)綠化土壤，土壤基本理化參數(shù)為：pH值為7.32，有機(jī)質(zhì)含量為6.43 %，總氮濃度為405.41 mg/kg，速效磷濃度為10.33 mg/kg、速效鉀濃度為26.67 mg/kg，重金屬鉛濃度為0.113 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取Pb(NO3)2溶于蒸餾水，制備Pb2+濃度分別為0、200、400、800、1 500、2 000 mg/L的溶液。在30 d內(nèi)分別用500 mL不同濃度的Pb溶液每3 d澆灌一次試驗(yàn)土壤，各濃度土壤充分混合后老化30 d。盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用同上6種濃度梯度的Pb溶液，將長勢一致的袖珍椰子和鳳尾蕨分別栽種至不同Pb濃度的花盆中，每一濃度均設(shè)置平行樣。每種植物在不同濃度下的試驗(yàn)均設(shè)計(jì)不接種菌株的空白對照組和接種W菌株的試驗(yàn)組，接種菌株采用接觸生長法，將制備好的相同濃度的菌液投加到相應(yīng)的不同鉛濃度花盆的植物根系附近[9]，每隔7 d用Hoagland營養(yǎng)液澆灌一次，待植物生長60 d后，取其進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.3 植物生理指標(biāo)、鉛含量及酶活的測定試驗(yàn)

1.3.1 植物生物量測定

待植物生長60 d后，將其從不同Pb2+濃度的盆中連根挖出。在離子水將植物洗滌干凈后，用吸水紙將水分充分吸干，量出袖珍椰子和鳳尾蕨在不同濃度下的株高，判斷其生長情況。

1.3.2 植物葉綠素測定

剪取植物葉片中間部分，稱0.25 g葉片，加蒸餾水研磨。吸取研磨勻漿加蒸餾水至體積為5 mL。吸取1 mL樣品，加丙酮4 mL，離心機(jī)離心(6 000 r/min，10 min)，取上清液。以80%丙酮作為空白對照，分別測OD663和OD645，按下列公式計(jì)算植物葉片中葉綠素含量[10]：

Ca=12.72×OD663-2.59×OD645，

Cb=22.88×OD645-4.67×OD663，

C總=Ca+Cb=8.05×OD663+20.29×OD645,

其中:Ca為葉綠素a的含量;Cb為葉綠素b的含量;C總為葉綠素的總含量。

1.3.3 植物鉛含量測定

植物體內(nèi)Pb2+含量的測定采用硝酸-高氯酸消解法，將植物樣品在160 ℃下用密閉的聚四氟乙烯罐消煮至澄清。消煮后的溶液用稀硝酸洗至容量瓶中并用蒸餾水定容至100 mL，樣品液經(jīng)稀釋過濾后用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Optima 8 000，Perkinlimer)測定Pb2+濃度[11]。

1.3.4 植物酶活測定

植物過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法進(jìn)行測定[12]，過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法[12]進(jìn)行測定，植物超氧化物歧化酶(SOD)采用氯化硝基四氮唑藍(lán)光化還原法[12]進(jìn)行測定，對各指標(biāo)進(jìn)行三次測定后取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同Pb2+濃度處理下接種W菌株對植物株高的影響

土壤中重金屬鉛污染脅迫對植物的影響最直觀地表現(xiàn)在植物生長指標(biāo)上。在不同鉛濃度脅迫下分別測定袖珍椰子和鳳尾蕨的株高，結(jié)果如圖1所示。

(a)袖珍椰子株高

60 d生長周期后，在低鉛濃度(0～400 mg/L)時(shí)袖珍椰子和鳳尾蕨的株高均有所增加，而在Pb2+濃度超過400 mg/L時(shí)其株高逐漸減少。袖珍椰子和鳳尾蕨對鉛具有一定的耐受性，但超過一定程度，會(huì)抑制植物的生長。當(dāng)土壤中鉛濃度較高時(shí)，植物根系吸收土壤中的鉛，Pb2+以沉淀和絡(luò)合物形式存在，當(dāng)植物體內(nèi)的Pb2+到達(dá)臨界狀態(tài)后，高濃度鉛會(huì)對植物產(chǎn)生一定的毒害作用，進(jìn)而抑制了植物生長。

與空白對照組相比，接種W菌株提高了兩種植物的株高，對植物的生長具有一定的促進(jìn)作用。在0～800 mg/L的Pb2+濃度下，袖珍椰子的株高明顯高于對照組，在Pb2+濃度為200～400 mg/L時(shí)，株高分別增加了3.31%、2.77%。鳳尾蕨接W菌后在Pb2+濃度為0～200 mg/L時(shí)其株高分別增加了3.32%、2.53%，由此可以得出，在Pb2+脅迫作用下，接種W菌株的袖珍椰子和鳳尾蕨的生長指標(biāo)受到重金屬鉛的毒害作用會(huì)降低，但接種W菌株促進(jìn)植物生長的最優(yōu)條件不同，接菌對袖珍椰子的促進(jìn)作用較鳳尾蕨更明顯。

2.2 不同Pb2+濃度處理下接種W菌株對植物葉綠素影響

植物葉綠素是反映植物吸收、轉(zhuǎn)化營養(yǎng)元素的重要指標(biāo)。植物接種W菌株后，不同鉛濃度的脅迫對植物葉綠素的影響不同。由圖2可知，隨著土壤Pb2+濃度的增加，兩種植物的葉綠素含量均先上升后下降，說明袖珍椰子和鳳尾蕨在低濃度(0～400 mg/L)范圍通過植物體內(nèi)自我保護(hù)系統(tǒng)能減少重金屬Pb毒害作用，但超過這個(gè)濃度范圍植物的自我保護(hù)系統(tǒng)就可能減弱。

(a)袖珍椰子葉綠素

接種W菌株后的袖珍椰子和鳳尾蕨在不同Pb2+濃度下，植物葉片中葉綠素含量明顯高于不接菌的對照組。接菌后，袖珍椰子在Pb2+濃度為400 mg/L時(shí),其葉片中葉綠素含量比空白組高5.91%，鳳尾蕨在Pb2+濃度為0 mg/L時(shí),其葉片中葉綠素含量比空白組高3.97 %，與鳳尾蕨相比接種W菌株對袖珍椰子的促進(jìn)作用更明顯。通過對植物葉片葉綠素含量分析得出，接種W菌株增加了袖珍椰子和鳳尾蕨葉片的葉綠素含量，有利于植物光合作用。

2.3 不同Pb2+濃度下接種W菌株對植物重金屬Pb含量的影響

將袖珍椰子和鳳尾蕨在不同Pb2+濃度下進(jìn)行脅迫處理，經(jīng)60 d的周期培養(yǎng)后，植物地上和地下部分的Pb含量如圖3、圖4所示。

(a)地上部分鉛含量

(a)地上部分鉛含量

隨著土壤中Pb2+濃度增加，袖珍椰子和鳳尾蕨地上和地下部分的Pb含量均逐漸增加，說明兩種植物對Pb有明顯的吸收。在相同Pb2+濃度脅迫下，袖珍椰子和鳳尾蕨的地下部分Pb濃度均明顯高于地上部分，說明根部是袖珍椰子和鳳尾蕨富集重金屬Pb的主要器官。植物地下部分鉛濃度較高，其原因可能是由于根部細(xì)胞對Pb的富集，不斷積聚Pb2+，進(jìn)行金屬離子的絡(luò)合和其他配位反應(yīng)，使重金屬的移動(dòng)性能降低，進(jìn)一步抑制Pb轉(zhuǎn)移至地上部分，從而緩解Pb脅迫的毒害[13]。

接種W菌株后與對照組相比，袖珍椰子和鳳尾蕨的地上部分在Pb2+濃度為2 000 mg/L時(shí)鉛含量分別增加了112.61%和12.87%，地下部分在Pb2+濃度為200 mg/L時(shí)鉛含量分別增加了108.99 %和113.01 %，說明在高鉛濃度(800～2 000 mg/L)環(huán)境下接種W菌株促進(jìn)了袖珍椰子地上部分對Pb的富集，而二者的根系均在低鉛環(huán)境(0～400 mg/L)中對鉛的吸收能力更好。與對照組相比，接種W菌株加強(qiáng)了袖珍椰子和鳳尾蕨對鉛的富集，在耐鉛微生物作用下促進(jìn)了植物對重金屬Pb的吸收，加強(qiáng)了袖珍椰子和鳳尾蕨的呼吸作用，有利于促進(jìn)植物對重金屬的富集，增強(qiáng)了植物的耐受性。

2.4 不同Pb2+濃度處理下接種W菌株對植物酶活影響

CAT酶又稱觸酶，是植物中最重要的抗氧化酶之一，能催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫發(fā)生反應(yīng)，以降低植物細(xì)胞受到過氧化氫的危害，抑制植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化[14]。從圖5明顯看出，隨著土壤中Pb2+濃度的增加，袖珍椰子和鳳尾蕨的CAT酶活性先上升后下降，其中空白對照組的袖珍椰子CAT酶活性在800 mg/L鉛濃度時(shí)酶活明顯下降。在未接種菌株的對照組中，在鉛濃度為400～2 000 mg/L時(shí)袖珍椰子CAT酶活比鳳尾蕨CAT酶活的耐鉛能力更好。

(a)袖珍椰子CAT酶活

對比空白對照和接種菌株后的植物CAT酶活，可以看出接種菌株后其酶活總體上較對照組有增加，尤其鳳尾蕨接菌后在800～2 000 mg/L CAT酶活性顯著增加。當(dāng)Pb2+濃度為200 mg/L時(shí)，袖珍椰子、鳳尾蕨的CAT酶活性均達(dá)到最大值，約為對照組的1.33 倍和1.03 倍，說明在重金屬鉛的脅迫反應(yīng)中接種菌株增強(qiáng)了植物的CAT酶活性，對植物生長有一定促進(jìn)作用。

植物在高濃度范圍出現(xiàn)CAT酶活性降低的現(xiàn)象，可能是植物在低濃度鉛(0～400 mg/L)時(shí)對Pb的耐受性較好，高濃度鉛(800～2 000 mg/L)脅迫會(huì)造成植物體內(nèi)的多種功能膜及酶系統(tǒng)受到一定程度的破壞，影響植物的正常生長。不同濃度對二者的促進(jìn)作用不同，接種W菌株后袖珍椰子在低鉛濃度時(shí)CAT酶活性較對照組明顯增加而鳳尾蕨則是在高濃度鉛時(shí)酶活增加最明顯。

POD酶是植物體內(nèi)的一種氧化還原酶，在抑制植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、清除超氧自由基和減少活性氧傷害等方面發(fā)揮著重要作用[14]。從圖6看出，隨著土壤中Pb2+濃度的增加，接W菌后的袖珍椰子和鳳尾蕨中POD酶活性先升高后下降。與對照組相比,接種W菌株增強(qiáng)了植物POD酶的活性，接菌后袖珍椰子POD酶活性在Pb2+濃度為800 mg/L時(shí)到達(dá)了酶活性的最大值，約為對照組的1.07 倍。接菌后的鳳尾蕨POD酶活性Pb2+濃度為400 mg/L時(shí)達(dá)到了酶活性的最大值，約為對照組的2.64 倍,其原因可能是高濃度(800～2 000 mg/L)Pb脅迫會(huì)使植物體內(nèi)的酶系統(tǒng)受到一定程度的破壞，影響植物的正常生長。接種W菌株后在低鉛濃度時(shí)鳳尾蕨POD酶活性的促進(jìn)作用比袖珍椰子明顯，袖珍椰子在高鉛濃度時(shí)接種菌株的促進(jìn)作用更顯著。

(a)袖珍椰子POD酶活

SOD酶是存在于植物體內(nèi)起關(guān)鍵作用的一種防御酶，能減少氧自由基，在植物細(xì)胞受氧化傷害方面起重要保護(hù)作用[14]。由圖7可知，隨著Pb2+濃度的升高，袖珍椰子和鳳尾蕨的SOD酶活性一直持續(xù)下降且下降速度較快，其原因可能是重金屬鉛脅迫對植物SOD酶活性有較強(qiáng)的抑制作用，Pb2+在植物體內(nèi)不斷累積導(dǎo)致了大量的自由基產(chǎn)生，自由基的積累水平超過了SOD的清除能力，植物的SOD酶活性受到一定影響。

(a)袖珍椰子SOD酶活

袖珍椰子接種W菌株在Pb2+濃度為400 mg/L時(shí)SOD酶活性較對照組明顯提高，約為對照組的1.53倍。而鳳尾蕨在整個(gè)鉛脅迫過程中其SOD酶活均高于對照組，鳳尾蕨在Pb2+濃度為800 mg/L時(shí)SOD酶活性約為對照組的1.09倍。接種W菌株明顯促進(jìn)了鳳尾蕨的SOD酶活性，袖珍椰子接種W菌株后其SOD酶活在Pb2+濃度為0～400 mg/L時(shí)明顯提高。

在鉛脅迫條件下，W菌株與植物聯(lián)合修復(fù)，提高了植物CAT酶、POD酶及SOD酶的活性，減輕了鉛脅迫的毒害作用，增強(qiáng)了植物對鉛的耐受性。但植物的種類和Pb2+濃度的不同，接種耐鉛微生物對植物酶活的促進(jìn)效應(yīng)也不相同。在所有植物酶活試驗(yàn)處理中，與對照組相比接種耐鉛菌株在低鉛濃度時(shí)袖珍椰子CAT、鳳尾蕨的POD酶活、袖珍椰子SOD酶活明顯增加；而在高濃度鉛環(huán)境下鳳尾蕨CAT酶活、袖珍椰子POD酶活、鳳尾蕨SOD酶活增加更明顯。

在重金屬Pb的脅迫下，耐鉛微生物與植物聯(lián)合修復(fù)重金屬鉛污染土壤，結(jié)果表明：通過耐鉛微生物和植物的協(xié)同修復(fù)機(jī)制，強(qiáng)化了微生物在植物中的作用，微生物可通過自身作用吸收Pb2+，降低了土壤中重金屬Pb的毒害程度，從而對植物生長起到促生作用，植物抵抗重金屬Pb毒害的同時(shí)也提高了微生物的抗重金屬能力，促進(jìn)了袖珍椰子和鳳尾蕨的生長[15-16]；另一方面,接種耐鉛微生物對重金屬Pb污染土壤的修復(fù)有一定的促進(jìn)作用，微生物在植物—耐鉛微生物聯(lián)合修復(fù)的過程中發(fā)揮重要作用，產(chǎn)生了有機(jī)酸，活化了土壤中的Pb2+，增強(qiáng)了植物的酶活[17];同時(shí),微生物代謝過程中會(huì)分泌物如有機(jī)酸、鐵載體、表面活性劑、螯合劑等可改變土壤中重金屬Pb的存在形態(tài)，富集土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)袖珍椰子和鳳尾蕨的生長和對重金屬Pb2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而提高了聯(lián)合修復(fù)對重金屬鉛污染土壤的修復(fù)效率[15-17]。

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究了植物—耐鉛微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬鉛污染土壤的效果，結(jié)果表明接種耐鉛微生物緩解了重金屬Pb對植物的毒害作用，利用植物的提取作用將重金屬Pb大量積累在植物根部，降低了土壤中重金屬Pb對植物的毒害程度,具體試驗(yàn)結(jié)論如下：

1)未接種耐鉛微生物的袖珍椰子和鳳尾蕨隨著土壤中Pb2+濃度的增加，其株高的變化趨勢為先增加后下降，說明高濃度鉛抑制了植物的生長。在Pb2+脅迫作用下，接種耐鉛菌株均提高了袖珍椰子和鳳尾蕨的株高，促進(jìn)了袖珍椰子和鳳尾蕨的生長，其對袖珍椰子的促進(jìn)作用更明顯。植物生長受Pb脅迫的影響降低，接種菌株后其代謝與生存改善了土壤內(nèi)部環(huán)境，有利于袖珍椰子和鳳尾蕨在鉛脅迫環(huán)境下進(jìn)行光合作用。

2)袖珍椰子和鳳尾蕨在經(jīng)歷60 d的生長周期后由于根部細(xì)胞不斷積聚Pb2+，進(jìn)行金屬離子的絡(luò)合和其他配位反應(yīng)，使Pb的移動(dòng)性能降低，抑制了Pb從植物根際轉(zhuǎn)移至地上部分，從而緩解Pb脅迫對植物的毒害。接種耐鉛微生物均促進(jìn)了袖珍椰子和鳳尾蕨對土壤中重金屬鉛的富集作用，由于微生物的代謝活動(dòng)，增加了植物對Pb的耐受能力，促進(jìn)植物的生長。

3)在鉛脅迫條件下，通過耐鉛微生物的作用增強(qiáng)了袖珍椰子和鳳尾蕨的CAT酶、POD酶及SOD酶活性，減輕了鉛脅迫對植物的毒害作用，增強(qiáng)了植物對鉛的耐受性。植物酶活性與植物的種類、鉛的脅迫程度有關(guān)，不同植物對Pb的耐受性存在差異，同種植物對不同程度Pb脅迫的反應(yīng)機(jī)制也不相同。所有植物酶活實(shí)驗(yàn)處理中，與對照組比較在低鉛濃度環(huán)境下接種耐鉛菌株對鳳尾蕨的POD酶活、袖珍椰子的CAT和SOD酶活的促進(jìn)效果明顯；而在高濃度鉛環(huán)境下接種菌株對袖珍椰子的POD酶活、鳳尾蕨CAT和SOD酶活的增加更明顯。