翁孝琴，薛 山，羅彬彬，陳佐明

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床心理科，河南 新鄉(xiāng) 453000;2.鄭州市第二人民醫(yī)院眼科，河南 鄭州 451100)

抑郁癥是嚴(yán)重的精神疾病，其患病率在世界范圍居高不下[1-2]，主要表現(xiàn)為情緒障礙和認(rèn)知功能障礙，尤其在重度抑郁癥患者中，認(rèn)知功能異常尤為明顯[3-4]。有研究顯示，抑郁癥患者會出現(xiàn)認(rèn)知功能紊亂，而認(rèn)知功能在一定程度上可以調(diào)節(jié)人的情緒[5-6]，因此，研究抑郁癥患者認(rèn)知功能異常的發(fā)病機(jī)制尤為重要。炎癥細(xì)胞因子的激活可降低突觸可塑性[7-8],造成認(rèn)知功能障礙,認(rèn)知功能障礙與海馬功能和結(jié)構(gòu)異常有關(guān)[9]。突觸后致密蛋白-95(post-synaptic density protein-95，PSD-95)是位于突觸后特化區(qū)內(nèi)的主要支架蛋白，在調(diào)控神經(jīng)突觸發(fā)育和可塑性中起關(guān)鍵作用，并參與學(xué)習(xí)記憶等功能的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，長期應(yīng)激可使抑郁癥大鼠海馬CA1、CA3區(qū)中的PSD-95表達(dá)水平下降[10]，提示在抑郁癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)歸過程，PSD-95作為神經(jīng)信號傳遞中重要的整合器，通過串集、整合特異受體及下游相關(guān)蛋白，影響神經(jīng)突觸可塑性。本研究通過分析舍曲林對抑郁癥大鼠認(rèn)知功能和海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量的影響及PSD-95 mRNA相對表達(dá)量與抑郁癥大鼠認(rèn)知功能之間的關(guān)系，來探討抑郁癥可能的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物成年健康雄性Sprague-Dawle大鼠64只，體質(zhì)量180～230 g，由河南省鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物機(jī)構(gòu)許可證號：SCXK(豫)2010-0002；飼養(yǎng)于河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室屏障動物房。實(shí)驗(yàn)過程中，在不影響實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上充分遵守替代、減少、優(yōu)化的原則。

1.2 試劑與儀器反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；曠場箱購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，Y迷宮(MG-2)購自安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，Smart Version 2.5.16軌跡圖像分析軟件由美國Smart Software股份有限公司提供。Eppendorf 5331梯度聚合酶鏈反應(yīng)儀購自德國艾本德股份公司，BTS-20.M型紫外凝膠成像系統(tǒng)購自英國UVItec公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物分組及干預(yù)措施大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食、飲水，光照周期為12 h，室溫(22±2)℃，相對濕度45%～60%。隨機(jī)選擇16只大鼠作為對照組，每籠4只，正常飼養(yǎng)。其余48只大鼠參照文獻(xiàn)[11]采用慢性不可預(yù)見應(yīng)激(chronic unpredictable stress，CUS)方法制備抑郁癥模型(模型組)，具體造模方法為：大鼠均單籠孤養(yǎng)，使用10種刺激方法，每日隨機(jī)給予2種，相同刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使大鼠無法預(yù)知操作，連續(xù)刺激28 d。然后根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化、曠場試驗(yàn)、蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)、Y迷宮實(shí)驗(yàn)和巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果(大鼠體質(zhì)量增長減緩、快感缺乏、認(rèn)知功能損傷)證實(shí)大鼠均造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為抑郁組、抑郁+生理鹽水組和抑郁+舍曲林組，每組16只。抑郁+舍曲林組大鼠每日灌胃舍曲林5.8 mg·kg-1，抑郁+生理鹽水組大鼠每日灌胃生理鹽水5.8 mg·kg-1，以上2組大鼠均干預(yù)4周；抑郁組大鼠不給予任何干預(yù)措施。然后3組大鼠繼續(xù)給予CUS，以避免抑郁行為退化。

1.4 大鼠行為學(xué)評估

1.4.1 曠場實(shí)驗(yàn)造模后，對照組和模型組大鼠進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。將大鼠放入黑色方形敞箱(長100 cm，寬100 cm，高40 cm)中央，記錄大鼠在中央?yún)^(qū)停留時間。從放入敞箱中央開始計時，測試時間5 min。每2次測試間期將敞箱清理干凈，不留異物和異味。全程使用Smart Version軟件記錄大鼠水平運(yùn)動距離、豎立運(yùn)動次數(shù)(兩前肢同時離地豎起記為1次)。

1.4.2 蔗糖水消耗試驗(yàn)造模后，對照組和模型組大鼠進(jìn)行蔗糖水消耗試驗(yàn)。每次測試前禁食禁水24 h 并測大鼠體質(zhì)量，然后給予大鼠10 g·L-1蔗糖水，觀察大鼠1 h的飲水量，計算每100 g體質(zhì)量大鼠飲用蔗糖水的量，蔗糖水?dāng)z入量=1 h飲用量(mL)/[動物體質(zhì)量(g)×100]。

1.4.3 Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的認(rèn)知功能造模后及舍曲林干預(yù)4周后，參照王躍春等[12]的方法對各組大鼠進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)。每輪Y迷宮實(shí)驗(yàn)分為第1天學(xué)習(xí)階段和第2天測試階段。實(shí)驗(yàn)前允許大鼠在迷宮內(nèi)自由活動，適應(yīng)環(huán)境5 min后，開始進(jìn)行隨機(jī)的變換安全區(qū)，以訓(xùn)練大鼠辨別燈光刺激及安全方位的能力。實(shí)驗(yàn)過程中調(diào)節(jié)刺激電壓為50～70 V，大鼠在起始區(qū)內(nèi)給予電刺激使其逃至安全區(qū)，燈光持續(xù)15 s，然后熄燈休息45 s，再開始下一輪操作，將大鼠受電刺激后10 s內(nèi)一次性從起始區(qū)逃至安全區(qū)的反應(yīng)稱為“正確反應(yīng)”，否則稱為“錯誤反應(yīng)”。第1天學(xué)習(xí)階段中，以達(dá)到學(xué)會為目的進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練，學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)：在10次電刺激中連續(xù)9次做出正確反應(yīng)。第2天測試，檢測大鼠的記憶能力，在連續(xù)20次的電刺激測試中記錄正確反應(yīng)次數(shù)、錯誤反應(yīng)次數(shù)和每次從信號燈亮到進(jìn)入安全區(qū)的逃避潛伏期，以1個實(shí)驗(yàn)日累計的總潛伏期反應(yīng)時間來表示大鼠信息提取速度以及綜合記憶能力。

1.4.4 巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠認(rèn)知功能造模后及舍曲林干預(yù)4周后，各組大鼠進(jìn)行巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)。巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)裝置位于地板上方140 cm處，20個孔均勻地位于表面周邊，直徑為5 cm。目標(biāo)洞是這些孔中的1個，連接到暗室允許小鼠逃離強(qiáng)光的刺激。在正式實(shí)驗(yàn)的前1 d，將動物放入目標(biāo)洞中4 min 進(jìn)行適應(yīng)。在第1天，將大鼠放置在迷宮中心的黑色立方體中5 s，大鼠在移除立方體時探索迷宮以找到目標(biāo)洞，一旦大鼠進(jìn)入目標(biāo)洞，就會在那里停留30 s，如果在3 min內(nèi)找不到目標(biāo)洞的話，它將被引導(dǎo)至目標(biāo)洞并允許停留在目標(biāo)箱中1 min。每只動物在1 d內(nèi)進(jìn)行2次試驗(yàn)，每次間隔4 h，記錄每只大鼠到達(dá)目標(biāo)盒的潛伏時間。測試共進(jìn)行4 d，每只大鼠測試前使用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇清潔裝置以避免嗅覺干擾，應(yīng)用Spain Panlab Smart 3.0軟件對進(jìn)入目標(biāo)洞中的時間和錯誤次數(shù)進(jìn)行視頻記錄和分析。

1.5 RT-PCR法檢測大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量各組大鼠認(rèn)知功能測試完成后，腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(3 mL·kg-1)對大鼠進(jìn)行全身麻醉。對照組、抑郁組、抑郁+生理鹽水組和抑郁+舍曲林組隨機(jī)取8只大鼠，斷頭處死，冰上快速剝離出海馬組織，-80 ℃儲存。TRIzol法提取各組大鼠海馬組織中總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，配制 20 μL反應(yīng)體系，于 RT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，70 ℃延伸10 s，共30個循 環(huán)。以PSD-95為模板設(shè)計引物，上游引物序列為5′-GACAGTGAGACCGACGACATT-3′，下游引物序列為5′- CCCATAGAGGTGGCTGTTGTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物396 bp。 以內(nèi)參β-actin為模板設(shè)計引物，上游引物序列為5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物序列為5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物150 bp。 使用 12 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并使用Gene Tools From SynGene 軟件對4組大鼠RT-PCR產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的基因與內(nèi)參基因的灰度值比值表示PSD-95 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 舍曲林干預(yù)前對照組與模型組大鼠體質(zhì)量、蔗糖水?dāng)z入量和運(yùn)動總距離比較結(jié)果見表1。模型組大鼠體質(zhì)量、蔗糖水?dāng)z入量、運(yùn)動總距離均顯著少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 舍曲林干預(yù)前對照組與模型組大鼠體質(zhì)量、蔗糖水?dāng)z入量和運(yùn)動總距離比較

2.2 舍曲林干預(yù)前對照組與模型組大鼠認(rèn)知功能比較結(jié)果見表2和表3。在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)少于對照組，錯誤反應(yīng)次數(shù)多于對照組，總潛伏期反應(yīng)時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 舍曲林干預(yù)前對照組與模型組大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表3 舍曲林干預(yù)前對照組與模型組大鼠進(jìn)入目標(biāo)洞時間比較

在巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠第2天、第4天進(jìn)入目標(biāo)洞時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組大鼠第1天、第3天進(jìn)入目標(biāo)洞時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 舍曲林干預(yù)后4組大鼠認(rèn)知功能比較結(jié)果見表4和表5。抑郁組、抑郁+生理鹽水組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)少于對照組，錯誤反應(yīng)次數(shù)和總潛伏期反應(yīng)時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。抑郁+舍曲林組與對照組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)、錯誤反應(yīng)次數(shù)和總潛伏期反應(yīng)時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。抑郁+舍曲林組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)多于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，錯誤反應(yīng)次數(shù)少于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，總潛伏反應(yīng)時間短于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。抑郁組與抑郁+生理鹽水組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)、錯誤反應(yīng)次數(shù)和總潛伏期反應(yīng)時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表4 舍曲林干預(yù)后4組大鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表5 舍曲林干預(yù)后4組大鼠進(jìn)入目標(biāo)洞時間比較

抑郁組、抑郁+生理鹽水組大鼠第1、2、3、4天進(jìn)入目標(biāo)洞時間均長于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。抑郁+舍曲林組與對照組大鼠第1、2、3、4天進(jìn)入目標(biāo)洞時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。抑郁+舍曲林組大鼠第1、2、3天進(jìn)入目標(biāo)洞時間少于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；抑郁+舍曲林組大鼠第4天進(jìn)入目標(biāo)洞時間與抑郁組和抑郁組+生理鹽水組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。抑郁組與抑郁+生理鹽水組大鼠第1、2、3、4天進(jìn)入目標(biāo)洞時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 4組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見圖1。對照組、抑郁組、抑郁+生理鹽水組、抑郁+舍曲林組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量分別為0.739±0.024、0.459±0.022、0.454±0.027、0.625±0.019。抑郁組、抑郁+鹽水組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。抑郁+舍曲林組與對照組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。抑郁+舍曲林組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量顯著高于抑郁組和抑郁+生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。抑郁組與抑郁+生理鹽水組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

M:marker；A：對照組；B：抑郁組；C：抑郁+生理鹽水組；D：抑郁+舍曲林組。

2.5 大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量與認(rèn)知功能相關(guān)性大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量與大鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中正確反應(yīng)次數(shù)呈顯著正相關(guān)(r=0.486,P<0.05),與錯誤反應(yīng)次數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.581,P<0.05)。

3 討論

抑郁癥是導(dǎo)致全球疾病負(fù)擔(dān)增加的五大疾病之一。全球約3.5億人患有嚴(yán)重抑郁癥，根據(jù)抑郁癥臨床表現(xiàn)可分為不同類型，但任何類型的抑郁癥均會導(dǎo)致患者認(rèn)知功能損傷，其病理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究[13]。盡管抗抑郁藥的快速發(fā)展改善了部分抑郁癥患者的癥狀，但由于該疾病病因不明確，仍有較多患者治療效果欠佳，給個人和家庭帶來很大痛苦。因此，研究抑郁癥患者的發(fā)病機(jī)制仍是目前研究熱點(diǎn)。

本研究參照ANTONIUK等[11]方法通過給予CUS制備抑郁癥模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠體質(zhì)量下降(反映其食欲下降)、蔗糖水?dāng)z入量減少(反映其對愉悅事件的興趣喪失)、曠場試驗(yàn)中運(yùn)動總距離縮短(反映其類焦慮樣狀態(tài)控制能力以及探究活躍能力降低)，說明成功制備抑郁癥模型。

關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，“神經(jīng)可塑性學(xué)說”得到學(xué)者們的公認(rèn)。因此，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑在臨床抑郁癥治療中得到廣泛使用，這類藥物主要通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取,從而提高5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量。國外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，單胺類5-羥色胺再攝取抑制劑能引起神經(jīng)可塑性的改變[14],其中舍曲林是該類藥物之一。本研究結(jié)果顯示，抑郁組大鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的錯誤反應(yīng)次數(shù)顯著多于對照組，在巴恩斯迷宮實(shí)驗(yàn)中其正確反應(yīng)次數(shù)顯著少于對照組，說明抑郁癥大鼠發(fā)生認(rèn)知功能障礙，與LI等[15]研究結(jié)果一致。為進(jìn)一步證實(shí)神經(jīng)可塑性變化，本研究給予舍曲林干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，抑郁+舍曲林組大鼠的進(jìn)入目標(biāo)洞時間少于抑郁組和抑郁組+生理鹽水組，說明抑郁癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降，而抗抑郁藥物干預(yù)能改善抑郁癥狀并提高學(xué)習(xí)記憶能力；提示在抑郁癥發(fā)病時神經(jīng)生物學(xué)的改變參與了學(xué)習(xí)記憶等的調(diào)節(jié)，而神經(jīng)可塑性在其中起重要作用，是情緒、學(xué)習(xí)記憶功能的基礎(chǔ)[16]。

有學(xué)者通過動物模型、抑郁癥患者大腦形態(tài)學(xué)和尸檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)了抑郁癥在發(fā)生和轉(zhuǎn)歸過程中大腦結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的改變特點(diǎn)，提出了神經(jīng)可塑性學(xué)說[17]。PSD-95基因沉默可影響缺血后大鼠海馬錐狀細(xì)胞的死亡,說明PSD-95對海馬神經(jīng)元錐體細(xì)胞及可塑性等產(chǎn)生了一定的影響[18]。BESSIERES 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PSD-95在調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性中具有重要作用。本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測抑郁癥大鼠經(jīng)舍曲林治療后海馬組織中PSD-95 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，抑郁組和抑郁+生理鹽水組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組，抑郁+舍曲林組大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA相對表達(dá)量顯著高于抑郁+生理鹽水組。說明長期CUS可通過影響PSD-95的轉(zhuǎn)錄水平來影響神經(jīng)可塑性，從而導(dǎo)致抑郁癥的形成，與MAYA VETENCOURT等[20]的研究結(jié)論一致。本研究進(jìn)一步對大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA表達(dá)水平與大鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中正確反應(yīng)次數(shù)及錯誤反應(yīng)次數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSD-95 mRNA相對表達(dá)量與錯誤反應(yīng)次數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，與正確反應(yīng)次數(shù)呈顯著正相關(guān)，說明PSD-95 mRNA水平與大鼠認(rèn)知功能有關(guān)。舍曲林可能是通過增加大鼠海馬組織中PSD-95 mRNA的表達(dá)，觸發(fā)一系列生物學(xué)改變，進(jìn)而發(fā)揮治療作用。但以上研究結(jié)論仍需蛋白水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行佐證。

本研究從分子生物學(xué)水平上闡明抑郁癥大鼠海馬組織中神經(jīng)突觸可塑性導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的可能神經(jīng)生理機(jī)制，為進(jìn)一步深入解釋慢性應(yīng)激引發(fā)身心疾病的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為抗抑郁癥藥物的研發(fā)提供新的藥物作用靶點(diǎn)。