李 茜，卞美璐?，馬 莉，陳 曦，袁記方，陳慶云，賀桂芳，劉紅剛

（1.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；2.廣東省人乳頭瘤病毒HPV 相關(guān)疾病分子診斷工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東廣州 521000；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 病理科，北京 100730）

宮頸癌目前仍然是全球女性的第四大常見(jiàn)腫瘤[1]。 據(jù)報(bào)道[2]，我國(guó)每年約有新發(fā)病例13 萬(wàn)，約占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的1/4?，F(xiàn)已明確人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染尤其是高危型HPV 持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌的明確病因之一，其致癌作用與HPV DNA 和宿主DNA 的整合有關(guān)[3～6]。90%的單純HPV 感染者可在2年內(nèi)自然轉(zhuǎn)陰， 尤其是<30 歲女性。 從感染到宮頸癌變，一般要5～20年。

宮頸上皮的癌變過(guò)程包括許多基因和表觀基因的改變，DNA 甲基化是最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)改變，常發(fā)生于腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)域，造成該基因的轉(zhuǎn)錄失活，從而促使腫瘤的發(fā)生[7]。 本研究旨在探討宮頸癌基因甲基化檢測(cè)、高危型HPV 檢測(cè)對(duì)宮頸癌篩查的分流作用， 甲基化選取的是PAX-1 和SOX-1 基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年3月～12月間中日友好醫(yī)院宮頸病變?cè)\療中心門(mén)診就診的機(jī)會(huì)性篩查女性34例，年齡24～67 歲，平均41.5 歲；其中<35 歲人群占41.18%（14／34）。 34 例均有行陰道鏡檢查的指征， 患者同時(shí)進(jìn)行了性傳播疾?。╯exually transmitted disease，STD）十聯(lián)檢、高危型HPV17 分型檢測(cè)、甲基化檢測(cè)及組織病理學(xué)檢測(cè)。以組織病理學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)不同檢測(cè)方案的篩查效果。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 STD 十聯(lián)檢測(cè)

STD 試劑盒（hybrid bio，中國(guó)），使用專(zhuān)門(mén)的宮頸分泌物取樣器，獲取宮頸細(xì)胞學(xué)樣本，采用導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測(cè)宮頸細(xì)胞標(biāo)本中10 種STI 病原體，包括淋球菌、沙眼衣原體、微小脲原體的1、3、6、14 型、人型支原體、生殖支原體、解脲脲原體和單純皰疹病毒Ⅱ型感染。

1.2.2 高危型HPV17 分型檢測(cè)

采用聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction，PCR）+導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測(cè)宮頸細(xì)胞標(biāo)本中17 種HPV 基因型感染， 包 含HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、 HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68，HPV82、 HPV6、HPV11，共17 種亞型。

1.2.3 甲基化檢測(cè)

DNA 分離和亞硫酸氫鹽處理根據(jù)制造商的建議，用DNA 迷你試劑盒（hybrid bio，中國(guó)）從收集到的宮頸脫落細(xì)胞樣本中提取基因組DNA。使用NanoDrop One／One c （Thermoscientific，Wilmington，美國(guó)）測(cè)定DNA 濃度。 DNA 產(chǎn)量為>200ng的樣品被考慮用于進(jìn)一步的測(cè)試。 亞硫酸氫鹽處理純化基因組DNA 時(shí)， 根據(jù)制造商的建議使用DNA 甲基化試劑盒（hybrid bio，中國(guó)）。

DNA 甲基化測(cè)試?yán)肁BI7500 PCR 系統(tǒng)（Life Technologies，Thermo Fischer Scientific， 美國(guó)）擴(kuò)增taqman 為基礎(chǔ)的定量甲基化-特異性聚合酶鏈反應(yīng)（QMSP），測(cè)定SOX1 和PAX1 的甲基化水平。 我們?cè)O(shè)計(jì)了Actin Beta 基因（ACTB）作為內(nèi)參，并對(duì)每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)。 如果標(biāo)記ACTB的Ct 值≤35，則認(rèn)為樣品具有足夠的質(zhì)量。 總反應(yīng)體積25μl：包含2μl modifified 模板DNA，23μl定制TaqMan 試劑。 PCR 在以下條件進(jìn)行：95℃10min，95℃10s 45 個(gè)循環(huán)，60℃（根據(jù)引物集）20s。 如果甲基化SOX1 的Ct 值≤38.6，或者甲基化PAX1 的Ct 值≤38， 則認(rèn)為整個(gè)DNA 甲基化試驗(yàn)為陽(yáng)性。

1.3 組織病理學(xué)診斷

組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)WHO（2014）宮頸病變的分級(jí)系統(tǒng)[22]，所有樣本的組織病理學(xué)診斷均由2 名專(zhuān)業(yè)醫(yī)師獨(dú)立診斷分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0 軟件，計(jì)數(shù)資料采用率或百分比（%）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間比較采用字2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

STD 十聯(lián)檢測(cè)、甲基化檢測(cè)與高危型HPV 檢測(cè)對(duì)本組患者宮頸病變的診斷結(jié)果見(jiàn)表1。 表2示，三者聯(lián)合檢測(cè)均陽(yáng)性的患者中87.5%（7/8）為組織病理學(xué)診斷高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變 （high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）， 具有陰道鏡檢查指征的病例中有55.9%（19/34）為HSIL。

表1 3 種檢測(cè)結(jié)果與組織病理學(xué)診斷結(jié)果的比較n（%）

表2 STD 十聯(lián)檢、高危型HPV 檢測(cè)、甲基化檢測(cè)對(duì)宮頸病變篩查的分流

3 討論

3.1 宮頸病變的篩查方法

篩查宮頸癌前病變， 當(dāng)前使用最廣泛的是液基細(xì)胞學(xué)和HPV 檢測(cè)，二者均有各自的優(yōu)勢(shì)和局限性。 液基細(xì)胞學(xué)有較高的特異性但是敏感性較低，因?yàn)樗艿饺?、制片、閱片等多方面因素影響，主觀依賴性強(qiáng)，對(duì)篩查人員的要求高，培養(yǎng)周期長(zhǎng)， 且缺乏規(guī)范化的質(zhì)量控制；HPV 檢測(cè)具有較高的敏感性， 但是它不能區(qū)分一過(guò)性感染和持續(xù)性感染，在性活躍的育齡女性中，檢出率較高，絕大多數(shù)的HPV 感染在幾年內(nèi)可以自動(dòng)清除，而這種一過(guò)性感染與宮頸癌的進(jìn)展無(wú)關(guān)[23]。

高危型HPV 檢測(cè)在篩查子宮頸病變中，具有重要意義，高危型HPV（16/18 型）感染伴或不伴有細(xì)胞學(xué)異常、高危型HPV（非16/18 型）感染伴有細(xì)胞學(xué)異常、高危型HPV（非16/18 型）持續(xù)性感染伴或不伴有細(xì)胞學(xué)異常， 均是陰道鏡檢查的指征， 根據(jù)陰道鏡檢查病理結(jié)果判斷宮頸病變程度，并采取相應(yīng)的治療措施，已成為宮頸病變?cè)\斷及治療指南的一部分。

宮頸上皮的癌變過(guò)程包括許多基因和表觀基因的改變，DNA 甲基化是最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)改變，常發(fā)生于腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)域，造成該基因的轉(zhuǎn)錄失活，從而促使腫瘤的發(fā)生[7]。

3.2 PAXl 基因和SOX-1 基因

國(guó)內(nèi)外學(xué)者雖已對(duì)宮頸癌的多個(gè)基因異常甲基化進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)DNA 甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行了研究和探討。 但同一基因在不同研究中存在較大差異，且大部分研究樣本量較少。本研究中甲基化選取的是PAX-1 和SOX-1。PAX-1基因隸屬于配對(duì)盒基因家族， 定位于染色體20p11， 是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要參與生骨節(jié)的分化， 在哺乳動(dòng)物脊柱和胚胎細(xì)胞的增殖控制過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。早在2008年，有研究發(fā)現(xiàn)[9]，PAX-1 基因在宮頸癌中因啟動(dòng)子趨于甲基化而表達(dá)抑制失活， 經(jīng)去甲基化處理后基因可重新表達(dá)，PAX-1 基因甲基化改變?cè)趯m頸上皮內(nèi)瘤 變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅲ級(jí)及浸潤(rùn)性宮頸癌患者的宮頸脫落細(xì)胞中被檢測(cè)到。 PAX-1 在宮頸癌組織中的甲基化頻率非常高，且隨病情的演變呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[10～13]在浸潤(rùn)性癌的鑒別中PAX-1 基因檢測(cè)的甲基化指數(shù)特異性更佳， 而在CINⅢ以上病變的篩查中特異度亦具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

SOX-1 為性別決定區(qū)域Y1，它定位于染色體13q34 上， 具有參與胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)以及決定細(xì)胞存亡的功能[14～16]。 既往有研究表明，SOX-1 基因在肺癌[17]、肝癌[18]、卵巢癌[19]、食管癌[20]等多種惡性腫瘤中甲基化水平增高， 在宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中存在差異表達(dá)， 其在腫瘤組織中甲基化水平異常升高， 而且其甲基化程度與宮頸上皮內(nèi)瘤變分級(jí)相關(guān)。2016年的一項(xiàng)Meta 分析表明[21]SOX-1 基因甲基化在宮頸癌檢測(cè)中具有較高的敏感性， 可望成為一個(gè)潛在的宮頸癌篩查的分子標(biāo)志物。

3.3 3種檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)劣勢(shì)

由于在STD 檢測(cè)陽(yáng)性病例中再進(jìn)行HPV 分型檢測(cè)的陽(yáng)性者需要進(jìn)行陰道鏡檢測(cè)， 同時(shí)予以甲基化檢測(cè)后， 發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性病例的組織病理學(xué)分級(jí)與陰道鏡活檢后的組織病理學(xué)分級(jí)結(jié)果高度吻合，考慮可對(duì)那些HPV 高危型陽(yáng)性，且無(wú)陰道鏡活檢條件的患者進(jìn)行分流。如不便隨診患者、依從性差的患者，預(yù)測(cè)其罹患HSIL 的風(fēng)險(xiǎn)，制定治療方案，不失為一種新的臨床評(píng)估手段，有望成為一項(xiàng)未來(lái)可期的替代篩查方案。

由于STD 十聯(lián)檢測(cè)、 甲基化檢測(cè)與高危型HPV 檢測(cè)這3 類(lèi)檢測(cè)均可進(jìn)行自動(dòng)化操作，并可同時(shí)對(duì)大量的標(biāo)本進(jìn)行操作， 無(wú)需人工參與及單獨(dú)、繁瑣地檢測(cè)每份標(biāo)本，從而大大降低了工作量和人工成本。進(jìn)行三者聯(lián)合檢測(cè)，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果， 本研究中三者同時(shí)陽(yáng)性的患者中87.5%（7/8）組織病理學(xué)診斷為HSIL，但因存在漏診的可能性， 所以具有陰道鏡檢查指征的患者還是應(yīng)盡可能行陰道鏡檢查。在今后的研究中，我們將繼續(xù)擴(kuò)大檢測(cè)樣本量，以得到更佳的篩選方案。