汪玉鋒

[摘要] 目的 了解原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）在菏澤市新生兒中的發(fā)病率，并對(duì)基因突變特點(diǎn)、治療及預(yù)后進(jìn)行分析。方法 利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)2016年1月至2020年12月258 682例新生兒進(jìn)行血酰基肉堿譜檢測(cè)，對(duì)初篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L伴有多個(gè)?；鈮A下降的新生兒及母親進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜、二代測(cè)序基因檢測(cè)。結(jié)果 共確診游離肉堿缺乏癥21例，其中9例原發(fā)性肉堿缺乏癥，11例母源性肉堿缺乏癥，1例父源性肉堿缺乏癥。8例進(jìn)行基因檢測(cè)，其中7例檢測(cè)到2個(gè)等位基因（孩子5例、母親1例、父親1例）、雜合1例。SLC22A5基因共發(fā)現(xiàn)10種基因突變位點(diǎn)：c.1400C>G、c.51C>G、c.95A>G、c.865C>T、c.680G>A、c.761G>A、c.760C>T、c.952-21C>G、c.572A>G、c.1229G>A。其中c.952-21C>G、c.572A>G以及c.1229G>A，均為新發(fā)突變位點(diǎn)。結(jié)論 利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)可早期檢出原發(fā)性或母源性肉堿缺乏癥。經(jīng)左卡尼汀治療的患兒預(yù)后良好，可有效預(yù)防猝死。菏澤市新生兒原發(fā)性肉堿缺乏癥患病率約為1/28 743，與國(guó)內(nèi)已報(bào)道的發(fā)病率接近?；驒z測(cè)發(fā)現(xiàn)10種SLC22A5基因突變位點(diǎn)，其中c.1400C>G位點(diǎn)在菏澤市出現(xiàn)頻率較高，3個(gè)新發(fā)突變位點(diǎn)，新突變的位點(diǎn)豐富了SLC22A5基因的突變圖譜。

[關(guān)鍵詞] 原發(fā)性肉堿缺乏癥;串聯(lián)質(zhì)譜;SLC22A5基因;新生兒

[中圖分類號(hào)] R722.11;R363.25? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）07-0154-04

Screening analysis of neonatal primary carnitine deficiency by tandem mass spectrometry in Heze

WANG Yufeng

Neonatal Disease Screening Center，Heze Maternal and Child Health and Family Planning Service Center， Heze 274000， China

[Abstract] Objective To investigate the incidence of primary carnitine deficiency（PCD） in newborns in Heze， and to analyze the characteristics， treatment and prognosis of gene mutation. Methods The blood acylcarnitine carnitine profiles of 258 682 neonates from January 2016 to December 2020 were detected by tandem mass spectrometry， and the primary screened neonates and mothers with free carnitine （C0） less than 9 umol/L and multiple acyl carnitine decreases were subjected to tandem mass spectrometry and second-generation sequencing gene detection. Results A total of 21 cases of free carnitine deficiency were diagnosed， including 9 cases of primary carnitine deficiency， 11 cases of maternal carnitine deficiency and 1 case of paternal carnitine deficiency. Gene detection was performed in 8 cases， of which 2 alleles （5 children， 1 mother， 1 father） and 1 heterozygosity were detected in 7 cases. Ten mutation sites of SLC22A5 gene were found： c.1400C > G， c.51C > G， c.95A > G， c.865C > T， c.680G > A， c.761G > A， c.760C > T， c.952-21C > G， c.572A > G， c.1229G > A. Among them， c. 952-21C > G， c. 572A > G and c. 1229G > A were all new mutation sites. Conclusion The screening by tandem mass spectrometry combined with second-generation sequencing can detect primary or maternal carnitine deficiency in the early stage. Children treated with levocarnitine have a good prognosis， which can effectively prevent sudden death. The prevalence rate of PCD in newborns in Heze is about 1/28743， which is close to the incidence reported in China. Ten kinds of mutation sites of SLC22A5 gene were found by gene detection， among which c. 1400C > G site appeared more frequently in Heze， and there were 3 new mutation sites. The new mutation sites enriched the mutation map of SLC22A5 gene.

[Key words] Primary carnitine deficiency; Tandem mass spectrometry; SLC22A5 gene; Newborn

原發(fā)性肉堿缺乏癥（primary carnitine deficiency，PCD）是由于細(xì)胞膜肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因SLC22A5突變致脂肪酸β氧化障礙而引發(fā)的遺傳方式為常染色體隱性遺傳的疾病[1]。PCD患者細(xì)胞這一功能缺陷，細(xì)胞內(nèi)肉堿濃度隨細(xì)胞外降低而下降，長(zhǎng)鏈脂肪酸不能通過線粒體膜進(jìn)行脂肪酸β氧化，從而引起心肌、肝臟、骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)等臟器功能受損[2]。本研究利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)258 682例新生兒?；鈮A譜篩查，對(duì)初篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L通知家屬在當(dāng)?shù)夭裳獧C(jī)構(gòu)重采末梢血進(jìn)行串聯(lián)復(fù)查，復(fù)篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L伴或不伴多個(gè)酰基肉堿下降，立即召回進(jìn)一步做相關(guān)檢查，聯(lián)合二代測(cè)序技術(shù)共確診21例游離肉堿缺乏癥，菏澤市PCD發(fā)病率為1/28 743，基因發(fā)現(xiàn)了10種SLC22A5突變位點(diǎn)，以c.1400 C>G位點(diǎn)攜帶率最高，其中3種未報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

以2016年1月至2020年12月在菏澤市各縣區(qū)所設(shè)有產(chǎn)科的醫(yī)療機(jī)構(gòu)出生的258 682例活產(chǎn)新生兒為研究對(duì)象，進(jìn)行?；鈮A譜篩查前經(jīng)家長(zhǎng)同意自費(fèi)，簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集和遞送

按照《新生兒疾病篩查血片采集技術(shù)規(guī)范》要求，出生72 h后經(jīng)充分哺乳（6次以上）或7 d以內(nèi)，用一次性采血針穿刺其足跟內(nèi)或外側(cè)采集足跟血，并滴于新生兒篩查專用濾紙，使血片自然滲透至濾紙背面，采集3個(gè)直徑>8.0 mm的血斑。采集后的血斑水平懸掛，室溫下自然晾干，密封保存，放于2.0～8.0℃冰箱保存。專人到各采血機(jī)構(gòu)收集標(biāo)本，并以全程冷鏈的形式運(yùn)送至山東省菏澤市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心新生兒疾病篩查中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.3 方法

1.3.1檢測(cè)儀器? AB SCIEX API3200串聯(lián)質(zhì)譜儀，SHIMADIU LC-20AD液相泵。

1.3.2檢測(cè)試劑? 非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)試試劑盒，HPLC級(jí)純度的甲醇。

1.3.3檢測(cè)方法? 收集的樣本血斑經(jīng)打孔器取直徑3 mm圓形濾紙片，放置于96孔U型底微孔板中，每孔加入工作溶液100 μl，覆蓋微孔板。快速將微孔板放置在振蕩器上，在溫度為30℃（±5℃），振頻為650～750 r/min的條件下震蕩孵育45 min。轉(zhuǎn)移至V型底微孔板中、蓋板、上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 SLC22A5基因檢測(cè)分析? 對(duì)游離肉堿初篩陽性伴多個(gè)?；鈮A降低標(biāo)本立即召回采血復(fù)查，同時(shí)對(duì)新生兒及母親進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢查，以便排除母源性肉堿缺乏，結(jié)合基因檢測(cè)進(jìn)行診斷。經(jīng)受試者家長(zhǎng)知情同意后，受試者和父母同時(shí)采集2 ml（EDTA抗凝）遞送三方實(shí)驗(yàn)室（杭州甄元醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行遺傳代謝病panelDNA質(zhì)譜基因分析，并對(duì)有致病基因位點(diǎn)的新生兒父母進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 新生兒遺傳代謝病篩查確診情況

2016年1月至2020年12月菏澤市對(duì)258 682例新生兒進(jìn)行?；鈮A譜篩查，可疑陽性人數(shù)156例，召回151例;對(duì)初篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L通知家屬在當(dāng)?shù)夭裳獧C(jī)構(gòu)重采末梢血進(jìn)行串聯(lián)復(fù)查，復(fù)篩游離肉堿（C0）仍低于9 μmol/L伴或不伴多個(gè)?；鈮A下降，建議新生兒及母親進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢查，以便排除母源性肉堿缺乏，對(duì)高度可疑者進(jìn)一步聯(lián)合二代測(cè)序行遺傳代謝病panelDNA質(zhì)譜基因分析，共確診游離肉堿缺乏癥患者21例;其中9例原發(fā)性肉堿缺乏癥，患病率為1/28 743，11例母源性肉堿缺乏癥，1例為父源性患者。見表1。

2.2 診斷治療和隨訪

PCD是一種避免感染、饑餓及高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的治療，需用補(bǔ)充左旋肉堿治療，使血漿游離肉堿水平控制在參考范圍的中低水平[3]。原發(fā)性肉堿缺乏癥確診9例（男6例，女3例），2例未治療，7例給予左卡尼汀100～200 mg/（kg·d）， 分3次口服，1個(gè)月后復(fù)查串聯(lián)質(zhì)譜，隨著年齡增長(zhǎng)及肉堿水平穩(wěn)定，逐漸延長(zhǎng)復(fù)診時(shí)間;定期檢測(cè)串聯(lián)質(zhì)譜、血糖、肝功能、腎功能、心肌酶譜等生化指標(biāo)，生長(zhǎng)發(fā)育評(píng)估等，及時(shí)調(diào)整藥物劑量;治療中的患者末次隨訪年齡為0.2～5.4歲，治療前C0 5.68（3.60～7.85）μmol/L，治療后C0 16.29（12.73～22.98）μmol/L，使游離肉堿水平控制在參考范圍的中低水平，具體控制情況及臨床表現(xiàn)見表1。母源性游離肉堿缺乏11例，初篩游離肉堿C0 2.74（0.92～6.55）μmol/L，均未治療，未進(jìn)一步做心臟超聲及肝腎功能、心肌酶譜、血糖等相關(guān)生化檢查，電話隨訪，1例孕期伴有反復(fù)低血糖、常有疲倦感或心前區(qū)不適，其他均無明顯異常臨床表現(xiàn)。初篩陽性高度可疑PCD約17例，初篩游離肉堿C0 4.74（2.30～7.86）μmol/L，復(fù)篩游離肉堿C0 6.70（2.94～10.28）μmol/L，未做進(jìn)一步做相關(guān)檢查，未分出原發(fā)性或繼發(fā)性游離肉堿缺乏癥，電話隨訪，均未出現(xiàn)任何臨床表現(xiàn)。

2.3 基因突變分析結(jié)果

21例肉堿缺乏癥患者中，8例進(jìn)行遺傳代謝病panelDNA質(zhì)譜基因分析，5例患兒、1例母源性、1位父親均檢測(cè)到2個(gè)等位基因，1例患兒為雜合攜帶;除母源性PCD和父親PCD患者基因未做Sanger測(cè)序驗(yàn)證;其他5例患兒均行Sanger測(cè)序驗(yàn)證基因變異來源，分別來自父母，共發(fā)現(xiàn)10種SLC22A5基因突變位點(diǎn)，3種新發(fā)突變未報(bào)道。見表2、圖1。

3 討論

在我國(guó)脂肪酸氧化障礙最常見的為PCD，隨著越來越多地區(qū)開展串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于篩查中，提高了PCD的檢出率;人體內(nèi)肉堿合成主要來源于外源性食物攝入，約占體內(nèi)總量的75%，其余25%由肝臟和腎臟合成[4]。若母體體內(nèi)游離肉堿充足，則新生兒生后短期內(nèi)仍會(huì)保持充足的儲(chǔ)備，這樣會(huì)導(dǎo)致新生兒篩查出現(xiàn)假陰性;孕期母親若為長(zhǎng)期素食或孕吐嚴(yán)重不能正常進(jìn)食者，早產(chǎn)兒、低體重、營(yíng)養(yǎng)不良等因素使新生兒篩查結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽性。所以檢測(cè)新生兒及其母親體內(nèi)肉堿含量判斷原因的主要出處[5]。本中心對(duì)初篩游離肉堿（C0）低于9 μmol/L通知家屬在當(dāng)?shù)夭裳獧C(jī)構(gòu)重采末梢血進(jìn)行串聯(lián)復(fù)查，復(fù)篩游離肉堿（CO）低于9 μmol/L伴或不伴多個(gè)?；鈮A下降，建議新生兒及母親進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢查，以便排除母源性肉堿缺乏。

不同的國(guó)家和地區(qū)發(fā)病率相差較大，澳大利亞的發(fā)病率較低，約為 1/120 000[6]。我國(guó)尚無全國(guó)性患病率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，上海市統(tǒng)計(jì)發(fā)病率約為1/45 000[7]，浙江省約為1/22 384[8]，石家莊市發(fā)病率約為1/17 785[9]。此研究共確診9例原發(fā)性肉堿缺乏癥患兒，患病率為1/28 743，患病率介于兩地之間，我國(guó)患病率遠(yuǎn)高于國(guó)外，可能與種族和地域有關(guān)。

PCD屬常染色體隱性遺傳病，致病基因SLC22A5定位于染色體5q31.1，包括 10 個(gè)外顯子和 9 個(gè)內(nèi)含子，其編碼的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由557個(gè)氨基酸組成，包含 12 個(gè)跨區(qū)和一個(gè)ATP 結(jié)合區(qū)[10]。有研究表明，SLC22A5 基因突變有180余種，多為錯(cuò)義突變，無義突變以及移碼突變，剪接位點(diǎn)的突變較少，發(fā)生突變最為頻繁的是1號(hào)外顯子[11]。 很多研究人員認(rèn)為，國(guó)內(nèi)的突變主要是c.760C>T和c.1400C>G[12]。本文對(duì)8例患者行二代測(cè)序行遺傳代謝病panelDNA質(zhì)譜基因分析，共檢測(cè)出7例攜帶2個(gè)等位基因，1例為雜合變異，共檢出10種SLC22A5基因突變位點(diǎn)其中5例攜帶c.1400C>G，約占71.4%。1例攜帶c.760C>T，約占10%，和國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的熱點(diǎn)突變相比較，菏澤市熱點(diǎn)突變以c.1400C>G為主。檢測(cè)到新發(fā)突變位點(diǎn)c.952-21C>G、c.572A>G、c.1229G>A未見文獻(xiàn)報(bào)道，豐富了SLC22A5基因庫，為產(chǎn)前診斷提供更好的依據(jù)。

綜上所述，PCD的主要臨床表現(xiàn)為擴(kuò)張型心肌病、肝腫大、肌無力等，部分PCD患者終生無任何異常臨床表現(xiàn)，有些患者如果不及時(shí)醫(yī)治可能會(huì)導(dǎo)致死亡，因此最有效的治療方法是早期的診斷[13-14]。由于臨床表現(xiàn)有較強(qiáng)的異質(zhì)性、臨床癥狀不典型，容易漏診或誤診，依靠串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)血中游離肉堿的含量對(duì)PCD檢出率明顯增高，確診還需結(jié)合SLC22A5基因突變分析;并且通過新生兒篩查能檢出較多母親源性PCD甚至父源性PCD。對(duì)于PCD患者需根據(jù)監(jiān)測(cè)串聯(lián)質(zhì)譜游離肉堿水平進(jìn)行個(gè)體化治療[15]。飲食方面避免長(zhǎng)期饑餓，多食瘦肉，病情穩(wěn)定期給予左卡尼汀100～200 mg/（kg·d）， 分3次口服;患者若出現(xiàn)感染、大型手術(shù)或出現(xiàn)能量代謝危象時(shí)，建議及時(shí)靜脈輸注葡萄糖，使血糖控制在正常范圍，聯(lián)合口服或靜脈給予左卡尼汀劑量加大1倍，以免出現(xiàn)各臟器的損傷或猝死。經(jīng)左卡尼汀治療的絕大多數(shù)患兒未見明顯異常臨床表現(xiàn)，也有部分患者依從性較差，擅自停藥治療，可誘發(fā)反復(fù)低血糖、甚至能量代謝危象及猝死的嚴(yán)重后果[16-17]。多數(shù)患者通過左卡尼汀藥物口服及對(duì)癥治療，預(yù)后良好，少數(shù)患者未治療，時(shí)有易疲倦或心前區(qū)有不適。目前認(rèn)為PCD患者需要終生和規(guī)律使用左卡尼汀治療，避免病情發(fā)作[18]。菏澤市PCD檢出率為1/28 743，基因檢測(cè)菏澤市熱點(diǎn)突變以c.1400C>G為主，與國(guó)內(nèi)已報(bào)道相近，另外本中心大概將近10例新生兒干血片檢查結(jié)果高度可疑游離肉堿缺乏癥，因家屬意識(shí)不到遺傳代謝病的危害性，未進(jìn)一步做相關(guān)檢查，對(duì)新生兒遺傳代謝病應(yīng)加大宣傳（教）力度，提高群眾對(duì)遺傳代謝病的認(rèn)識(shí)，同時(shí)針對(duì)患兒家長(zhǎng)加強(qiáng)健康宣教，能夠保證遵醫(yī)囑治療，正規(guī)隨訪，PCD患兒的良好預(yù)后才能得到保證。致病基因SLC22A5位點(diǎn)不僅可以作為確診的依據(jù)，還可作為產(chǎn)前診斷的依據(jù)[19]。再次妊娠應(yīng)在孕婦妊娠12或18周以前取胎兒絨毛或羊水檢測(cè)基因位點(diǎn)，通過預(yù)測(cè)診斷決定是否為患兒，并提高存活率[20]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? ?林壹明，林衛(wèi)華，余科，等.八例PCDSLC22A5基因突變分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2017，34（1）：35-39.

[2]? ?趙正言，顧學(xué)范.新生兒遺傳代謝病篩查[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：178-181.

[3]? ?譚建強(qiáng)，陳大宇，李哲濤，等.10例PCD新生兒的基因診斷[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2017，19（11）：1150-1154.

[4]? ?劉偉，馬志軍，萬智慧，等.游離肉堿初篩陽性新生兒及其母親的復(fù)查結(jié)果分析[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2019， 27（6）：721-722，732.

[5]? ?El-Hattab AW. Systemic Primary Carnitine Deficiency [ EB/ OL].[2016-04-25]. http：/ / www. ncbi. nlm. nih. gov / books/ NBK84551？/ .

[6]? Wilcken B，Wiley V，Hammond J，et al. Screening newborns for inborn errors of metabolism by tandem mass spectrometry[J].N Engl J Med，2003，348（23）：2304-2312.

[7]? ?韓連書，葉軍，邱文娟，等.原發(fā)性肉堿缺乏癥17例診治與隨訪[J].中華兒科雜志，2012，50（6）：405-409.

[8]? ?馬平悅.50例新生兒原發(fā)性肉堿缺乏癥的基因譜及臨床特征分析[D].杭州：浙江大學(xué)，2015.

[9]? ?賈立云，封紀(jì)珍，王熙，等.石家莊地區(qū)新生兒原發(fā)性肉堿缺乏癥串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果分析[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，42（3）：309-313.

[10]? Amat di San Filippo C，Wang Y，Longo N. Functional domains in the carnitine transporter OCTN2 defective in primary carnitine deficiency[J].J Biol Chem，2003，278（48）：47 776-47 784.

[11]? LiFY，EI-Hattab AW，Bawle EV， et al. Molecular spec trum of SLC22A5（OCTN2） gene mutations detected in 143 subjects evaluated for systemic carnitine deficiency[J]. Hum Mutat，2010，31（8）：E1632-E1651.

[12]? Han L，Wang F，Wang Y，et al. Analysis of genetic muta tions in Chinese patients with systemic primary carnitine deficiency[J]. Eur J Med Genet，2014，57（10）：571-575.

[13]? 孫云，馬定遠(yuǎn)，王彥云，等.新生兒篩查發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性肉堿缺乏癥臨床與基因分析[J].臨床兒科雜志，2017，35（9）：666-668.

[14]? 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)出生缺陷預(yù)防與控制專業(yè)委員會(huì)新生兒遺傳代謝病篩查學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)出生缺陷預(yù)防與控制專業(yè)委員會(huì)，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會(huì)臨床生化遺傳專業(yè)委員會(huì)，等.PCD篩查與診治共識(shí)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2019，99（2）：88-92.